王 娟，劉鮮鮮,，張 倩，趙建梅，曲志娜，黃秀梅，王玉東，鄒 明，王君瑋

?

山東生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌血清型及耐藥性測試

王 娟1，劉鮮鮮1,2，張 倩3，趙建梅1，曲志娜1，黃秀梅1，王玉東1，鄒 明2，王君瑋1

目的 了解山東省生豬屠宰感染沙門氏菌耐藥狀況，指導(dǎo)臨床用藥。方法 利用沙門氏菌血清型快速分型試劑盒鑒定血清型，微量肉湯稀釋法對298株沙門氏菌進行8大類13種藥物的藥敏試驗。結(jié)果 鑒定出9種血清型，以德爾卑、鼠傷寒沙門氏菌為主；298株沙門氏菌對13種藥物的耐藥狀況不同，對四環(huán)素類藥物多西環(huán)素、四環(huán)素的耐藥率較高，分別為97.99%(292/298)、80.20%(239/298)，對粘桿菌素E最為敏感，耐藥率僅為2.01%(6/298)，其次為奧格門丁和氧氟沙星，耐藥率分別為2.35%(7/298)和4.03%(12/298)，多重耐藥率為81.88%(244/298)，優(yōu)勢耐藥譜型為四環(huán)素-多西環(huán)素。結(jié)論 山東省生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門菌優(yōu)勢血清型為德爾卑沙門氏菌，對不同藥物的耐藥情況不同，不同屠宰環(huán)節(jié)的耐藥性存在顯著差異，多重耐藥現(xiàn)象嚴重，耐藥譜型種類繁多。

豬； 屠宰； 沙門菌； 血清型；耐藥

Supported by the Program of Agricultural Product Quality Safety Risk Assessment(No.GJFP 201600703)

沙門氏菌(Salmonella)是一種重要的人獸共患病病原菌之一，每年因沙門氏菌感染而引起的食物中毒事件占食源性疾病的70%-80%[1]。沙門氏菌血清型眾多，目前發(fā)現(xiàn)了2500多種，我國發(fā)現(xiàn)了292種，其中有20種左右的沙門氏菌血清型易引起人畜患病[2]，危害較大的為鼠傷寒、腸炎以及豬霍亂沙門氏菌[3]。至今為止，沙門氏菌病的防治主要依靠抗生素類藥物，但由于抗生素的不合理使用，使得沙門氏菌產(chǎn)生了耐藥以及多重耐藥現(xiàn)象，耐藥譜型不斷增多，給畜禽養(yǎng)殖以及人類生命安全造成威脅。豬肉產(chǎn)品作為沙門氏菌的主要載體之一，特對生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌的血清型和耐藥性進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 2015年分離自山東生豬屠宰場不同屠宰環(huán)節(jié)豬胴體表面拭子樣品的298株沙門氏菌和大腸桿菌標準菌株(ATCC 25922)，由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動物產(chǎn)品安全監(jiān)測室保存。

1.2 主要試劑藥品 胰蛋白大豆胨肉湯、MH(Mueller-Hinton)肉湯均購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；氯化鈉購自天津市天大化工實驗廠； GoTaq○RGreen Master Mix酶、DNA Marker DL1000購自TaKaRa公司，沙門氏菌血清型快速分型試劑盒(xMAP Salmonella Serotyping Assay RUO Kit)購自美國Luminex 公司。

含有青霉素類(氨芐西林/AM、奧格門丁/A/C)；頭孢類(頭孢噻呋/CEF)；氨基糖苷類(慶大霉素/GM、大觀霉素/SPT)；四環(huán)素類(四環(huán)素/TE、多西環(huán)素/DOX)；氯霉素類(氟苯尼考/FFC)；磺胺類(磺胺異惡唑/SF、新諾明/SXT)；喹諾酮類(恩諾沙星/ENR、氧氟沙星/OFL)；粘桿菌素(CLE)等13種藥物的96孔藥敏板，購自天津市金章科技發(fā)展有限公司。

1.3 主要儀器 生物安全柜(美國NUAIRE公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(美國NUAIRE公司)、快速渦勻器(中外合資深圳南海北有限責任公司)、PCR儀(美國BIO-RAD公司)、Luminex 200液相芯片分析儀(美國Luminex 公司)。

1.4 方法

1.4.1 血清學(xué)鑒定 利用沙門氏菌血清型快速分型試劑盒和Luminex 200液相芯片分析儀對菌株進行血清型鑒定，PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)進行共30個循環(huán)，詳細反應(yīng)組分和反應(yīng)程序見表1。

