張來軍,陳永敢,杭瑜瑜

海南熱帶海洋學院生命科學與生態(tài)學院，三亞 572022

重金屬Cr(VI)、Pb及Cu脅迫對雙齒圍沙蠶體腔細胞的DNA損傷

張來軍*,陳永敢,杭瑜瑜

海南熱帶海洋學院生命科學與生態(tài)學院，三亞 572022

為探討重金屬Cr(VI)、Pb以及Cu對沙蠶體腔細胞DNA的毒性效應，以雙齒圍沙蠶為受試動物，重金屬按不同劑量水平，Cr(VI)：10、100和200 mg·L-1，Pb：5、50和100 mg·L-1，Cu：1、10和20 mg·L-1，分別脅迫沙蠶24 h，以不加任何重金屬離子的海水為對照，采用單細胞凝膠電泳技術，檢測其體腔細胞DNA損傷程度。結果表明，與空白對照組相比，3種重金屬離子的各濃度組都能引起沙蠶體腔細胞DNA損傷，且3種重金屬脅迫濃度與細胞DNA損傷程度之間存在顯著的劑量-效應關系。雙齒圍沙蠶可以作為單細胞凝膠電泳的實驗材料用于重金屬所致環(huán)境污染的生物監(jiān)測指示生物。

重金屬；雙齒圍沙蠶；遺傳毒性；DNA損傷；體腔細胞；彗星實驗

重金屬污染，是指由重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染。隨著我國沿海經(jīng)濟的高速發(fā)展和城市化進程的加劇，大量含重金屬等有毒物質(zhì)的廢水排放，使河口生態(tài)環(huán)境遭到嚴重破壞。重金屬污染物不易降解，能迅速由水相轉入固相(懸浮物和沉積物)，進入沉積物中蓄積，使沉積物成為重金屬等化學物質(zhì)的主要存儲庫。這些污染物或因環(huán)境變化再釋放到水體中，對水體造成“二次污染”[1]。海洋生物通過攝食、呼吸或其體表與水體的滲透交換作用，使水體中重金屬進入其體內(nèi)，導致其功能蛋白質(zhì)、DNA等結構受到破壞和失活，使代謝、遺傳等功能遭到破壞。為了能準確、及時、全面地反映海洋環(huán)境質(zhì)量現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢，需要隨時進行環(huán)境檢測，傳統(tǒng)的環(huán)境檢測方法，物理監(jiān)測和化學監(jiān)測，能對環(huán)境中的化學物質(zhì)精確定量，卻不能反映其對生物體的效應。因此近年來，生物監(jiān)測的應用越來越廣泛，逐漸成為環(huán)境監(jiān)測的重要組成部分。

單細胞凝膠電泳(single cell gel eletrophoresis, SCGE)，或彗星電泳(comet assay)，是用于各種動物細胞DNA損傷檢測的一種較為成熟的技術，具有簡便、快速、靈敏等特點，廣泛應用于毒理學、生物學、醫(yī)學、環(huán)境生物監(jiān)測等領域。環(huán)境污染中的生物、物理、化學因素都能導致細胞DNA損傷，引起基因突變和細胞癌變。所以判斷細胞DNA是否出現(xiàn)損傷情況在環(huán)境監(jiān)測方面尤為重要。SCGE能夠檢測不同生物不同細胞的不同類型的遺傳毒理損傷情況。有研究表明，SCGE與其他常用的遺傳生態(tài)毒理學生物標志物相比，在對水生生物遺傳毒理檢測中更具敏感性[2]。目前SCGE已被廣泛用于魚和貽貝細胞的實驗室標準檢測中[3-5]。

