周 霞 金先橋

(復旦大學附屬華山醫(yī)院呼吸科 上海 200040)

地塞米松抑制煙曲霉菌暴露的支氣管哮喘大鼠肺組織IL-33的表達

周 霞 金先橋△

(復旦大學附屬華山醫(yī)院呼吸科 上海 200040)

目的 研究煙曲霉菌暴露對支氣管哮喘大鼠肺組織IL-33水平的影響及地塞米松的作用。方法 將24只Wistar大鼠隨機分為A組(正常對照組)、B組(哮喘組)、C組(煙曲霉菌暴露組)、D組(地塞米松干預組),每組6只。B、C、D組均以卵白蛋白(ovalbumin,OVA)致敏、激發(fā)的方法構建哮喘模型;C、D組在哮喘模型構建成功后,給予煙曲霉菌孢子鼻腔滴入;D組在OVA激發(fā)階段給予地塞米松干預;A組則予等量生理鹽水致敏、激發(fā)、滴鼻作為對照。通過氣道高反應性檢測、嗜酸性粒細胞百分比及血清IgE水平確定哮喘模型的建立,ELISA法及qRT-PCR法檢測肺組織IL-33的表達,大鼠肺組織和全血于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)上培養(yǎng)24 h后觀察煙曲霉菌菌落生長情況。結果 B、C組與A組比較,肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞百分比、血清IgE水平及肺組織IL-33的表達均明顯升高(P<0.05),且C組比B組升高更明顯。各組間氣道反應性指標sRaw變化值差異不明顯。D組與C組比較,嗜酸性粒細胞百分比及肺組織IL-33的表達均明顯降低(P<0.05),血清IgE水平降低不顯著,但肺組織煙曲霉菌培養(yǎng)陽性率高于C組。結論 糖皮質激素(地塞米松)能夠抑制煙曲霉菌暴露的支氣管哮喘大鼠肺組織IL-33的表達,但增加了氣道真菌定植的風險,針對IL-33的阻斷治療有待進一步研究。

煙曲霉菌; 支氣管哮喘; 白細胞介素33; 地塞米松; Wistar大鼠

煙曲霉菌孢子作為一種重要的外源性過敏原,廣泛飄散于空氣中,并與呼吸道疾病密切相關。大量的研究顯示,環(huán)境中高濃度煙曲霉菌孢子吸入與支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)急性發(fā)作及加重密切相關[1-2]。對煙曲霉菌過敏成為哮喘加重的重要危險因素之一,持續(xù)或間歇性煙曲霉菌暴露及其在氣道內的定植與生長可能是哮喘惡化的驅動因素。隨著變態(tài)反應性支氣管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)、變態(tài)反應性支氣管肺霉菌病(allergic bronchopulmonary mycosis,ABPM) 和真菌致敏性重癥哮喘(severe asthma associated with fungal sensitization,SAFS)等概念的提出[3-4],煙曲霉菌與重癥哮喘及難治性哮喘的聯(lián)系越來越受到重視。

Th1/Th2細胞比例失調是引起哮喘的主要原因,Th2細胞過度活化所產(chǎn)生的Th2型細胞因子在哮喘慢性氣道炎癥中起重要作用。近年來,白細胞介素33 (interleukin 33,IL-33)作為一種新發(fā)現(xiàn)的細胞因子受到關注,當致敏原刺激氣道上皮后,上皮細胞來源的IL-33與其受體ST2結合可激活II型固有淋巴細胞(group 2 innate lymphoid cells,ILC2s),產(chǎn)生大量的Th2細胞因子,從而介導Th2型免疫反應,參與哮喘的發(fā)生發(fā)展[5-7]。但是,煙曲霉菌相關的難治性哮喘發(fā)生是否與IL-33有關,哮喘常用藥物糖皮質激素治療對IL-33表達有無影響,目前仍不清楚。

