安翠紅，陳寶寶，范鎖平，孫養(yǎng)信，呂 文，魯 亮

?

陜西省黃鼠的遺傳學(xué)特征分析

安翠紅，陳寶寶，范鎖平，孫養(yǎng)信，呂 文，魯 亮

目的 明確分布于陜西省的黃鼠的遺傳學(xué)特征。方法 測(cè)定COI、Cyt-b基因序列，與內(nèi)蒙古科右中旗、正鑲白旗達(dá)烏爾黃鼠、寧夏海原縣阿拉善黃鼠同類基因序列進(jìn)行比對(duì)，分析遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育NJ樹。結(jié)果 陜西省定邊縣黃鼠COI基因序列與寧夏阿拉善黃鼠的遺傳距離≤0.5%，與內(nèi)蒙達(dá)烏爾黃鼠遺傳距離在7.9%～9.3%之間，Cyt-b基因序列與寧夏阿拉善黃鼠的遺傳距離為≤2.2%，與內(nèi)蒙達(dá)烏爾黃鼠遺傳距離在8.9%～11.2%之間?；贑OI和Cyt-b基因的NJ系統(tǒng)樹可見所有樣本序列形成兩個(gè)高支持度的單一分支，陜西定邊縣黃鼠與寧夏阿拉善黃鼠聚為一類，兩者與內(nèi)蒙達(dá)烏爾黃鼠形成兩個(gè)獨(dú)立分支, 基于COI基因的 NJ系統(tǒng)樹顯示陜西各地樣本聚為一類。結(jié)論 陜西省的黃鼠應(yīng)為阿拉善黃鼠。

黃鼠；DNA條形碼；COI基因；Cyt-b基因；阿拉善黃鼠；陜西；達(dá)烏爾黃鼠

阿拉善黃鼠(Spermophilusalashanicus)曾是一個(gè)有爭(zhēng)議的物種。20世紀(jì)中葉國內(nèi)外學(xué)者多以其形態(tài)特征與達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilusdauricus)相近，而將其歸為達(dá)烏爾黃鼠的亞種[1-2]。對(duì)于這兩種黃鼠的分類地位的討論經(jīng)歷了很長時(shí)間。近年來，利用細(xì)胞生物學(xué)手段，國內(nèi)外學(xué)者利用染色體核型來區(qū)分這兩種黃鼠，這兩種黃鼠的分類地位逐步明確[3-4]。

在陜西省的陜北、關(guān)中地區(qū)分布的黃鼠，多年來一直被認(rèn)為是達(dá)烏爾黃鼠[5-6]。中國學(xué)者趙天飆、秦長育等多將分布于內(nèi)蒙古南部和陜甘寧青及蒙古國西南部等地的阿拉善黃鼠視為達(dá)烏爾黃鼠的亞種[1-2]。上述區(qū)域中，涵蓋了陜西北部地區(qū)的長爪沙鼠鼠疫疫源地和寧夏甘肅的阿拉善黃鼠鼠疫疫源地。小型獸類宿主動(dòng)物的準(zhǔn)確分類是鼠疫動(dòng)物流行病學(xué)調(diào)查的重要內(nèi)容。但這些地區(qū)的黃鼠到底是哪種，不僅是單純分類學(xué)的問題，更是和公共衛(wèi)生相關(guān)的分類學(xué)問題。

DNA條形碼技術(shù)能夠準(zhǔn)確地評(píng)估物種和遺傳多樣性[8],并對(duì)生物多樣性進(jìn)行有效地監(jiān)測(cè)[7-9]。

陜西省鼠疫疫區(qū)1987-2014年發(fā)生3起鼠間鼠疫，在疫情處理及監(jiān)測(cè)過程中，經(jīng)常會(huì)遇到一些形態(tài)學(xué)上很難鑒定的宿主動(dòng)物。2012年課題組開展了DNA條形碼技術(shù)在陜西鼠疫疫區(qū)應(yīng)用研究[10]，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材 料

