吳瓊，王小中

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)及其對(duì)細(xì)胞凋亡的作用

吳瓊，王小中

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

目的研究CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在急性白血病患者外周血中的檢測(cè)，并探討其對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。方法將65例急性白血病患者(包括急性淋巴細(xì)胞性白血病33例和急性髓系白血病32例)分為未緩解組(28例)和緩解組(37例)，25例健康志愿者作為對(duì)照組。根據(jù)是否合并感染又分為合并感染組(39例)和未合并感染組(26例)。采用細(xì)胞內(nèi)染色的流式細(xì)胞術(shù)及熒光定量PCR的方法，分別在蛋白質(zhì)和mRNA水平檢測(cè)Foxp3表達(dá)，并與正常對(duì)照組進(jìn)行比較。同時(shí)，利用熒光定量PCR的方法的檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、P53的表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照相比，急性白血病患者（未緩解組和緩解組）外周血中CD4+CD25+Foxp3+比例明顯提高，且治療緩解后CD4+CD25+Foxp3+表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。凋亡相關(guān)基因Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax、P53表達(dá)下調(diào)。結(jié)論急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞明顯升高，并且，影響凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、P53的表達(dá)，提示CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能通過(guò)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路影響急性白血病的發(fā)展。

急性白血??；流式細(xì)胞術(shù)；CD4+CD25+Foxp3+；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

急性白血病是一類造血干細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病，是常見(jiàn)的血液惡性腫瘤，多種免疫機(jī)制參與白血病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在抗腫瘤免疫效應(yīng)中，細(xì)胞免疫比體液免疫起著更為重要的作用[1]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是（T regulatory cells， Treg)具有抑制自身免疫反應(yīng)、阻止損傷性免疫病理發(fā)生和維持機(jī)體免疫平衡作用的T細(xì)胞亞群，具有抑制細(xì)胞免疫，并誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸作用[2]。轉(zhuǎn)錄因子FoxP3是Treg的特異表面標(biāo)志，參與維持其發(fā)育和功能，其表達(dá)水平能更為精確地反映CD4+CD25+Treg的活性[3，4]，是Treg檢測(cè)的關(guān)鍵標(biāo)志之一[5]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的Foxp3分子，并結(jié)合PCR反應(yīng)的高度特異性和靈敏性進(jìn)行共同檢測(cè)，同時(shí)，對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、P53的mRNA采用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，旨在研究急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究CD4+CD25+Foxp3+促進(jìn)急性白血病發(fā)生發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇2014年2月-2015年12月間在江西省南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院院血液內(nèi)科住院的65例急性白血病患者，其中男34例，女31例，年齡18～55歲(38.12±13.58歲)。25例在我院體檢的健康志愿者(男15例，女10例，年齡30.21±13.31歲)作為對(duì)照組。所有病例均經(jīng)臨床、骨髓形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色及免疫分型確診。其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)33例，急性髓系白血病(AML)32例。按治療效果分類，28例未達(dá)到完全緩解，納入白血病未緩解組，37例通過(guò)規(guī)范化療已經(jīng)達(dá)到完全緩解，納入白血病緩解組。在這65例患者中，取血時(shí)出現(xiàn)合并感染(包括消化道感染、肺部感染和口腔黏膜感染等)的有39例，無(wú)明顯感染征象的26例。所有標(biāo)本取血前均征得患者本人知情同意。

1.2 主要試劑熒光標(biāo)記的抗體：PE標(biāo)記的抗人CD4、PE-Cy5標(biāo)記的抗人CD25及FITC標(biāo)記的抗人Foxp3試劑盒(含配套的固定和透膜試劑)均購(gòu)自EB ioscience公司；淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)；RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒(Takara)。

1.3 細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)染色采集外周血2ml加入EDTA抗凝管，充分混勻；準(zhǔn)備兩根流式管，標(biāo)明同型對(duì)照管和檢測(cè)管，分別用1、2表示；取外周血100μl分別加入兩管，1、2管都加入CD4-FITC/ CD25-APC各20μl，暗室室溫避光孵育20min；避光孵育后加入稀釋的溶血素和破膜劑，反應(yīng)后以破膜緩沖液洗滌并重懸，1管加入IgG-PE 5μl，2管加入Foxp3-PE 20μl，暗室室溫避光孵育20min；加入5ml PBS緩沖液洗滌，1200r/min離心5min去上清。加入400μl PBS緩沖液上機(jī)檢測(cè)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)用FSC/SSC參數(shù)先找到淋巴細(xì)胞群，找到CD4+CD25+雙陽(yáng)細(xì)胞群，IgG-PE為同型對(duì)照，使用對(duì)照管調(diào)整補(bǔ)償和電壓，使得陰性細(xì)胞群位于點(diǎn)圖的左下角，收集至少10000個(gè)細(xì)胞，以CD4+CD25+雙陽(yáng)細(xì)胞射門，分析Foxp3的百分率，在計(jì)算機(jī)上用Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù)，減去陰性對(duì)照管的非特異性對(duì)照值。