沙蠶，又名海蟲，海蛆，屬環(huán)節(jié)動物門多毛綱動物。棲息于水-陸交錯帶特別是沉積物中，在海洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈物質(zhì)傳遞中擔負著重要功能，是最易受到環(huán)境有毒有害物質(zhì)傷害的生物之一。國內(nèi)外已有一些研究報道在環(huán)境污染物作用下，沙蠶體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)變化，也有用其乙酰膽堿酯酶活性評價污染物的毒性效應[6-9]，但以沙蠶為材料應用SCGE研究DNA損傷指數(shù)并用來評價環(huán)境污染情況的報道并不多見[10]。本文采用SCGE技術,以雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)為試驗動物，研究重金屬脅迫對沙蠶體腔細胞DNA損傷的影響,探討SCGE技術在沙蠶中的應用，旨在找出除貽貝、牡蠣等軟體動物和少數(shù)魚類之外適宜于海洋環(huán)境污染生物監(jiān)測的指示動物,也進一步闡明Cr(VI)、Cu與Pb的毒理學作用機制,為海洋水環(huán)境污染評價等提供更多的參考。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗用雙齒圍沙蠶購買于三亞五洲漁具店，將購買的沙蠶放入培養(yǎng)皿中，清洗體表，進行初步篩選，選擇大小相似的個體，放入塑料箱中，加入滅菌的海沙和天然海水暫養(yǎng)3 d。暫養(yǎng)期間，每天更換一次海水，水溫為25 ℃，鹽度為31～32，pH值為8.5，3 d后再用于重金屬脅迫實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 重金屬鹽溶液的配制和沙蠶暴露實驗

參考國家漁業(yè)水質(zhì)標準GB11607—89，鉻、鉛和銅3種離子濃度分別小于等于0.1、0.05和0.01 mg·L-1，3種重金屬鹽選用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)、醋酸鉛(C4H6O4Pb·3H2O)、硫酸銅(CuSO4·5H2O),以滅菌海水配制成低、中和高3個濃度組，濃度分別為標準濃度的100倍、1 000倍和2 000倍，脅迫濃度則分別為Cr(VI)：10、100和200 mg·L-1，Pb：5、50和100 mg·L-1，Cu：1、10和20 mg·L-1溶液。

選擇體表健康無傷痕的沙蠶，稱重，分為4組，平均體質(zhì)量為(3.29±0.46) g，將沙蠶1只/瓶置于150 mL三角瓶中。瓶內(nèi)加入5 mL不同濃度梯度Cr(VI)的海水，室溫25 ℃下進行暴露實驗，每24 h更換相同Cr(VI)濃度的海水，并清理排出的廢物，同一濃度梯度脅迫沙蠶5只。空白對照組不加任何重金屬離子。同樣方法處理Pb、Cu脅迫沙蠶，24 h后用于彗星電泳。

1.2.2 體腔細胞的提取

根據(jù)Eyambe等的方法[11]提取體腔細胞，稍有改動。脅迫結束后，將不同濃度組的沙蠶每組隨機選取2條，剪取其身體中后部約1 cm長的軀干，移入2 mL離心管中，加入4 ℃體腔細胞提取液(簡稱EM，無水乙醇與生理鹽水(質(zhì)量分數(shù)為0.7%)的體積比為5∶95，2.5 mg·mL-1Na2EDTA，10 mg·mL-1愈瘡木酚甘油醚，pH 7.3)400 μL，1 min后。再加入4 ℃磷酸緩沖液(簡稱PBS，組成為NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，定容至1 000 mL，pH 7.4)1.5 mL，棄沙蠶，得到體腔細胞。800～1 000 r·min-1，離心3 min，棄上清，兩管合為一管，重新加入1 mL PBS。顯微鏡下觀察細胞活力，調(diào)整細胞密度，準備電泳。