本文通過模擬哮喘患者真菌暴露的狀態(tài),給予慢性哮喘大鼠煙曲霉菌孢子吸入,觀察和分析哮喘大鼠相關癥狀與指標。本研究目的在于分析暴露于煙曲霉菌環(huán)境中的哮喘大鼠肺組織內IL-33水平的改變以及地塞米松治療的利弊,從而為哮喘的治療提供新思路。

材 料 和 方 法

實驗動物 SPF級Wistar大鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2012-0002,雄性,體質量180～200 g,實驗前適應性飼養(yǎng)1周。動物飼養(yǎng)及實驗方案均嚴格按照復旦大學動物倫理委員會動物實驗規(guī)范執(zhí)行。

主要試劑與儀器 煙曲霉菌株(復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌室保存菌株,菌株號Af 293);馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA,上海盛思公司);卵白蛋白(OVA,美國Sigma公司);氫氧化鋁(美國Sigma公司);乙酰甲膽堿(美國Sigma公司);大鼠IL-33 ELISA試劑盒(美國R&D公司);大鼠IgE ELISA試劑盒(英國Abcam公司);注射用地塞米松磷酸鈉(批號:150523-2,安徽馬鞍山豐原制藥公司);易氟烷(美國百特公司);戊巴比妥鈉(德國默克公司);Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司);SYBR Green PCR試劑盒(日本TOYOBO公司);壓縮式霧化器(型號:AG CLASSIC,德國飛利浦公司);無創(chuàng)式動物肺功能檢測分析儀(型號:FinePointeTMNAM,美國Buxco公司);五分類血液細胞分析儀(型號:SA-3B100123,深圳邁瑞生物公司);Real-time PCR分析儀(型號:7900HT,美國ABI公司);移液器(法國吉爾森公司);組織勻漿機(型號:Tissuelyser-24,上海凈信公司)。

動物分組與模型建立 將24只Wistar大鼠隨機等分為A組(正常對照組)、B組(哮喘組)、C組(煙曲霉菌暴露組)、D組(地塞米松干預組)。參照文獻[8],B、C、D組大鼠于第1天和第8天給予OVA懸液腹腔注射致敏(1 mL/只,1 mg OVA+100 mg氫氧化鋁溶于1 mL無菌生理鹽水中);第15天起,將B、C、D組大鼠置于透明密閉霧化箱中連續(xù)6周給予1% OVA懸液霧化吸入以激發(fā)哮喘(每周5次,每次30 min),A組給予生理鹽水致敏并激發(fā)以作對照處理;D組大鼠于OVA激發(fā)期間(霧化前30 min)給予每周3次的0.5 mg/kg 地塞米松腹腔注射治療。第57天起,將C、D組大鼠于異氟烷麻醉后垂直位放置,用移液槍吸取100 μL 1.0×107/mL 煙曲霉菌孢子懸液緩慢滴入每側鼻腔,連續(xù)3天,其余各組給予生理鹽水滴鼻作為對照。建模流程見圖1。實驗中觀察各組大鼠行為學改變、打噴嚏、流涕等癥狀。

A:Normal control; B:Asthma group; C :Aspergillusfumigatus-exposed group; D :Dexamethasone-treated group.The same in Fig 2 to 4 and Tab 1.

圖1 動物實驗時間流程圖

Fig 1 Time schedule of the experimental procedures

氣道反應性檢測 于最后一次煙曲霉菌孢子滴鼻24 h后對各組大鼠進行氣道反應性測定。本實驗采用FinePointeTMNAM無創(chuàng)式動物肺功能檢測分析儀,通過檢測鼻部氣流與胸部氣流的相位差計算出特殊氣道阻力sRaw[9]。將大鼠置于雙腔體積描記器,用不同濃度的乙酰甲膽堿溶液激發(fā)支氣管哮喘(3.125、6.25、12.5、25.0和50.0 mg/mL),以PBS作為基線。通過FinePointe軟件分析各組大鼠在不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)下特殊氣道阻力sRaw (cmH2O · sec-1· mL-1)的變化。

