包 晨 周 霞 馮娜娜 李 靜 宋元林 白春學(xué) 楊 冬 周 建△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科 上海 200032; 2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院呼吸科 上海 200040)

連花定喘片治療支氣管哮喘的療效

包 晨1周 霞2馮娜娜1李 靜1宋元林1白春學(xué)1楊 冬1周 建1△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科 上海 200032;2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院呼吸科 上海 200040)

目的 評(píng)價(jià)連花定喘片治療支氣管哮喘的療效。方法 將50只SPF級(jí)BALB/C小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地塞米松組、連花高劑量組、連花低劑量組,每組10只。采用卵清白蛋白+氫氧化鋁致敏,并霧化激發(fā)復(fù)制小鼠支氣管哮喘模型,給藥組于每次激發(fā)前30 min給藥,共計(jì)7次。采用特殊氣道阻力值評(píng)估氣道高反應(yīng)性,肺組織HE染色及肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)各組小鼠氣道炎癥性改變,ELISA法和磁性Luminex?分析法檢測(cè)BALF和血清中IL-4、IL-13、INF-γ的表達(dá)。結(jié)果 地塞米松組和連花高劑量組能顯著降低氣道阻力(P<0.05)。地塞米松組和連花高、低劑量組BALF中的各類炎性細(xì)胞數(shù)量和IL-13的表達(dá)均明顯減少(P<0.05)。血清IL-13的表達(dá)在地塞米松組明顯降低(P<0.05),但在連花高、低劑量組中沒有變化。各組小鼠BALF和血清中IL-4和INF-γ的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 連花定喘片可緩解哮喘癥狀,可能與其降低Th2型細(xì)胞因子IL-13的含量,從而減輕氣道炎癥有關(guān)。

連花定喘片; 支氣管哮喘; 氣道高反應(yīng)性; 細(xì)胞因子; 地塞米松

支氣管哮喘是一種由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥性疾病,具有可逆性氣流受限的特點(diǎn)。在哮喘病理生理過程中,Th1/Th2細(xì)胞比例失衡,尤其是Th2細(xì)胞過度增殖活化、分泌細(xì)胞因子過多是引起氣道炎癥的主要原因之一[1]。目前,中醫(yī)藥治療哮喘在臨床上取得了一定進(jìn)展,一些研究證明中西醫(yī)結(jié)合治療控制氣道炎癥的作用優(yōu)于單獨(dú)使用激素或常規(guī)西藥治療[2-4]。連花定喘片是一種純中藥制劑,其主要成分為麻黃、白果、桑白皮等,具有宣肺降氣平喘,清熱化痰通絡(luò)之功效。本文擬通過建立哮喘小鼠模型,觀察連花定喘片和地塞米松對(duì)哮喘小鼠外周血和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF) 中各類炎性細(xì)胞以及Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13,Th1型細(xì)胞因子INF-γ的影響,以評(píng)價(jià)連花定喘片的治療效果。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康BALB/C小鼠,SPF級(jí),雄性,6～8周齡。購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002。隨機(jī)分為5組:對(duì)照組、模型組、地塞米松組、連花高劑量組、連花低劑量組。

主要藥物和試劑 連花定喘片(批號(hào):A1405001,北京以嶺藥業(yè)股份有限公司);注射用地塞米松磷酸鈉(批號(hào):150523-2,馬鞍山豐原制藥有限公司);卵清白蛋白(五級(jí))、氫氧化鋁、乙酰甲膽堿均購于美國(guó)Sigma公司;小鼠IL-4、IL-13、INF-γ ELISA試劑盒均購于美國(guó)R&D公司;磁性Luminex?分析儀購于美國(guó)Life Technologies公司;戊巴比妥鈉購于德國(guó)默克公司。

主要儀器 壓縮式霧化器(型號(hào):AG CLASSIC,德國(guó)飛利浦公司);無創(chuàng)式動(dòng)物肺功能檢測(cè)分析儀(型號(hào):FinePointeTMNAM,美國(guó)Buxco公司);全自動(dòng)五分類動(dòng)物血細(xì)胞分析儀(型號(hào):ProCyte Dx,美國(guó)IDEX公司)。低溫高速離心機(jī)(型號(hào):5804R,德國(guó)Eppendorf公司);高通量多元生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用軟件MILLIPLEX Analyst(美國(guó)密理博公司)。