1.3 SCGE檢測

按Zhang等[12]的方法并加以改良進行彗星電泳。將潔凈的載玻片在質(zhì)量分數(shù)為0.6%的常熔點瓊脂糖中浸沒后取出，置37 ℃烘箱烘干，以備電泳。將細胞懸液和質(zhì)量分數(shù)為1%的低熔點膠按1∶1體積混合均勻，鋪在預處理后的載玻片上，4 ℃放置5 min，使瓊脂糖完全固化。將鋪好膠的載玻片放入新鮮配制的裂解液(2.5 mol·L-1NaCl、0.1 mol·L-1Na2EDTA、0.01 mol·L-1Tris-HCl、質(zhì)量分數(shù)為1%的肌氨酸鈉，pH 10，體積分數(shù)為1%的Triton X-100，體積分數(shù)為10%的二甲基亞砜(DMSO))中，裂解90 min。蒸餾水沖洗后，將載玻片放入電泳緩沖液(0.3 mol·L-1NaOH、1 mmol·L-1Na2EDTA，pH>13)中，變性解旋20 min，電泳20 min (26 V、300 mA)。用400 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中和3次，每次5 min，從裂解到中和的所有過程需在4 ℃下進行。將載玻片置于溴化乙錠(20 μg·mL-1)中染色20 min后，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個處理隨機取約50個細胞，用CASP軟件進行分析，可得到尾部DNA含量(TDNA%)、尾矩(Tail Moment, TM)和Olive尾矩(Olive Tail Moment, OTM)等諸多參數(shù)。本實驗選用TDNA%作為衡量細胞DNA損傷程度的評價指標。

用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，分析比較各濃度組之間及其與對照組之間TDNA%差異的顯著性，實驗重復3次。

2 結果(Results)

2.1 沙蠶的體腔細胞

將細胞均勻分散在PBS中，經(jīng)吹打、稀釋后，在顯微鏡下直接觀察(×200)，見(圖1)，可以看到沙蠶體腔細胞呈均勻的圓形，數(shù)量多，純度高，雜質(zhì)少。再將細胞用甲醇固定，瑞氏染液染色后(圖2)，發(fā)現(xiàn)黃細胞數(shù)量最多，其細胞個體大，但細胞核較小，這類細胞構成沙蠶細胞免疫的重要組成部分。少量嗜中性細胞，有較大核質(zhì)比(圖中未顯示)，以及個體較小但數(shù)量多的嗜堿性細胞。

圖1 雙齒圍沙蠶的體腔細胞(×200)Fig. 1 The coelomocytes of Perinereis aibuhitensis (×200)

圖2 雙齒圍沙蠶體腔細胞中的組織黃細胞(×200)Fig. 2 The chlorogogen cells of Perinereis aibuhitensis coelomocytes (×200)

2.2 重金屬對沙蠶體腔細胞彗星電泳TDNA%的影響

圖3為不同濃度Cu脅迫沙蠶24 h后，幾種典型的體腔細胞彗星電泳圖像。

圖3 暴露于不同濃度Cu 24 h后沙蠶體腔細胞的彗星電泳圖(×400)注：A—對照組；B—1 mg·L-1組；C—10 mg·L-1組；D—20 mg·L-1組。Fig. 3 Comet assay of Perinereis aibuhitensis coelomocytes after 24 h-exposure to different concentrations of Cu (×400)Note: A-control; B-1 mg·L-1; C-10 mg·L-1; D-20 mg·L-1.

用CASP軟件分析各個處理組拍攝的彗星圖像，所得到的TDNA%與3種重金屬及其濃度之間的關系如圖4、圖5、圖6所示。3種濃度梯度Cr(VI)離子脅迫后得到的TDNA%值均大于對照組值，但是僅濃度為200 mg·L-1的高濃度組與對照組比較達到顯著性水平(P<0.05)(圖4)，且高濃度組相比10、100 mg·L-1低、中濃度組也有顯著差異。Pb各處理組TDNA%值均顯著大于對照組(P<0.05)，且100 mg·L-1高濃度組TDNA%相比對照組差異顯著(P<0.01)，與5、50 mg·L-1低、中濃度組相比也有顯著差異(P<0.05)(圖5)。3種濃度Cu脅迫所得到的TDNA%顯著高于對照組(P<0.05)，10 mg·L-1和20 mg·L-1的中濃度組和高濃度組的TDNA%相比對照組差異顯著性水平更高(P<0.01)，相比1 mg·L-1的低濃度組也具有顯著差異(P<0.05)(圖6)。Cr(VI)、Pb、Cu這3種重金屬離子脅迫沙蠶，經(jīng)彗星電泳后所得到的TDNA%值隨脅迫濃度的升高而升高，脅迫濃度與TDNA%之間存在著明顯的劑量-效應關系。