交聯(lián)沙門氏菌O抗原、H抗原、AT抗原基因的微球需3.75倍稀釋才能使用，稀釋后的微球45 μL加PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL在95 ℃反應(yīng)5 min，52 ℃反應(yīng)30 min，52 ℃保存?zhèn)溆?。在用Luminex 200液相芯片分析儀讀取數(shù)據(jù)前儀器需預(yù)熱至52 ℃，SAPE需稀釋至6 μg/mL，在之前微球和PCR產(chǎn)物反應(yīng)得到的混合物中每個樣加50 μL SAPE，保持52 ℃ 10 min之后進數(shù)據(jù)讀取、分析。

表1 PCR反應(yīng)體系與程序
Tab.1 Reaction systems and procedures of PCR

ReactioncomponentDosageReactiontemperatureReactiontimeQiagenHotsterTaqMasterMix12.5μL95℃Predegeneration15minPrimerPool2.5μL94℃Degeneration30sMoloecularGradeWater8μL48℃Annealing90sDNA模板2μL72℃Extension90s72℃Extension10min

1.4.2 藥敏試驗方法 按照國際通用標準-微量肉湯稀釋法(MIC法)測定298株沙門氏菌對8類13種抗菌藥物最小抑菌濃度。

首先從12mL MH肉湯中吸取100 μL加入藥敏板的空白對照孔中，再挑取新鮮菌落制備0.5麥氏濁度的菌落，吸取10 μL菌液加入12mLMH肉湯中混勻，依次加入藥敏板中，每孔100 μL，以大腸桿菌作為質(zhì)控菌株，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。

結(jié)果判定參照CLSI文件VET01-S2(2013)和M100-S24(2014)標準，在質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度符合規(guī)定的前提下進行結(jié)果判定，凡細菌生長的孔內(nèi)，呈彌散狀混濁或底部有沉淀，無細菌生長的孔內(nèi)所含最低抗菌藥物濃度即為最低抑菌濃度。

2 結(jié) 果

2.1 血清型分型結(jié)果 利用沙門氏菌血清型快速分型試劑盒和Luminex 200液相芯片分析儀進行沙門氏菌的血清分型，能夠準確鑒定出目前所有常見的沙門氏菌血清型，雖然成本較高但方便快捷，準確率高。本實驗中共檢測出9種血清型，分別為德爾卑沙門氏菌(n=78)、鼠傷寒沙門氏菌(n=59)、湯普遜沙門氏菌(n=45)、阿貢納沙門氏菌(n=40)、腸炎沙門氏菌(n=25)、羅米他沙門氏菌(n=18)、策維埃沙門氏菌(n=15)、拉古什沙門氏菌(n=12)、奧里塔蔓林沙門氏菌(n=6)，軟件處理界面如圖1所示，峰值最高的地方對應(yīng)的因子即為該樣品的抗原因子。不同屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌血清型不同，具體見表2。

圖1 Luminex 200軟件處理結(jié)果Fig.1 Result from Luminex 200

表2 不同環(huán)節(jié)血清型個數(shù)統(tǒng)計結(jié)果
Tab.2 Results of serum from different links in slaughter

血清型Serum剝皮前Beforepeeling剝皮后Afterpeeling開膛后Todress劈半前Beforesplitting劈半后Aftersplitting沖洗水Rinsewater屠宰工具Slaughteringtools出庫前Beforeoutbound合計TotalS.Derby1326169625178S.Typhimurium12593344159S.Thompson53937143145S.Agona00111203540S.Enteritidis00000420125S.Lomita3409002018S.Tsevie30000120015S.Lagos20010000012S.Oritamerin321000006

2.2 藥敏試驗結(jié)果

2.2.1 生豬屠宰環(huán)節(jié)整體耐藥結(jié)果 298株沙門氏菌對13種藥物耐藥程度明顯不同，耐藥狀況嚴重，其中對DOX的耐藥程度最高，為97.99%，其次為TE，耐藥率為80.20%；對GM、SPT、SF、SXT、AM耐藥程度在50%左右；對CLE最為敏感，耐藥率僅為2.01%；其次為A/C和OFL，耐藥率分別為2.35%和4.03%；FFC、ENR、CEF的耐藥率分別為30.54%、27.18%、23.49%。整體耐藥率結(jié)果見表3。