Foxp3+在CD4+中的比例分析：步驟同上，1，2管破膜之前只要加入CD4-FITC 20μl，用FSC/SSC參數(shù)先找到淋巴細(xì)胞群，找到CD4+陽(yáng)性細(xì)胞群，IgG-PE為同型對(duì)照，使用對(duì)照管調(diào)整補(bǔ)償和電壓，使得陰性細(xì)胞群位于點(diǎn)圖的左下角，收集至少10000個(gè)細(xì)胞，以CD4+陽(yáng)性細(xì)胞射門，分析Foxp3的百分率，在計(jì)算機(jī)上用Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù)，減去陰性對(duì)照管的非特異性對(duì)照值。

1.5 定量PCR的檢測(cè)

1.5.1 總RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用Trizol試劑提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，取總RNA 2μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。其中RNA的質(zhì)量通過(guò)Nanodrop儀進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。

1.5.2 熒光定量PCR檢測(cè)Foxp3 mRNA表達(dá)取上述cDNA，采用Takara公司SYBR Green Taq試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，總體積為10μl，按試劑說(shuō)明書(shū)操作。Foxp3的表達(dá)水平以其與內(nèi)參β-actin的比值表示。所用定量PCR儀型號(hào)為羅氏Lightcycler。引物由上海生工合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR程序設(shè)定：預(yù)變性95°C 3min，變性95°C 30s，退火56°C 30s，延伸72°C 30s，35個(gè)循環(huán)，4°C保存。

1.6 統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組及組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照相比，急性白血病患者（未緩解組和緩解組）外周血中CD4+CD25+Foxp3+比例明顯提高，且治療緩解后CD4+CD25+Foxp3+表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）（見(jiàn)圖1和表2）。進(jìn)一步用熒光定量PCR方法檢測(cè)Treg表面Foxp3基因的mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致，見(jiàn)圖2。這一結(jié)果提示CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)與急性白血病有一定相關(guān)性，并且可能與急性白血病的治療緩解相關(guān)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)急性白血病患者外周血Foxp3的表達(dá)

圖2 熒光定量PCR檢測(cè)急性白血病患者外周血中Foxp3 mRNA表達(dá)

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例(%)

2.2 合并感染組和未合并感染組患者CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的的表達(dá)比例在上述基礎(chǔ)之上，根據(jù)是否合并其它感染，將65例急性白血病樣本分合并感染組和未合并感染組。流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)記檢測(cè)合并感染組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例為4.63±0.49%，未合并感染組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例為4.36±0.56%，兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表3。

表3 合并感染組和未合并感染組患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例(%)

2.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl2、Bax、P53 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)Treg在細(xì)胞凋亡中起著非常重要的作用[6]，為此，我們通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)了凋亡通路中的重要基因Bcl2、Bax、P53的表達(dá)，結(jié)果顯示，在急性白血病患者（緩解組及未緩解組）中Bcl2表達(dá)上調(diào)、Bax及P53表達(dá)下調(diào)（見(jiàn)圖3）。

圖3 熒光定量PCR檢測(cè)急性白血病患者及健康對(duì)照組外周血中Bcl2、Bax、P53基因mRNA表達(dá)

3 討論

急性白血病是造血干細(xì)胞異常分化的克隆性惡性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。Tregs是一種專職抑制細(xì)胞，具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)作用，人類主要由胸腺體天然產(chǎn)生Tregs，占人外周CD4+T細(xì)胞總數(shù)的5%～10%[7]，其表面表達(dá)有CD25、CTLA-4、GITR和Foxp3等分子。其主要功能是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、抑制機(jī)體對(duì)同種異體移植物的排斥反應(yīng)以及影響其他T細(xì)胞的功能等[8]。目前有關(guān)CD4+CD25+與腫瘤的關(guān)系有了大量研究，在胃癌、乳腺癌、肝癌等實(shí)體腫瘤患者的外周血和腫瘤局部，CD4+CD25+Treg的數(shù)量都比正常人明顯增高，并且，其數(shù)量與病人腫瘤的進(jìn)展程度以及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[9-11]。有關(guān)CD4+CD25+Treg的研究也存在一定的不一致性，這有可能與CD4+CD25+不能完全代表Treg細(xì)胞與腫瘤的相關(guān)性有關(guān)[12]。Foxp3屬于foxhead家族分叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是細(xì)胞獲得性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，目前認(rèn)為Foxp3是Treg的特異性標(biāo)志，其表達(dá)正常是CD4+CD25+Treg發(fā)揮作用的重要前提[13]。