陜西省定邊縣、大荔縣、府谷縣、靖邊縣、吳起縣、寧夏海原縣、內(nèi)蒙古科右中旗、正鑲白旗現(xiàn)場(chǎng)采集黃鼠鼠體和臟器標(biāo)本。DB01-15采自定邊縣，DL01-10,13采自大荔縣，WQ01-05采自吳起縣，F(xiàn)G02-04，10采自府谷縣，JB18，19采自靖邊縣。NX01-7采自寧夏海原縣，NM49、50、52、53采自內(nèi)蒙科右中旗，ZB01-17采自內(nèi)蒙正鑲白旗。

2 方 法

2.1 DNA模板的制備 現(xiàn)場(chǎng)采集的樣本用無水乙醇保存帶回，使用Qiagen公司生產(chǎn)QIAamp DNA Mini kit試劑盒操作手冊(cè)制備DNA模板，測(cè)定其DNA含量。

2.2 PCR反應(yīng) 線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I亞基(COI)基因選用雞尾酒引物[11]，其中LepF1_t1、VF1_t1、VF1d_t、VF1i_t1的比例為1∶1∶1∶3。LepRI_t1、 VR1d_t1、 VR1_t1、VR1i_t1的比例也是1∶1∶1∶3，見表1。在25 μL反應(yīng)體系中, 2×Taq Mastermix 12.5 μL, 上下游引物各1 μL, 模板2 μL。擴(kuò)增條件: 94 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共35個(gè)循環(huán)。Cyt-b基因引物序列為L14724 5′-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3′，H15915 5′-CGGAATTCCATTTTTGGTTTACAAGAC-3′，PCR擴(kuò)增方法：50 μL PCR反應(yīng)體中，2×Taq Mastermix25 μL,上下游引物各2 μL,模板4 μL。擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,51 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析,若電泳圖中出現(xiàn)目標(biāo)條帶即送樣進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 擴(kuò)增COI基因的PCR引物序列
Tab.1 Sequence of primers for amplifyingCOIgene

引物類型Typeofprimer引物名稱Name引物序列(5'-3')Sequenceofprimers(5'-3')雞尾酒引物(上游)VF1LFt1Cocktailprimer(upstream)VF1LFt1LepF1_t1TGTAAAACGACGGCCAGTATTCAACCAAT-CATAAAGATATTGGVF1_t1TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAAC-CACAAAGACATTGGVF1d_tTGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAAC-CACAARGAYATYGGVF1i_t1TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAAC-CAIAAIGAIATIGG雞尾酒引物(下游)VR1LRt1Cocktailprimer(downstream)VR1LRt1LepRI_t1CAGGAAACAGCTATGACTAAACTTCTG-GATGTCCAAAAAATCAVR1d_t1CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCT-GGGTGGCCRAARAAYCAVR1_t1CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCT-GGGTGGCCAAAGAATCAVR1i_t1CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCT-GGGTGICCIAAIAAICA

2.3 DNA序列分析：用Chromos軟件觀察評(píng)價(jià)測(cè)序峰圖質(zhì)量, 如果峰圖質(zhì)量差，不能準(zhǔn)確判斷堿基, 則重新進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。將測(cè)定序列在NCBI上運(yùn)行BLAST程序進(jìn)行序列同源性比較。運(yùn)用Mega 6軟件比對(duì)各基因序列的堿基組成和變異,刪除序列兩端不能完全對(duì)齊的堿基?；贙imura-2-parameter(K2P)[12]模型計(jì)算各物種的遺傳距離；采用鄰接法構(gòu)建全部COI基因序列的NJ系統(tǒng)樹,對(duì)NJ樹進(jìn)行內(nèi)部分支檢驗(yàn)與1,000次Bootstrap檢驗(yàn)分析, 來確定各支系的置信度[13]。

3 結(jié) 果

3.1 DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)結(jié)果與分析 對(duì)采自陜西省定邊縣、寧夏海原縣、內(nèi)蒙古科右中旗、正鑲白旗的28份黃鼠樣本進(jìn)行DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)。其中NM49、NM50、NM52、NM53采自內(nèi)蒙科右中旗，其余內(nèi)蒙樣品采自正鑲白旗。28份樣本全部獲得COI基因、Cyt-b基因序列。