298株沙門氏菌多重耐藥(≥2)菌株高達81.88%(244/298)，僅有6株菌對13種藥物均敏感，未出現(xiàn)全部耐藥，以1耐、2耐、7耐、10耐為主，分別DOX、TE-DOX、TE-GM-SPT-DOX-SF-SXT-AM、ENR-TE-GM-SPT-DOX-CEF-FFC-SF-SXT-AM為主導(dǎo)耐藥譜型，優(yōu)勢耐藥譜型為TE-DOX。298株沙門氏菌共產(chǎn)生了46種耐藥譜型，耐藥譜型種類較多，3耐、4耐均產(chǎn)生了7種耐藥譜型，只有2耐僅有1種耐藥譜型，多重耐藥結(jié)果見表4，耐藥譜型統(tǒng)計見表5。

表3 不同屠宰環(huán)節(jié)耐藥率結(jié)果統(tǒng)計
Tab.3 Result of resistance rate of strains from different slaughtering link(%)

抗菌藥物Antimicrobialagents不同屠宰環(huán)節(jié)耐藥率(%)總計(298株)剝皮前Beforepeeling(30株)剝皮后Afterpeeling(37株)開膛后Todress(32株)劈半前Beforesplitting(41株)劈半后Aftersplitting(47株)沖洗水Rinsewater(38株)屠宰工具Slaughteringtools(34株)出庫前Beforeoutbound(39株)耐藥率Resistancerate(%)敏感率Sensitiverate(%)OFL3.330.000.009.7614.890.000.000.004.0372.48ENR3.330.003.1395.1272.347.892.945.1327.1842.28TE93.3397.30100.00100.0097.8771.0532.3546.1580.2019.80CLE6.672.700.000.006.380.000.000.002.0191.28GM46.6789.190.00100.0076.607.8911.765.1344.6355.37SPT60.0097.309.3897.5687.2321.0517.657.6952.0135.23DOX100.00100.00100.00100.00100.00100.0088.2494.8797.990.67CEF0.000.000.00100.0057.450.002.942.9423.4976.17FFC3.330.000.00100.0076.607.8917.655.1330.5464.09SF53.3381.089.38100.00100.0039.4723.5310.2655.0344.97SXT43.3383.789.38100.00100.0039.4723.5310.2654.3645.64AM60.0094.5921.88100.0085.115.2620.5910.2651.6847.65A/C3.330.003.130.0010.640.000.000.002.3539.93

2.2.2 不同屠宰環(huán)節(jié)耐藥結(jié)果 不同屠宰環(huán)節(jié)的菌株對13種藥物的敏感程度存在一定差異，如對CLE，只有剝皮前、剝皮后以及劈半后環(huán)節(jié)的菌株對其有一定程度的耐藥，其余環(huán)節(jié)的菌株均表現(xiàn)為敏感，但是不同屠宰環(huán)節(jié)的菌株對13種藥物均有不同程度的耐藥，且耐藥狀況嚴重，具體結(jié)果見表3。

不同屠宰環(huán)節(jié)菌株多重耐藥狀況不同，除屠宰工具和出庫前環(huán)節(jié)，其余環(huán)節(jié)均出現(xiàn)了0耐藥菌株；而3株12耐菌株僅出現(xiàn)在劈半后；8株1耐菌株4株來自劈半前，4株來自劈半后環(huán)節(jié)；5耐的菌株除了劈半前環(huán)節(jié)未出現(xiàn)，其余環(huán)節(jié)均出現(xiàn)5耐菌株。各屠宰環(huán)節(jié)分別有14、8、7、4、15、7、9、7種耐藥譜型，各環(huán)節(jié)的主導(dǎo)耐藥譜型不同，如剝皮前的菌株為TE-GM-SPT—SF-SXT-AM，開膛后的主導(dǎo)譜型為TE-DOX。

3 討 論

3.1 生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌血清型 本文利用沙門氏菌血清型快速分型試劑盒和Luminex 200液相芯片分析儀進行沙門氏菌的血清分型，298株沙門氏菌的血清型均被確定。共檢測出9種血清型，優(yōu)勢血清型為德爾卑沙門氏菌(n=78)，與侯小剛[3]以及楊保偉等[4]研究中的優(yōu)勢血清型相同。不同屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌菌株的優(yōu)勢血清型不同，剝皮前、剝皮后、開膛后3個環(huán)節(jié)的優(yōu)勢血清型為德爾卑沙門氏菌，劈半前、劈半后、沖洗水、屠宰工具、出庫前的優(yōu)勢血清型各不相同，分別為拉古什、鼠傷寒、湯普遜、腸炎、阿貢納沙門氏菌。不同屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌血清型的顯著差異表明，雖然生豬屠宰環(huán)節(jié)存在嚴重的交叉污染現(xiàn)象，但是每個環(huán)節(jié)中也會有其他來源的沙門氏菌污染，應(yīng)該引起重視，并采取有效措施加以控制，減少其他來源沙門氏菌的污染。