標本采集 腹腔注射2 %戊巴比妥鈉麻醉大鼠后腹主動脈取血,3 000 r/min (離心半徑為10 cm),4 ℃離心15 min,取上清于-80 ℃凍存。結扎右肺根部后氣管插管并固定,使用無菌PBS行左肺肺泡灌洗,3次共10 mL,肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)于1 000 r/min (離心半徑10 cm),4 ℃離心10 min,取上清于-80 ℃凍存,細胞沉淀使用200 μL PBS重懸后進行嗜酸性粒細胞百分比計數(shù)(EOS%)。

ELISA檢測 運用ELISA方法檢測大鼠血清中IgE及BALF中IL-33的表達。試劑盒敏感度分別為:IgE,1.419 ng/mL;IL-33,14.3 pg/mL。按照試劑盒說明書操作,全自動酶標儀在450 nm處檢測各孔的吸光度值。

qRT-PCR檢測 運用qRT-PCR方法檢測各組大鼠肺組織中IL-33 mRNA的表達。Trizol法提取肺組織總RNA,逆轉錄合成樣本cDNA。引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成,序列如下:β-actin,上游引物 5′-GCA GGA GTA CGA TGA GTC CG-3′,下游引物5′-ACG CAG CTC AGT AAC AGT CC-3′;IL-33,上游引物 5′- GCC CTG AGC ACA TAC AAC GA-3′,下游引物 5′-CGT AGT AAC GGA GTA GCA CC TT-3′。實 驗 數(shù) 據(jù) 采 用 儀 器 自 帶 軟 件分析,通過2-ΔΔCT計算cDNA相對轉錄水平。

煙曲霉菌定植的觀察 各組大鼠肺組織取相同部位,稱重、勻漿(100 mg/mL PBS,置于無菌EP管中)。取肺組織勻漿液和全血各100 μL均勻涂于加有雙抗的PDA培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形成。

結 果

一般情況觀察A組大鼠給予生理鹽水激發(fā)前后一般狀態(tài)沒有明顯改變,呼吸平穩(wěn),狀態(tài)活躍;B、C組大鼠激發(fā)后典型表現(xiàn)為:搔鼻,打噴嚏或咳嗽,呼吸急促,嚴重者可聞及明顯的喘息聲,呼吸幅度加大且不齊,活動明顯減少;D組大鼠上述癥狀明顯減輕。與A組比較,B、C、D組大鼠在OVA致敏、激發(fā)階段體質量增長較為緩慢,差異有統(tǒng)計學意義(表1,P<0.05),D組尤為明顯甚至停止增長(表1,P<0.05)。

氣道反應性檢測 用乙酰甲膽堿進行激發(fā)時,A組大鼠無明顯反應,C組的特殊氣道阻力sRaw變化值隨著乙酰甲膽堿濃度的增加呈上升趨勢。在乙酰甲膽堿濃度為25mg/mL時,C組的sRaw變化值與A組比較,差異有統(tǒng)計學意義(圖2,P<0.05)。D組大鼠的sRaw變化值較C組有一定程度降低,但差異無統(tǒng)計學意義(圖2,P >0.05),表明D組氣道高反應性接近于正常。

表 1 各組大鼠體質量的改變

All values are displayed as means ± SEM.(1)vs.A group,P<0.05,(2)vs.B and C group,P<0.05.

(1)vs.A group,P=0.050,0.031,0.129 (t=2.429,2.795,1.757);(2)vs.B group,P=0.875(t=0.165);(3)vs. C group,P=0.192(t=1.470).