動(dòng)物模型復(fù)制 哮喘模型的復(fù)制根據(jù)Shi等[5]的方法進(jìn)行改進(jìn),于實(shí)驗(yàn)第0、7天,除對(duì)照組給予0.1 mL 0.9 %生理鹽水外,其余各組小鼠均以新鮮配置的卵白蛋白(ovalbumin,OVA)致敏液(0.1 mg OVA+2 mg氫氧化鋁溶于0.1 mL生理鹽水)作腹腔注射。于實(shí)驗(yàn)第14天開始,將小鼠置于自制霧化箱(40 cm×30 cm×20 cm)內(nèi),用超聲霧化器霧化1% OVA生理鹽水溶液30 min (對(duì)照組予生理鹽水霧化),每天1次,連續(xù)7天,以激發(fā)哮喘。

給藥方法 給藥組從實(shí)驗(yàn)第14天開始于每次霧化激發(fā)前30 min給藥,連續(xù)7天。連花高、低劑量組分別按5.1、1.3 g/kg (生藥/體質(zhì)量)藥物含量煎成水溶液后灌胃(分別相當(dāng)于臨床成人用量的14、3.5倍)。地塞米松組按1 mg/kg體質(zhì)量左下腹腹腔注射給藥。對(duì)照組和模型組給予生理鹽水作對(duì)照處理。

氣道反應(yīng)性檢測(cè) 最后一次激發(fā)后24 h,用Buxco肺功能分析儀進(jìn)行無創(chuàng)氣道反應(yīng)性檢測(cè),以PBS、不同濃度的乙酰甲膽堿溶液(3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL)進(jìn)行支氣管激發(fā),觀察不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)下其氣道阻力參數(shù)特殊氣道阻力值(specific airway resistance,sRaw)值的變化。

取材 腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉,眼球取血,于4 ℃下900×g離心5 min,分離血清于-80 ℃保存。取血后開胸,氣管插管并固定,使用1 mL注射器以無菌PBS行雙肺肺泡灌洗,回收率>80%,BALF進(jìn)行細(xì)胞五分類計(jì)數(shù)后,于4 ℃下100×g離心10 min,取上清于-80 ℃凍存。留取肺組織,未灌洗過的肺組織放入緩沖中性4%甲醛溶液,固定48 h后常規(guī)石蠟包埋切片,肺組織HE染色,用于鏡下觀察肺內(nèi)支氣管損傷以及支氣管、肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況,其余肺組織于-80 ℃凍存。

指標(biāo)檢測(cè) 運(yùn)用ELISA方法測(cè)定血清和BALF中的IL-4、IL-13、INF-γ的水平,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值。運(yùn)用磁性Luminex?分析法檢測(cè)血清和BALF中IL-4、IL-13、INF-γ的水平,并用MILLIPLEXTM高通量多元生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用軟件進(jìn)行分析。

結(jié) 果

各組小鼠氣道反應(yīng)性的情況 與對(duì)照組比較,模型組的sRaw值隨著乙酰甲膽堿濃度的不斷增加,在濃度為6.25、12.5和25mg/mL時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1)。與模型組比較,地塞米松組和連花高劑量組氣道阻力有明顯改善,在藥物濃度為12.5和25mg/mL時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1);連花低劑量組氣道阻力稍有改善,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

(1)vs.Control group,P<0.05;(2)vs.OVA group,P<0.05.

圖1 各組小鼠氣道反應(yīng)性的變化

Fig 1 Changes of airway responsiveness in different mice groups

各組小鼠肺組織HE染色 對(duì)照組小鼠肺組織HE染色可見支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)清晰,黏膜無明顯破壞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的表現(xiàn)。模型組小鼠支氣管壁周圍有較明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),平滑肌層增厚,管腔內(nèi)上皮結(jié)構(gòu)破壞,管腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞。地塞米松組和連花高、低劑量組小鼠支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕(圖2)。

Original magnification,×100 separately.A:Control group;B:OVA group;C:DEX group;D:High-doseLianhuagroup;E:Low-doseLianhuagroup.