圖4 Cr(VI)對雙齒圍沙蠶體腔細胞彗尾DNA百分含量的影響注：與對照組比，*差異顯著，0.01

圖5 Pb對雙齒圍沙蠶體腔細胞彗尾DNA百分含量的影響注：與對照組比，*差異顯著，0.01

上述結果表明，重金屬Cr(VI)、Pb、Cu污染下，沙蠶體腔細胞DNA出現(xiàn)了損傷。損傷的程度與重金屬的濃度呈正相關。

圖6 Cu對雙齒圍沙蠶體腔細胞彗尾DNA百分含量的影響注：與對照組比，*差異顯著，0.01

3 討論(Discussion)

本文采用的實驗材料雙齒圍沙蠶，廣泛分布于我國沿海潮間帶和河口區(qū)，是最大高潮線附近底棲生物中的優(yōu)勢種[13]。適宜養(yǎng)殖，在實驗室條件下飼養(yǎng)容易，飼養(yǎng)的條件及設備都極為簡單。其體腔中充滿體腔液，體腔液中的細胞均不同程度地與免疫過程有關，或其代謝作用和分泌作用與體液免疫相關[14]，體腔中的黃細胞吸收血液中的代謝廢物后，溶解或整個細胞脫離細胞群，落入體腔液中，經(jīng)由腎管排出體外。沙蠶體腔細胞的提取方法操作簡單，得到的細胞數(shù)量多，存活率高，能夠滿足SCGE實驗的需要。這為以沙蠶為材料應用SCGE技術進行海洋環(huán)境污染生物監(jiān)測創(chuàng)造了理想條件。

選擇3種重金屬離子Cr(VI)、Pb、Cu作用于沙蠶，提取其體腔細胞，利用SCGE檢測重金屬對雙齒圍沙蠶的遺傳毒性。在一定的濃度范圍內(nèi)，隨3種離子脅迫濃度的提高，TDNA%值均分別隨之增加，即離子的濃度與沙蠶體腔細胞DNA的損傷程度之間存在著明顯的劑量-效應關系。SCGE技術靈敏地檢測出了重金屬對沙蠶體腔細胞的損傷程度，也在一定程度上反映出水體或沉積物中重金屬的污染情況。由此揭示了沙蠶對重金屬所致的毒性效應極為敏感，可以將沙蠶應用于SCGE技術，對重金屬污染物進行遺傳毒理分析。

