瞿唯鋼，楊淞霖，王會(huì)利，郭寶元,*

1. 中國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 1001252. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085

3種殺菌劑及其復(fù)配劑對(duì)斑馬魚的急性毒性

瞿唯鋼1，楊淞霖2，王會(huì)利2，郭寶元2,*

1. 中國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 1001252. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085

采用“半靜態(tài)法”測(cè)定了3種農(nóng)藥及其復(fù)配劑對(duì)斑馬魚的24 h、48 h、72 h和96 h急性毒性，根據(jù)我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則》中毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)來劃分它們對(duì)斑馬魚的毒性等級(jí)，發(fā)現(xiàn)35%精甲霜靈懸浮種衣劑的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50均超過10 a.i.mg·L-1，屬“低毒”級(jí)，而25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50分別為0.704 mg·L-1、0.514 mg·L-1、0.424 mg·L-1、0.262 mg·L-1，根據(jù)0.100 a.i.mg·L-1

農(nóng)藥；斑馬魚；急性毒性；半靜態(tài)法

近年來，為了保證作物的正常生長和產(chǎn)量，農(nóng)藥的使用量越來越大，尤其是發(fā)展中國家，如印度。初步估計(jì)15%左右的作物產(chǎn)量損失由病蟲害引起，這也是農(nóng)藥使用越來越廣泛的原因之一。但與此同時(shí)，殘留在作物或者土壤中的農(nóng)藥由于雨水和地表徑流進(jìn)入附近的水體中，對(duì)水體中的生物產(chǎn)生影響。盡管水體中的生物大部分并不是農(nóng)藥的靶標(biāo)生物，短時(shí)間內(nèi)并沒有產(chǎn)生致死等現(xiàn)象，但隨著水體中農(nóng)藥的累積，可能會(huì)造成生物繁殖能力下降、生長速率改變、抵御自然變化(pH、溫度和溶解氧)的能力下降等[1]，進(jìn)而威脅整個(gè)生態(tài)環(huán)境。

農(nóng)藥的環(huán)境污染及風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)引起了我國政府乃至國際的重視，尤其是對(duì)水生生物的污染及風(fēng)險(xiǎn)。目前我國頒布的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中第12部分“魚類急性毒性試驗(yàn)”專門針對(duì)農(nóng)藥對(duì)于水體中魚類的毒性風(fēng)險(xiǎn)做出了實(shí)驗(yàn)示范，而美國對(duì)于農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)歷史較長，評(píng)價(jià)模式較為完善，因而我們也參照了美國的“生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)基準(zhǔn)”[2]，其中生態(tài)受體主要選擇魚類和無脊椎動(dòng)物中的浮游動(dòng)物，而斑馬魚是最常用的受體，故我們選擇斑馬魚作為本研究的受試動(dòng)物。

精甲霜靈((R)-N-(2,6-二甲苯基)-N-(甲氧基乙?；?-D-丙胺酸甲酯，metalaxyl-M)，屬于苯基酰胺類殺菌劑，對(duì)卵菌菌絲生長、休止孢萌發(fā)均具有很強(qiáng)的抑制作用，有良好的內(nèi)吸傳導(dǎo)性能，對(duì)晚疫病有優(yōu)異的預(yù)防、治療和鏟除作用[3]，可用于種子、土壤處理及莖葉處理，主要用于防治瓜果、蔬菜的霜霉病、疫病及馬鈴薯晚疫病等[4]。

咯菌腈(4-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧-4-基)吡咯-3-腈，fludioxonil)屬于吡咯類殺菌劑，殺菌作用機(jī)理獨(dú)特，對(duì)灰霉病菌具有很高的抑菌活性[5]，常用來防治番茄、黃瓜、韭菜、草莓和萵苣等多種蔬菜的灰霉病[6]。