圖2 各組大鼠氣道反應性的變化

Fig 2 Changes in airway responsiveness of the rats in different groups

血清中的IgE水平和BALF中的Eos% B、C組大鼠血清中的IgE表達水平和BALF中的Eos%均明顯高于A組,差異有統(tǒng)計學意義(圖3,P<0.05);C組血清中的IgE表達水平和BALF中的Eos%較B組均有上升趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義。與C組比較,D組大鼠BALF中的Eos%顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(圖3B,P<0.05),且D組大鼠BALF中的Eos%接近于A組,差異無統(tǒng)計學意義,說明D組大鼠氣道中嗜酸性粒細胞聚集情況趨向于正常。與C組比較,D組大鼠血清中的IgE表達水平也有一定程度減少,但差異無統(tǒng)計學意義(圖3A,P>0.05)。

肺組織中IL-33的表達 B、C組BALF中IL-33的表達明顯高于A組,差異有統(tǒng)計學意義(圖4A,P<0.05);與B組比較,C組BALF中的IL-33水平有上升趨勢,但兩組間差異無統(tǒng)計學意義;D組與C組比較,BALF中的IL-33的表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(圖4A,P<0.05);D組與A組比較,BALF中IL-33水平差異無統(tǒng)計學意義,說明D組BALF中的IL-33水平接近于正常。B、C組肺組織中的IL-33 mRNA表達水平明顯高于A組,差異有統(tǒng)計學意義(圖4B,P<0.05); C組肺組織中的IL-33 mRNA水平較B組有升高趨勢,但兩組間差異無統(tǒng)計學意義;與C組比較,D組肺組織的IL-33 mRNA表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(圖4B,P<0.05);D組與A組比較,肺組織中IL-33m RNA水平差異無統(tǒng)計學意義,說明D組肺組織中的IL-33 mRNA水平接近于正常。

A:The levels of IgE in serum;(1)vs.A group,P=0.009,0.012,0.022 (t=3.763,3.563,3.064);(2)vs.B group,P=0.367 (t=0.976);(3)vs.C group,P=0.134 (t=1.730).b:The percentage of eosinophil cells in BALF.(1)vs.A group,P=0.021,0.015,0.232 (t=3.325,3.635,1.360);(2)vs.B group,P=0.250 (t=1.273);(3)vs.C group,P=0.016 (t=3.315).

圖3 各組大鼠血清中的IgE水平和BALF中的Eos%的比較

Fig 3 The levels of IgE in serum and eosinophil percentage in BALF of the rats in different groups

A:The levels of IL-33 in BALF(ELISA);(1)vs.A group,P=0.025,0.000,0.523 (t=2.750,5.968,0.664);(2)vs.B group,P=0.170(t=1.506);(3)vs.C group,P=0.000 (t=5.346).b:The levels of IL-33 mRNA in the lung(q-RT PCR).(1)vs.A group,P=0.043,0.015,0.574 (t=2.461,3.222,0.590);(2)vs.B group,P=0.222 (t=1.324);(3)vs.C group,P=0.015 (t=3.070).

圖4 各組大鼠肺組織中IL-33表達水平的比較

Fig 4 The expression levels of IL-33 in the lung of the rats in different groups

相關性分析 Pearson相關分析結果顯示,BALF中的IL-33水平與BALF中的Eos%、血清中的IgE水平均呈明顯正相關(r=0.853 6,P<0.000 1;r=0.648 9,P=0.006 5),提示IL-33水平的變化可能與支氣管哮喘的嚴重程度具有一定的關聯(lián)性。

煙曲霉菌定植的情況 PDA培養(yǎng)結果顯示,A、B組大鼠肺組織勻漿未見煙曲霉菌菌落形成,C組大鼠肺組織勻漿半數(shù)有菌落生成(3/6,定植率為50%),而D組大鼠肺組織勻漿均有煙曲霉菌菌落生成(6/6,定植率為100%)。各組大鼠血培養(yǎng)均未見煙曲霉菌菌落生成。