圖2 各組小鼠肺組織HE染色

Fig 2 HE staining in lung tissues of different mice groups

各組小鼠BALF中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)的情況 與對(duì)照組比較,模型組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。與模型組比較,地塞米松組BALF中的白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3);連花高劑量組也能顯著抑制白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3),但對(duì)中性粒細(xì)胞水平的抑制不明顯。連花低劑量組炎性細(xì)胞數(shù)量稍有降低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

各組小鼠BALF中IL-4、IL-13、INF-γ的水平模型組BALF中IL-13的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4);地塞米松組BALF中IL-13的表達(dá)較模型組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。連花高、低劑量組BALF中IL-13的表達(dá)較模型組明顯降低,ELISA法檢測(cè)顯示連花低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,磁性Luminex?法檢測(cè)顯示連花高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。IL-4和INF-γ在各組間BALF中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA法和磁性Luminex?兩種檢測(cè)方法所得結(jié)果較為一致。

各組小鼠血清中IL-4、IL-13、INF-γ的水平 模型組血清中IL-13的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5);地塞米松組血清中IL-13的表達(dá)較模型組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5);連花高、低劑量組均不能抑制血清中IL-13的表達(dá)。IL-4和INF-γ在各組間血清中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA法和磁性Luminex?兩種檢測(cè)方法所得結(jié)果較一致。

(1)vs.Control group,P<0.05.(2)vs.OVA group,P<0.05.

圖3 各組小鼠BALF中炎性細(xì)胞的比較

Fig 3 Inflammatory cells in BALF in different mice groups

A,B and C:Quantified by ELISA;D,E and F:Quantified by Magnetic Luminex?.(1)vs.Control group,P<0.05;(2)vs.OVA group,P<0.05.

圖4 各組小鼠BALF中細(xì)胞因子的比較

Fig 4 Cytokines in BALF in different mice groups

A,B and C:Quantified by ELISA;D,E and F:Quantified by Magnetic Luminex?.(1)vs.Control group,P<0.05;(2)vs.OVA group,P<0.05.

圖5 各組小鼠血清中細(xì)胞因子的比較

Fig 5 Cytokines in serum in different mice groups

討 論

支氣管哮喘是一種以可逆性氣流受限、嗜酸性粒細(xì)胞和Th2型細(xì)胞因子浸潤(rùn)、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為特征的氣道慢性炎癥性疾病[6]。眾多研究表明,體內(nèi)Th1/Th2比例失調(diào)是引起哮喘發(fā)生的主要原因,在哮喘發(fā)病過程中Th2細(xì)胞功能亢進(jìn),Th1細(xì)胞功能降低[1,7]。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、INF- γ,介導(dǎo)1型免疫反應(yīng);Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13,刺激2型免疫反應(yīng)[8-9]。IL-4是B細(xì)胞的生長(zhǎng)因子,作用在B 淋巴細(xì)胞上可刺激 B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE,還可通過B細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的抗原提呈作用,促進(jìn)IgE介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,從而誘發(fā)支氣管哮喘[10]。IL-13可通過募集和激活炎性細(xì)胞而介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的聚集,還可促進(jìn)IgE的產(chǎn)生,抑制Th1細(xì)胞的分化,誘導(dǎo)其向Th2細(xì)胞分化[11-12];此外,IL-13還可增加氣道高反應(yīng)性、促進(jìn)支氣管內(nèi)黏液的分泌和細(xì)胞外基質(zhì)的合成,增強(qiáng)氣道平滑肌細(xì)胞的收縮力,從而參與氣道炎癥和氣道重塑的過程[13]。IFN-γ不僅能夠調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞活化和募集,下調(diào)嗜酸粒細(xì)胞趨化因子受體的表達(dá),還能抑制IgE的生成;此外,IFN-γ作為NO合成酶的主要誘導(dǎo)劑,在NO抑制平滑肌細(xì)胞增殖的過程中具有重要作用[14-15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,哮喘模型組BALF和血清中IL-13水平顯著高于對(duì)照組,且BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高且伴有氣道高反應(yīng)性,病理結(jié)果也顯示哮喘模型組小鼠氣道黏膜水腫、支氣管壁增厚等病理改變,提示IL-13與氣道炎癥和氣道重塑有關(guān)。但是本實(shí)驗(yàn)中各組小鼠BALF和血清中IL-14和IFN-γ的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