3.2 基因序列分析 陜西定邊黃鼠Cyt-b基因序列與寧夏阿拉善黃鼠的遺傳距離為≤2.2%，與內(nèi)蒙達(dá)烏爾黃鼠遺傳距離在8.9%～11.2%之間，陜西各地黃鼠COI基因序列與寧夏阿拉善黃鼠的遺傳距離≤2%，與內(nèi)蒙達(dá)烏爾黃鼠遺傳距離在8%～10%之間。

3.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 應(yīng)用Mega 6軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹,見圖1、圖2。圖1COI、Cyt-b基因NJ系統(tǒng)樹顯示內(nèi)蒙黃鼠與陜西定邊、寧夏海原黃鼠分成兩個(gè)獨(dú)立分支，陜西定邊黃鼠與寧夏海原黃鼠聚為一類。圖2COI基因NJ系統(tǒng)樹顯示陜西各地黃鼠聚為一類。

圖1 陜西定邊與寧夏、內(nèi)蒙古黃鼠COI、Cyt-b基因NJ系統(tǒng)樹Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of COI and Cyt-b of the Citellus samples from Dingbian County in Shaanxi,Nigxia and Inner Mongolia

圖2 陜西各地黃鼠COI基因NJ系統(tǒng)樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of the Citellus samples from different places of Shaanxi Province

4 討 論

線粒體(Mitochondria)是真核細(xì)胞中小分子量的復(fù)制單位, 由于其具有拷貝數(shù)多、分子量小、編碼效率高、母系遺傳和進(jìn)化速度較核基因組快等特點(diǎn)[14], 近年來越來越多的被作為分子標(biāo)記, 廣泛應(yīng)用到動(dòng)物進(jìn)化遺傳學(xué)、分子生態(tài)學(xué)、遺傳多樣性、物種及品系鑒定等方面[15]。DNA 條形碼是利用短的標(biāo)準(zhǔn) DNA 序列來鑒定物種的一種行之有效的方法，因其片段小且易于獲得而被廣泛應(yīng)用于多個(gè)物種的種類鑒定工作中。目前在動(dòng)物分類中最常用的基因序列是線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ亞基(COⅠ)序列和Cyt-b基因序列。

據(jù)Hebert等對(duì)GenBank中同一個(gè)屬的物種COI序列數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，結(jié)果表明種內(nèi)的COI序列差異程度小于2%[9]。馬英等對(duì)青海省海東地區(qū)小型獸類110只樣本的COI基因進(jìn)行序列分析, 發(fā)現(xiàn)種內(nèi)遺傳距離≤3%, 種間遺傳距離5%～10%[16], 安翠紅等對(duì)陜西鼠疫疫區(qū)139只宿主動(dòng)物COI基因進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)遺傳距離≤2%，種間遺傳距離8.9%～15.1%[10]。

Meyer 的研究表明, 對(duì)于初步進(jìn)行某些物種分子系統(tǒng)發(fā)育研究是可以首先采用線粒體細(xì)胞色素b 基因, 不僅它是13 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中了解的最為清楚的基因, 也被認(rèn)為是最可信的分子標(biāo)記之一[17], 同時(shí)用保守引物擴(kuò)增線粒體Cyt-b基因較其他線粒體基因要容易的多, 因此研究較為廣泛[18]。已有研究表明線粒體Cyt-b基因在研究親緣關(guān)系較近的物種分類階元系統(tǒng)關(guān)系和種系地理學(xué)方面非常有用[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，陜西省定邊縣黃鼠COI基因序列與寧夏海原縣阿拉善黃鼠的遺傳距離≤0.5%，與內(nèi)蒙達(dá)烏爾黃鼠遺傳距離在7.9%～9.3%之間。Cyt-b基因序列與寧夏阿拉善黃鼠的遺傳距離為≤2.2%，與內(nèi)蒙達(dá)烏爾黃鼠遺傳距離在8.9%～11.2%之間。NJ系統(tǒng)樹顯示陜西黃鼠與寧夏阿拉善黃鼠聚為一類，兩者與內(nèi)蒙達(dá)烏爾黃鼠形成兩個(gè)獨(dú)立分支。遺傳距離與NJ系統(tǒng)樹說明內(nèi)蒙科右中旗、正鑲白旗黃鼠和寧夏海原阿拉善黃鼠、陜西黃鼠為不同種，陜西黃鼠與寧夏海原阿拉善黃鼠為同種。