討 論

近年來,隨著免疫抑制劑、廣譜抗生素、激素的廣泛應用以及骨髓移植、器官移植的普遍開展,條件致病菌感染的患病率和死亡率逐漸增高。煙曲霉菌是一種廣泛存在于環(huán)境中的重要的條件致病菌,其微小的孢子結構使之被吸入后易于到達宿主肺泡,通過菌絲生長而定植于氣道內或引發(fā)侵襲性感染。流行病學研究顯示,煙曲霉菌致敏是哮喘加重的危險因素[3],在0.7%～3.5%的哮喘患者中,煙曲霉菌在氣道內的定植與生長導致了一種以氣道高反應性為表現(xiàn)的疾病的發(fā)生,即ABPA[4]。煙曲霉菌能激發(fā)宿主CD4+Th2細胞反應及分泌Th2型細胞因子,介導適應性免疫,刺激IgE、IgG抗體的產(chǎn)生[10],煙曲霉菌特異性IgE致敏還與哮喘患者肺功能惡化密切相關[11]。

隨著ILC2s的發(fā)現(xiàn),固有免疫在哮喘病程中的作用越來越受到關注[12],尤其是對于固有細胞因子IL-33的重視[13]。IL-33是最新發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員,在重癥哮喘患者的氣道上皮和平滑肌上均有表達[14-15]。一項關于哮喘的全基因組相關性分析也證實了IL-33基因與哮喘相關聯(lián)[16]。作為前炎癥因子,IL-33與其配體ST2結合后,刺激ILC2s分泌大量的Th2型細胞因子IL-5和IL-13,參與組織損傷、炎癥和過敏性反應[6,17-19],這也與我們過去研究中發(fā)現(xiàn)的煙曲霉菌暴露的哮喘大鼠肺組織IL-5、IL-13高表達相吻合[8]。在慢性哮喘小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn),將ILC2或IL-33基因敲除后,氣道炎癥、氣道高反應性、血清IgE水平和氣道重塑均有改善,而單獨將T細胞敲除,氣道高反應性卻不能緩解[19-20]。在慢性哮喘持續(xù)發(fā)作過程中,氣道上皮來源的IL-33刺激ILC2s分泌的IL-13反過來又促進IL-33和ST2的高表達,這種反饋性調節(jié)可能在慢性哮喘持續(xù)性氣道高反應性中起重要作用[20]。

本研究發(fā)現(xiàn),哮喘大鼠經(jīng)煙曲霉菌暴露后,其氣道高反應性、BALF中Eos%和血清中IgE水平較單純哮喘組均有上升的趨勢,肺組織內IL-33的表達也較單純哮喘組有所增高,但是兩組間差異無統(tǒng)計學意義,分析其原因可能與大鼠的免疫狀態(tài)、煙曲霉菌暴露的時間和濃度有關。栗芳等[21]在建立侵襲性肺曲霉菌病小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn),免疫抑制感染組(環(huán)磷酰胺免疫抑制+煙曲霉菌接種)較正常狀態(tài)感染組(無免疫抑制+煙曲霉菌接種)肺間質充血、肺泡內炎性細胞浸潤、支氣管壁破壞等情況更為嚴重,且正常感染組肺組織未發(fā)現(xiàn)菌絲,說明正常免疫狀態(tài)具有清除真菌孢子的作用。劉婷婷等[22]在利用煙曲霉菌提取物誘導小鼠哮喘模型的研究中發(fā)現(xiàn),給予3周煙曲霉菌暴露后,BALF中總炎癥細胞數(shù)和Th2細胞因子、血清IgE水平、氣道黏液分泌顯著增多。本研究以侵襲性肺曲霉菌病成模平均時間3天作為參考給予煙曲霉菌暴露,缺陷在于未將不同時間梯度和濃度梯度的煙曲霉菌暴露對哮喘各項指標的變化進行分析。