為此，我們收集了江西地區(qū)的65例急性白血病患者和25例正常體檢患者，采用雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果提示，急性白血病患者（未緩解組和+緩解組）外周血中CD4+CD25+Foxp3+比例比正常對(duì)照組明顯提高，且治療緩解后CD4+CD25+Foxp3+表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。進(jìn)一步設(shè)計(jì)采用熒光定量PCR方法檢測(cè)Treg表面Foxp3+基因的mRNA的表達(dá)，結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致。本研究提示CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)與急性白血病有一定相關(guān)性，并且可能與急性白血病的治療緩解相關(guān)。白血病患者由于骨髓造血系統(tǒng)異常，導(dǎo)致免疫力下降，易于發(fā)生各種并發(fā)感染，本研究將收集的65例急性白血病患者分為合并感染組和未合并感染組，比較兩組患者中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)比例，由于可能本研究病例數(shù)尚少，未見(jiàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有待進(jìn)一步收集樣本，在更大范圍內(nèi)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg在急性白血病患者中的表達(dá)。

Treg細(xì)胞在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡方面起著重要作用[6]，為了進(jìn)一步研究CD4+CD25+Foxp3+Treg對(duì)急性白血病的調(diào)節(jié)機(jī)制，我們采用熒光定量PCR檢測(cè)了細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因Bcl-2，Bax，P53的mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在急性白血病中表達(dá)上調(diào)，而B(niǎo)ax及P53表達(dá)下調(diào)。Bcl-2是體內(nèi)的重要抑制凋亡基因，能阻斷凋亡信號(hào)傳遞的最后通路而抑制凋[14]，Bax及P53是細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因，這一研究結(jié)果提示CD4+CD25+Foxp3+Treg有可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)急性白血病發(fā)生發(fā)展。Foxp3作為一種轉(zhuǎn)錄因子，定位于細(xì)胞內(nèi)，絕大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)手段是采用Western blot檢測(cè)其蛋白質(zhì)的表達(dá)水平[15]。本實(shí)驗(yàn)我們建立了流式細(xì)胞術(shù)合并熒光定量PCR共同檢測(cè)Foxp3的方法，這兩種方法均是可大范圍的運(yùn)用于臨床的，該方法學(xué)的建立，可將為CD4+CD25+Foxp3+Treg外周血檢測(cè)在臨床推廣應(yīng)用。

本研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)CD4+CD25+Foxp3+Treg在急性白血病中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為急性白血病患者的診斷和預(yù)后提供了可供選擇的新思路，但急性白血病細(xì)胞對(duì)CD4+CD25+Foxp3+Treg進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)以及哪些藥物可以通過(guò)靶向CD4+CD25+Foxp3+Treg達(dá)到抑制或治療急性白血病，這些問(wèn)題均有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

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Peripheral Blood Cd4+Cd25+Foxp3+Regulatory T Cells Detection And Its Effect On Cell Apoptosis In Acute Leukemia

WU Qiong，WANG Xiaozhong.
Department of Clinical Laboratory，Second Affiliated Hospital，Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Objective To study the detection of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in cute leukemia patients’peripheral blood，and discuss its influence on cell apoptosis.Methods Sixty-five cases of patients with acute leukemia(including 33 cases of acute lymphocytic leukemia and 32 cases of acute myeloid leukemia)were divided into un-relieved group(28 cases)，completely relieved group(37 cases).And 25 healthy volunteers were selected as control group.According to whether accompanied with infection，65 cases of patients were also divided into leukemia accompanied with infection group(39 cases)and not accompanied with infection group(26 cases).Compared to normal control group，F(xiàn)oxP3 expression was detected in the protein and mRNA level using flow cytometry(FCM)and fluorescent quantitative PCR(qPCR)methods.At the same time，apoptosis related genes Bcl-2，Bax，P53 were detected by qPCR.Results Compared with normal controls，peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+proportion increased significantly in the patients with acute leukemia(un-relieved group and completely relieved group).And CD4+CD25+Foxp3+expression reduced after therapy(P＜0.05).As cell apoptosis related genes，Bcl-2 was unregulated，while Bax and P53 were down regulated. Conclusion CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells are upregulated in acute leukemia patients’peripheral blood，and cell apoptosis related genes were influenced，indicating that CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells influence the development of acute leukemia through apoptosis signaling pathways.

∶Acute leukemia；Flow cytometry；CD4+CD25+Foxp3+；Regulatory T cells；Cell apoptosis

R733.7，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0304-04

2016-11-24；

2017-05-17)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.004

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：2014ZBAB205010

吳瓊，女，1984年生，主管技師，流式細(xì)胞術(shù)。

王小中，男，1973年生，主任技師，教授，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)。