綜上，依據(jù)COI、Cyt-b基因序列比對(duì)結(jié)果，表明陜西省的黃鼠為阿拉善黃鼠。

[1] Zhao TB,Li XM,Duan QH,et al, Fuzzy cluster analysis of four kinds of ground squirrel skeletal morphology[J]. J Inner Neimengolia Prevent Med, 1994，19(2):67-68. (in Chinese)

趙天飆, 李新民, 段全紅等．四種黃鼠骨骼形態(tài)的模糊聚類分析[J]． 內(nèi)蒙古地方病防治研究． 1994，19(2):67-68．

[2] Qin CY，Li KC.Glires of Ningxia Autonomous[M].Yinchuan:People’s Publishing House of Ningxia.2003: 99-103. (in Chinese)

秦長育，李克昌．寧夏嚙齒動(dòng)物與防制[M]．銀川：寧夏人民出版社，2003:99-103．

[3] Tsvirka MV, Chelomina GN, Korabiev VP. Genetic evidence of hybridization between pale tailedSpermophiluspallidicaudaSatunin, 1903 andS.alaschanicusB Chner, 1888 ground squirrels in Mongolia[J]. Russian J Genetics, 2006, 42(4): 421-428. DOI: 10.1134/S1022795406040090

[4] Alcaide M, Rico C, Ruiz S, et al. Disentangling vector-borne transmission networks: a universal DNA barcoding method to identify vertebrate hosts from arthropod bloodmeals[J]. PLoS One, 2009, 4: e7092. DOI:10.1371/journal.pone.0007092

[5] Wang TZ,Xu WX. Fauna of Shaanxi Glires[M].Xi’an:Publishing House of Shaanxi Normal University. 1992:82-85. (in Chinese)

王廷正，許文賢．陜西嚙齒動(dòng)物志[M]．西安：陜西師范大學(xué)出版社，1992:82-85．

[6] Liu JS.Study on the important medical animals in Shaanxi province and its prevention and control[M].Xi’an,China.Xi’an: Publishing House of Northwest University. 2001:3-20. (in Chinese)

劉建書．陜西省重要醫(yī)學(xué)動(dòng)物及防制研究[M]．西安：西北大學(xué)出版社，2001:3-20．

[7] Hebert PD, Stoeckle MY, Zemlak TS, et al. Identification of birds through DNA barcodes[J]. PLoS Biol, 2004, 2(10): 312.DOI:10.1371/journal.pbio.0020312

[8] Hebert PDN, Ratnasingham S, deWaard JR. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J]. Proc Royal Soci London, Series B: Biologic Sci, 2003, 270(Suppl): 96-99.DOI:10.1098/rsbl.2003.0025

[9] Smith MA, Fisher BL, Hebert PD. DNA barcoding for effective biodiversity assessment of a hyperdiverse arthro-pod group: the ants of Madagascar[J]. Philosophic Transact Royal Soc B: Biologic Sci, 2005, 360: 1825-1834. DOI:10.1098/rstb.2005.1714

[10] An CH,Sun YX,Chen BB,et al,Identification on host animals for plague by DNA barcoding technology in Shaanxi province[J]. J Epidem,2014, 35(9):1042-1045. (in Chinese)

安翠紅, 孫養(yǎng)信,陳寶寶,等.DNA條形碼技術(shù)在陜西省鼠疫疫區(qū)宿主動(dòng)物鑒定中的應(yīng)用[J]. 中華流行病學(xué)雜志, 2014, 35(9):1042-1045.

[11] Ivanovo NV, Zemlak TS, Hanner RH, et al. Universal primer cocktails for fish DNA barcoding[J]. Mol Ecol Notes, 2007, 7: 544-548. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2007.01748.x

[12] Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J]. J Mol Evolut, 1980, 16: 111-120. DOI: 10.1007/BF01731581

[13] Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method:a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Mol Biol Evol, 1987, 4(4): 406-425.