嘧菌酯((E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯，azoxystrobin)是甲氧基丙烯酸酯類殺菌農(nóng)藥，高效、廣譜，對(duì)幾乎所有的真菌界(子囊菌亞門、擔(dān)子菌亞門、鞭毛菌亞門和半知菌亞門)病害如白粉病[7]、銹病、穎枯病、網(wǎng)斑病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性?？捎糜谇o葉噴霧、種子處理，也可進(jìn)行土壤處理，主要用于谷物、水稻、花生、葡萄、馬鈴薯、果樹、蔬菜、咖啡、草坪等。

而嘧菌酯、咯菌腈和精甲霜靈復(fù)配使用常用于種子處理，可防治大部分種子帶菌及土壤傳染的真菌病害[8-9]。以上3種農(nóng)藥均在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用，這些農(nóng)藥在使用后極易隨地表徑流進(jìn)入水體中，因而衡量它們對(duì)水體中生物的影響顯得尤為重要。但目前還未有報(bào)道研究它們對(duì)斑馬魚的潛在危害，本文為了給水生生物安全評(píng)價(jià)提供新的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，也為了更好地保護(hù)生物多樣性，對(duì)此展開了專門的毒理學(xué)研究。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 斑馬魚

試驗(yàn)用斑馬魚(Brachydanio rerio)購自北京中蔬大森林花卉交易市場(chǎng)，批次為AS08P150806。試驗(yàn)之前在與試驗(yàn)環(huán)境相同條件下飼養(yǎng)12 d。然后在溫度為21～25 ℃，光暗比為16 h:8 h的條件下馴養(yǎng)7 d，試驗(yàn)前24 h停止飼喂。

1.2 藥劑

35%精甲霜靈懸浮種衣劑(由農(nóng)業(yè)部提供)；25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑(由農(nóng)業(yè)部提供)；80%嘧菌酯水分散粒劑(由農(nóng)業(yè)部提供)；11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑(由農(nóng)業(yè)部提供)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)用魚馴養(yǎng)

試驗(yàn)前，挑選足夠數(shù)量斑馬魚，在試驗(yàn)條件下馴養(yǎng)7 d，每天飼喂2次剛孵化的豐年蟲幼體，試驗(yàn)前24 h停止飼喂。馴養(yǎng)一周死亡率為0%，死亡率未超過5%，試驗(yàn)前抽檢數(shù)量為10%的斑馬魚(10尾)，測(cè)量體長、體重，體長在1.7～2.3 cm范圍內(nèi)，承載量<1.0 g魚·L-1，符合試驗(yàn)要求。

1.3.2 毒性測(cè)試

試驗(yàn)依據(jù)我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[10]第12部分“魚類急性毒性試驗(yàn)”，農(nóng)藥環(huán)境評(píng)價(jià)良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范[11]，水質(zhì)-物質(zhì)對(duì)淡水魚(斑馬魚)急性毒性測(cè)定方法[12]，化學(xué)品-魚類急性毒性試驗(yàn)[13]，ISO[14]以及OECD[15]關(guān)于斑馬魚急性毒性測(cè)試方法來進(jìn)行。

采用半靜態(tài)法對(duì)斑馬魚進(jìn)行染毒。35%精甲霜靈懸浮種衣劑設(shè)定的5個(gè)處理組濃度，分別為20、40、60、80、100 a.i.mg·L-1；25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑設(shè)定的5個(gè)處理組濃度分別為0.180、0.234、0.304、0.395、0.514 a.i.mg·L-1；80%嘧菌酯水分散粒劑設(shè)定的5個(gè)處理組濃度分別為1.30、1.95、2.93、4.40、6.60 a.i.mg·L-1；11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑設(shè)定的5個(gè)處理組濃度分別為1.00、1.20、1.45、1.75、2.10 a.i.mg·L-1；，以曝氣自來水為空白對(duì)照，對(duì)照組和處理組均不設(shè)重復(fù)，每組加入10尾斑馬魚。