臨床治療哮喘的主要原則是控制和消除氣道炎癥,糖皮質(zhì)激素具有較強(qiáng)的抗變態(tài)反應(yīng),能夠有效控制炎癥而抑制哮喘的發(fā)作。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),地塞米松治療能明顯緩解哮喘模型組小鼠氣道高反應(yīng)性,降低BALF中各類炎性細(xì)胞總數(shù),抑制BALF和血清中IL-13水平,能夠較好地控制哮喘氣道炎癥(P均<0.05)。連花高、低劑量組小鼠BALF中的IL-13水平也較哮喘模型組顯著降低(P均<0.05);給予高劑量連花定喘片治療,能夠明顯抑制BALF中各類炎性細(xì)胞數(shù)量,降低氣道高反應(yīng)性(P均<0.05),較低劑量連花定喘片效果更優(yōu),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在臨床上,部分哮喘患者常規(guī)吸入糖皮質(zhì)激素治療無效[16],且高劑量吸入激素的安全性也令人擔(dān)憂,可增加條件致病菌感染的患病率[17]。連花定喘片主要成分為麻黃、白果、桑白皮等,藥理研究發(fā)現(xiàn)其可抑制變態(tài)反應(yīng)、肥大細(xì)胞脫顆粒等,發(fā)揮對(duì)支氣管哮喘的防治作用。

綜上所述,連花定喘片與地塞米松作用相當(dāng),可緩解小鼠哮喘癥狀,可能與其降低哮喘小鼠IL-13水平,減輕氣道炎癥有關(guān)。連花定喘片作為一種中藥制劑,不良反應(yīng)少,安全性好,值得推廣。

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Efficacy ofLianhuaDingchuanTablets in bronchial asthma

BAO Chen1, ZHOU Xia2, FENG Na-na1, LI Jing1, SONG Yuan-lin1, BAI Chun-xue1, YANG Dong1, ZHOU Jian1△

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

Objective To evaluate the efficacy ofLianhuaDingchuanTablets in bronchial asthma.Methods Fifty BALB/C mice were randomly and equally divided into control (Con) group,ovalbumin (OVA) group,dexamethasone (DEX) group,high-doseLianhuagroup,low-doseLianhuagroup.The mice were sensitized and challenged with OVA plus aluminium hydroxide to establish asthmatic model and were pre-treated 30 minutes before challenge.Specific airway resistance(sRaw) was used to evaluate airway hyperresponsiveness,and airway inflammatory changes were measured.ELISA and Magnetic Luminex?were used to quantified the levels of IL-4,IL-13 and INF-γ. Results Airway resistance significantly decreased in DEX group and High-doseLianhua group (P<0.05).Levels of inflammatory cells and IL-13 in BALF evidently reduced in DEX group,high-doseLianhuagroup and low-doseLianhuagroup (P<0.05),while IL-13 level in serum only decreased in DEX group.There was no significant changes in the levels of IL-4 and INF-γ among those groups.ConclusionsLianhuaDingchuanTablets might relieve the symptoms of asthma by reducing IL-13 level and inhibiting the airway inflammation.

LianhuaDingchuanTablets; bronchial asthma; airway hyperresponsiveness;cytokines; dexamethasone

北京市科委“十病十藥專項(xiàng)”(Z121102001112002);國(guó)家自然科學(xué)基金(81400018,81570028);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20130071120063);科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFC1304104)

R562.2

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.03.013

2016-10-24;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:zhou.jian@fudan.edu.cn

*This work was supported by “Ten Diseases and Ten Drugs Research Project” of Beijing Municipal Science and Technology Commission(Z121102001112002),National Natural Science Foundtion of China (81400018,81570028),Doctoral Fund of Ministry of Education of China (20130071120063) and National Key R&D Plan from Ministry of Science and Technology (2016YFC1304104).