[14] Gray MW. Origin and evolution of mitochondrial DNA[J]. Ann Rev Cell Biol, 1989, 5: 25-50. DOI:10.1146/annurev.cb.05.110189.000325

[15] Xiao WH, Zhang YP. Genetics and evolution of mitocchondrial DNA in fish[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2000, 24(4): 384-391. (in Chinese)

肖武漢, 張亞平. 魚類線粒體DNA的遺傳與進(jìn)化[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2000, 24(4): 384-391.

[16] Ma Y, Li HL, Lu L. Application for identification of small mammals by DNA barcoding in Haidong area, Qinghai ProvinceChina[J].Biodiversity Sci, 2012, 20(2): 193-198. (in Chinese)

馬英, 李海龍, 魯亮. DNA條形碼技術(shù)在青海海東地區(qū)小型獸類鑒定中的應(yīng)用[J].生物多樣性, 2012, 20(2)：193-198.

[17] Meyer A. Shortcoming of the cytochrome b gene as a molecular marker[J]. Trends Ecol Evolut, 1994, 9: 278-289. DOI: 10.1016/0169-5347(94)90028-0

[18] Katriina LI, Erie BT. Molecular resolution of the systematics of a problematic group of fishes (Teleostei: Osmeridae) and evidence for morphological homoplasy[J]. Mol Phylogenetics Evolut, 2009, 50(1): 163-175. DOI:10.1016/j.ympev.2008.10.021

[19] Song CB, Near TJ, Page LM. Phylogenetic relations among percid fishes as inferred from mitochondrial cytochrome b DNA sequence data[J]. Mol Phylogenetics Evolut, 1998, 10(3): 343-353. DOI:10.1006/mpev.1998.0542

Genetic characteristics ofSpermophilusin Shaanxi Province, China

AN Cui-hong, CHEN Bao-bao, FAN Suo-ping, SUN Yang-xin, LV Wen, LU Liang

(ShaanxiCenterforDiseaseControlandPrevention,Xi’an710054,China)

We studied the genetic characteristics ofSpermophilusin Shaanxi Province, China. TheCOI,Cyt-bgene were sequenced and the results were compared with those ofdauricusfrom Inner Mongolia Keyouzhong Banner and Zhengxiangbai Banner, andS.alaschanicusfrom Haiyuan County of Ningxia. And genetic distance was analyzed and Neighbor-Joining tree was built. Results showed that the genetic distance ofCOIgene sequences betweenSpermophilusfrom Dingbian County in Shaanxi andS.alaschanicusin Ningxia was ≤0.5%, and the genetic distance was ranged from 7.9% to 9.3% withCitellusdauricusfrom Inner Mongolia. The genetic distance ofCyt-bgene betweenSpermophilusfrom Dingbian County in Shaanxi andS.alaschanicusin Ningxia was ≤2.2%, and ranged from 8.9% to 11.2% withCitellusdauricusfrom Inner Mongolia. The Neighbor-Joining tree ofCOI,Cyt-bgene showed two major clusters. One of them were clustered bySpermophilusfrom Dingbian County in Shaanxi andS.alaschanicusin Ningxia, and another one wasCitellusdauricusfrom Inner Mongolia. The Neighbor-Joining tree ofCOIgene showed that all samples from Shaanxi Province clustered in a group. In conclusion, theSpermophilusin Shaanxi Province wereS.alaschanicus.

Spermophilus; DNA barcoding;COIgene;Cyt-bgene; Shaanxi Province;S.alaschanicus;S.dauricus

Sun Yang-Xin, Email: sxpco@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.013

孫養(yǎng)信，Email: sxpco@126.com

陜西省疾病預(yù)防控制中心，西安 710054

R394

A

1002-2694(2017)06-0538-04

2017-02-21 編輯：李友松

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012K16-12-03)資助

Supported by a grant from the Science and Technology Research and Development Program of Shaanxi Province,(No. 2012K16-12-03)