相關性分析顯示,肺組織內IL-33水平與BALF中Eos%、血清中IgE水平均呈正相關,提示IL-33水平在一定程度上反應哮喘的嚴重程度。糖皮質激素因其良好的抗炎效果,仍被認為是哮喘治療的金標準。本研究中地塞米松預處理能有效地降低煙曲霉菌暴露組大鼠的嗜酸性粒細胞和血清IgE水平,對肺組織內IL-33的表達也有明顯的抑制作用,但對氣道高反應性的緩解不明顯。另一方面,糖皮質激素的使用也增加了煙曲霉菌氣道定植的風險,地塞米松預處理組大鼠肺組織煙曲霉菌培養(yǎng)均為陽性,定植率達100%,而單純哮喘組大鼠氣道煙曲霉菌定植率為50%。其原因可能為:糖皮質激素對免疫過程的多個環(huán)節(jié)有抑制作用,包括對巨噬細胞吞噬、處理抗原作用的抑制和細胞免疫的抑制;糖皮質激素還能增強煙曲霉孢子的侵襲力,并且與作用的時間與濃度呈正相關[23]。近期研究還發(fā)現(xiàn),糖皮質激素治療只是抑制Th2細胞的作用,并不能抑制ILC2s介導的炎性反應[24],因此,ILC2s介導的固有免疫可能與糖皮質激素抵抗型哮喘相關。

總之,IL-33和ILC2s的發(fā)現(xiàn)擴展了我們對哮喘的認識,肺組織和BALF中IL-33水平的升高有可能成為衡量哮喘嚴重程度的新指標。盡管糖皮質激素在一定程度上可抑制IL-33的表達,但也增加了真菌氣道定植的風險。對于哮喘固有免疫的研究還處在初級階段,具體的致病機制、信號通路有待進一步研究和探討。IL-33作為新的治療靶點在重癥哮喘及難治性哮喘,尤其是糖皮質激素抵抗型哮喘中可能具有廣闊的應用前景。

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Dexamethasone inhibits IL-33 expression in the lung in a rat model ofAspergillusfumigatus-exposed bronchial asthma

ZHOU Xia, JIN Xian-qiao△

(DepartmentofRespiratoryMedicine,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

Objective To investigate the levels of IL-33 in the lung induced byAspergillusfumigatus(A.fumigatus) exposure in bronchial asthmatic rats and the effects of dexamethasone. Methods Twenty-four Wistar rats were randomly and equally divided into group A (normal control),group B (asthma group),group C (A.fumigatus-exposed group),and group D (dexamethasone-treated group).B,C and D group were sensitized and challenged with ovalbumin (OVA) to establish asthmatic models.Then,group C and D were givenA.fumigatusspores intranasally.Group D was pre-treated with dexamethasone during ovalbumin challenge.Group A was sensitized and challenged intranasally with normal saline as control.Airway hyperresponsiveness,eosinophils percentage and serum IgE levels

were measured to confirm the establishment of asthmatic model.Expression of IL-33 in the lung were quantified by ELISA and qRT-PCR.Lung tissues and blood were plated on the potato dextrose agar (PDA)medium and cultivated for 24 h to measure the number of colony. Results Eosinophils percentage in bronchoalveolar lavage fluid (BALF),IgE levels in serum and IL-33 levels in the lung in group B and C were much more higher than in group A (P<0.05),and the increasing range in group C was more obvious than group B.However,the changes of sRaw values in these groups had no statistical significance.Esosinophils percentage in BALF and IL-33 levels in the lung were significantly decreased (P<0.05),and IgE levels in serum was slightly decreased (P>0.05) in group D when compared with group C,but the ratio ofA.fumigatuscolonization in the lung was higher than group C.Conclusions Dexamethasone can inhibit the expression of IL-33 in the lung induced byA.fumigatusexposure in an asthmatic rat,but it also increases the risk of fungal colonization in the airway.Anti-IL-33 antibody treatment needs further research.

Aspergillusfumigatus; bronchial asthma; interleukin 33; dexamethasone;Wistar rat

R562.25

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.03.012

2016-09-27;編輯:張秀峰)

上海市科委基礎研究領域重點項目(12JC1407501)

△Corresponding author E-mail:jinxianqiao@126.com

*This work was supported by the key Basic Research Project from Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (12JC1407501).