試驗(yàn)周期為96 h，每隔24 h更換原有藥液，每隔24 h測(cè)定溶液的pH值、溫度、溶解氧含量(DO)。

分別在0 h與24 h更換試驗(yàn)溶液之前從各處理組取100 mL的供試物溶液，于冰箱中凍存，用于供試物含量的測(cè)定。

觀察距試驗(yàn)開始24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)間間隔后各組斑馬魚中毒與死亡情況。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

以藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為自變量(x)，以相應(yīng)濃度下斑馬魚死亡率的幾率值為因變量(Y)，采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件及Probit程序進(jìn)行回歸分析，建立“劑量-效應(yīng)”線性方程，計(jì)算出LC50(或LD50)值及其95%置信限。

1.3.4 毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則》[10]中對(duì)魚類的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)來劃分4種農(nóng)藥對(duì)斑馬魚的毒性等級(jí)，見表1。

2 結(jié)果(Results)

2.1 3種供試農(nóng)藥及其復(fù)配劑對(duì)斑馬魚的24 h、48 h-LC50

3種農(nóng)藥及其復(fù)配劑對(duì)斑馬魚的24 h、48 h毒性測(cè)定結(jié)果如表2所示，35%精甲霜靈懸浮種衣劑的5個(gè)試驗(yàn)濃度處理組在24 h、48 h內(nèi)斑馬魚未發(fā)生死亡，說明35%精甲霜靈懸浮種衣劑在24 h、48 h內(nèi)對(duì)斑馬魚的LC50均大于100 a.i.mg·L-1。25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑在24 h、48 h內(nèi)對(duì)斑馬魚的LC50分別是0.704 mg·L-1和0.514 mg·L-1。由此可以看出對(duì)斑馬魚25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑比35%精甲霜靈懸浮種衣劑毒性大。而80%嘧菌酯水分散粒劑在24 h、48 h內(nèi)對(duì)斑馬魚的LC50分別是9.803 mg·L-1和5.175 mg·L-1；11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑在24 h、48 h內(nèi)對(duì)斑馬魚的LC50分別是2.267 mg·L-1和2.073 mg·L-1。可以看出，11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑的3種組分中咯菌腈毒性最強(qiáng)，精甲霜靈最弱。所以11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑的毒性主要源于咯菌腈。

表1 毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Toxicity grading standards

2.2 3種供試農(nóng)藥及其復(fù)配劑對(duì)斑馬魚的72 h、96 h-LC50

3種農(nóng)藥及其復(fù)配劑對(duì)斑馬魚的72 h、96 h毒性測(cè)定結(jié)果如表3所示，35%精甲霜靈懸浮種衣劑的5個(gè)試驗(yàn)濃度處理組在72 h、96 h內(nèi)斑馬魚仍未發(fā)生死亡，說明35%精甲霜靈懸浮種衣劑在72 h、96 h內(nèi)對(duì)斑馬魚的LC50均大于100 a.i.mg·L-1，滿足LC50(96 h)>10.0 a.i.mg·L-1，屬“低毒”級(jí)。25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑在72 h、96 h內(nèi)對(duì)斑馬魚的LC50分別是0.424 mg·L-1和0.262 mg·L-1，其LC50(96 h)在0.100～1.00 a.i.mg·L-1范圍內(nèi)，屬于“高毒”級(jí)別。80%嘧菌酯水分散粒劑在72 h、96 h內(nèi)對(duì)斑馬魚的LC50分別是4.328 mg·L-1和2.326 mg·L-1，其LC50(96 h)在1.00～10.0 a.i.mg·L-1范圍內(nèi)，屬“中毒”級(jí)。11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑在72 h、96 h內(nèi)對(duì)斑馬魚的LC50分別是1.62 mg·L-1和1.28 mg·L-1，其LC50(96 h)在1.00～10.0 a.i.mg·L-1范圍內(nèi)，屬“中毒”級(jí)。雖然11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑和80%嘧菌酯水分散粒劑同屬“中毒”，但比較具體數(shù)值，發(fā)現(xiàn)11%精甲霜靈·咯菌腈·嘧菌酯懸浮種衣劑毒性相對(duì)更大，可能是因?yàn)槠渲泻小案叨尽钡目┚妗?/p>