3.2 生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌耐藥性分析 本實驗298株沙門氏菌對DOX的耐藥率最高，為97.99%，顯著高于岳秀英等[5]對四川省豬源沙門氏菌的耐藥性研究中對DOX的耐藥率66.2%，以及張文宇等[6]對大連地區(qū)食源性沙門氏菌研究中豬源沙門氏菌對DOX的耐藥率為66.7%，與寧昆[7]等上海市豬源沙門氏菌對DOX的耐藥率84.62%較接近；其次為對TE的耐藥率為80.20%(239/298)，高于賴海梅[8]等對TE的耐藥率51.39%，低于侯小剛[9]對TE 89.29%的耐藥率。

本研究中，不同屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌對13種藥物的耐藥程度明顯不同，劈半前與劈半后環(huán)節(jié)中沙門氏菌對所有藥物的耐藥率普遍較高，而屠宰工具以出庫前環(huán)節(jié)中沙門氏菌的耐藥率則較低，剝皮后環(huán)節(jié)中沙門氏菌對5種藥物均敏感。不同屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌耐藥性的不同，可以指導(dǎo)減少生豬屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌污染的來源，控制沙門氏菌對豬肉產(chǎn)品的污染，同時具有針對性的科學(xué)合理用藥。298株沙門氏菌的多重耐藥現(xiàn)象嚴重，多重耐藥率達81.88%(244/298)，明顯高于李郁等[11]研究中沙門氏菌64.71%的多重耐藥率。1耐、2耐、7耐、10耐的菌株較多，分別占所有菌株的16.11%、20.13%、15.10%、18.46%，主要是剝皮后、開膛后以及劈半前等環(huán)節(jié)的菌株。

298株沙門氏菌對8類13種抗生素藥物共產(chǎn)生了46種耐藥譜型，多于李郁等[10]2008年沙門氏菌對22種抗生素產(chǎn)生的24種耐藥譜型，以及呂素玲等[11]2010年沙門氏菌對13種藥物產(chǎn)生了24種耐藥譜型，少于周佳等[12]2011年沙門氏菌對25種抗生素共產(chǎn)生了66種耐藥譜型。這些報告與本實驗相比，檢測的抗菌藥物種類較多，但產(chǎn)生的耐藥譜型少，說明本實驗所有菌株對所選13種藥物的抗性比較分散。表明沙門氏菌對抗生素藥物的耐藥譜型種類逐漸增多，耐藥性更加復(fù)雜，涉及抗菌藥物增多，在生產(chǎn)過程中通過食物鏈的傳遞，可能最終影響人類對抗生素藥物的敏感性。

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Resistance and serotype ofSalmonellaisolated from pig slaughtering process in Shandong Province

WANG Juan1, LIU Xian-xian1,2, ZHANG Qian3, ZHAO Jian-mei1, QU Zhi-na1,
HUANG Xiu-mei1,WANG Yu-dong1, ZOU Ming2, WANG Jun-wei1*

(1.LaboratoryofSafetyforAnimalProducts,ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qingdao266032,China;2.QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266109,China;3.HuangdaoEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Qingdao266555,China)

We investigated serotype and resistance ofSalmonelladuring pig slaughtering in Shandong Province, China, providing basic data for the risk assessment ofSalmonellaand for guiding the clinical medication. We used rapid classification kit to identifySalmonellaserotype, adopted broth microdilution method to detect the resistance of 13 kinds drugs belong to 8 categories. Result showed that the identified 9 kinds of serotype were mainlyS.derbyandS.typhimurium. The resistance to 13 kinds drugs of 298Salmonellawere different. The higher percentage of tetracycline drugs as Doxycycline(DOX) and Tetracycline(TE) were 97.99% and 80.20%, respectively, which was most sensitive toColistineE. The resistant rate was only 2.01%, following by Amoxicillin/Clavulanic acid and Ofloxacin which were 2.35% and 4.03%, and the multiple resistant rate was 81.88%. TE-DOX was the regnant drug-resistant spectrum. In conclusion, the predominant serotype ofSalmonellain links of pig slaughtering in Shandong Province isS.derby, and resistance is different to the different drugs. The drug resistance of different slaughter links exist significant differences, multiple drug resistance is serious, and drug-resistant spectrum are varied.

pig; slaughtering;Salmonella; serotype; resistance

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.009

王君瑋，Email:yffs2000@sina.com

1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動物產(chǎn)品安全監(jiān)測室，青島 266032；

2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109；

R378

A

1002-2694(2017)06-0517-05-0517-05

2016-09-28 編輯：李友松

國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估專項(No. GJFP2016 00703)

3.黃島出入境檢驗檢疫局，青島 266555