重金屬是近岸海域最主要的污染物之一，由于其在環(huán)境中不易代謝、分解、轉變，且易于沉降，所以沉積物被認為是海洋環(huán)境中重金屬最終的蓄積地。唐博等[1]對珠江口和北部灣2個海域海底沉積物的Zn、Pb、Cu、Cr這4種重金屬元素污染程度和生態(tài)風險進行了評價，結果表明，Cu在2個區(qū)域均達嚴重污染程度，Zn、Pb、Cr在珠江口沿岸均達到中等污染程度，在北部灣的部分區(qū)域達到中等污染程度。目前常采用底棲生活的貝類和游泳生物中的魚類做為監(jiān)測生物進行海洋生物監(jiān)測。將這2類海洋生物與SCGE技術結合對海洋環(huán)境中的各種污染物，如有機物[4-5,15]、重金屬[16-17]和農(nóng)藥[18-20]等進行遺傳毒理學研究已有大量報道。Nagarani等[21]以氯化汞脅迫Therapon jarbua，利用SCGE技術檢測了腮、腎及血細胞的DNA損傷，揭示了同種生物不同細胞類型對重金屬脅迫的敏感性不同。Al-Subiai等[22]以Mytilus edulis L.為材料，以不同濃度的銅脅迫，用SCGE評價其遺傳損傷的同時，結合組織病理學檢查，用多種生物標志物的方法綜合評價重金屬銅對這種生物的影響，認為這種綜合評估方法適宜于評估污染物的短期及長期毒性效應。將沙蠶作為SCGE實驗材料的報道相對較少，Lewis和Galloway[10]用甲磺酸甲酯(MMS)脅迫3種沙蠶Arenicola marina, Nereis diversicolor和Nereis virens，用SCGE檢測不同種及不同的細胞類型對污染物的敏感性差異，后來又用納米二氧化鈦脅迫沙蠶，并認為高濃度的納米二氧化鈦引起了體腔細胞及其DNA的損傷[23]。Catalano等[24]用PAHs脅迫一種沙蠶Hediste diversicolor，檢測了過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶，并進行了SCGE和微核實驗等，認為這種沙蠶是理想的有機污染的生物指示物。我國沙蠶常被用做抗氧化防御系統(tǒng)、乙酰膽堿酯酶等檢測的研究材料，用其DNA損傷參數(shù)評價環(huán)境毒物遺傳毒性的報道極少。隨著海洋環(huán)境污染監(jiān)測越來越受到重視，雙齒圍沙蠶在近岸海域污染的生物監(jiān)測和環(huán)境風險評估中將會發(fā)揮重要的作用。

致謝：感謝海南醫(yī)學院實驗中心的大力支持。

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DNA Damage of Coelomocyte inPerinereisaibuhitensisInduced by Chromium(VI), Lead and Copper

Zhang Laijun*, Chen Yonggan, Hang Yuyu

College of Life Sciences and Ecology, Tropical Ocean College of Hainan, Sanya 572022, China

8 April 2016 accepted 5 September 2016

To investigate the toxic effect of heavy metal on marine organisms, Perinereis aibuhitensis were exposed to heavy metal Cr(VI), Pb and Cu at three different concentrations, Cr(VI): 10, 100 and 200 mg·L-1, Pb: 5, 50 and 100 mg·L-1, Cu: 1, 10 and 20 mg·L-1for 24 h. The DNA damage of coelomocyte cells in Perinereis aibuhitensis was detected by single cell gel electrophoresis (comet assay). The result showed that every concentration group of three kinds of heavy metals can cause the DNA damage, compared with the blank group. There was a significant relationship between the concentration of heavy metal and the degree of DNA damage in cells. Perinereis aibuhitensis can be used as experimental material for single cell gel electrophoresis experiments, and then it can be used as indicator for monitoring marine environmental pollution caused by heavy metals using the comet assay method.

heavy metal; Perinereis aibuhitensis; genotoxicity; DNA damage; coelomocyte; single cell gel electrophoresis

國家自然科學基金(31260139)；海南省自然科學基金(313050)

張來軍(1968-), 女, 博士, 研究方向為細胞生物學, E-mail: ldxyzhlj@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160408002

2016-04-08 錄用日期：2016-09-05

1673-5897(2017)2-216-06

X171.5

A

張來軍(1968—)，女，副教授，主要從事細胞生物學教學及遺傳毒理學研究，發(fā)表學術論文20余篇。

張來軍, 陳永敢, 杭瑜瑜. 重金屬Cr(VI)、Pb及Cu脅迫對雙齒圍沙蠶體腔細胞的DNA損傷[J]. 生態(tài)毒理學報，2017, 12(2): 216-221

Zhang L J, Chen Y G, Hang Y Y. DNA damage of coelomocyte in Perinereis aibuhitensis induced by chromium(VI), lead and copper [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 216-221 (in Chinese)