3 討論(Discussion)

35%精甲霜靈懸浮種衣劑對(duì)斑馬魚的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50均超過10 a.i.mg·L-1，屬“低毒”級(jí)，而25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑對(duì)斑馬魚的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50分別為0.704 mg·L-1、0.514 mg·L-1、0.424 mg·L-1、0.262 mg·L-1，根據(jù)0.100 a.i.mg·L-1

同一種農(nóng)藥對(duì)不同的生物的毒性是不同的，沒有所謂的毒性一定更強(qiáng)的農(nóng)藥，每種農(nóng)藥的毒性作用機(jī)制不同導(dǎo)致它對(duì)不同生物毒性不同。因而在開發(fā)新的農(nóng)藥時(shí)，除了要考慮對(duì)靶標(biāo)生物的殺滅效果，滿足人們防治病蟲害的效果，還要考慮農(nóng)藥對(duì)環(huán)境中其他生物可能的毒害作用，以免給生態(tài)環(huán)境帶來大的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)應(yīng)盡可能使用混劑，一方面可以減少各單劑的劑量，還可以達(dá)到多種效果，同時(shí)，人們還發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥混劑可以降低生物抗藥性[16]。可以在一定程度上緩解農(nóng)藥用量快速增長，給生態(tài)環(huán)境帶來的巨大壓力。

致謝：該項(xiàng)目得到國家自然科學(xué)基金No.21477152和No.21277163的支持。

表3 “半靜態(tài)法”測(cè)得的3種農(nóng)藥及其復(fù)配劑對(duì)斑馬魚的72 h、96 h-LC50Table 3 The 72 h and 96 h LC50 values of the studied pesticides to Brachydanio rerio by semi-static method

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◆

The Toxicity of Three Pesticides of Mefenoxam, Fludioxonil, Azoxystrobin and Their Compounds to Brachydanio rerio

Qu Weigang1, Yang Songlin2, Wang Huili2, Guo Baoyuan2,*

1. Institute for Control of Agrochemicals, Ministry of Agriculture, Beijing 100125, China2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

1 April 2016 accepted 23 May 2016

Semi-static method was applied to determine the 24 h, 48 h, 72 h and 96 h-LC50values of three pesticides and their compounds to Brachydanio rerio. And according to experimental criteria for environmental safety evaluation of chemical pesticides in our country, the 24 h, 48 h, 72 h and 96 h-LC50values of 35% mefenoxam seed coating agent are all above 10 a.i.mg·L-1so it is of low toxicity. 25 g·L-1fludioxonil seed coating agent is highly toxic because its 24 h, 48 h, 72 h and 96 h-LC50values are 0.704 mg·L-1, 0.514 mg·L-1, 0.424 mg·L-1, 0.262 mg·L-1according to the standard of 0.100 a.i.mg·L-1

pesticide; Brachydanio rerio; acute toxicity; semi-static method

國家自然科學(xué)基金(21477152，21277163)

瞿唯鋼(1958-)，男，農(nóng)藝師，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥環(huán)境毒理研究與農(nóng)藥登記管理，E-mail: quweigang@gmail.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: guoby@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160401008

2016-04-01 錄用日期：2016-05-23

1673-5897(2017)2-233-05

X171.5

A

郭寶元(1976-)，副研究員，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)。

瞿唯鋼, 楊淞霖, 王會(huì)利, 等. 3種殺菌劑及其復(fù)配劑對(duì)斑馬魚的急性毒性[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(2): 233-237

Qu W G, Yang S L, Wang H L, et al. The toxicity of three pesticides of mefenoxam, fludioxonil, azoxystrobin and their compounds to Brachydanio rerio [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 233-237 (in Chinese)