周偉艷，鄭 劍，葉 碩，沈玄藝，徐景野，許小敏

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寧波市耐三代頭孢菌素志賀菌攜帶β-內(nèi)酰胺酶與基因分型

周偉艷1，鄭 劍1，葉 碩1，沈玄藝1，徐景野1，許小敏2

目的 了解本市耐三代頭孢菌素志賀菌攜帶ESBLs及其基因型，為疾病防控提供依據(jù)。方法 采用直接和增菌培養(yǎng)法，分離患者標(biāo)本中志賀菌；藥敏采用K-B法，ESBLs志賀菌表型確證采用紙片法；CTX-M、OXA、TEM和SHV耐藥基因采用PCR法；耐藥基因分型采用核苷酸序列法，用BLAST分析比較確定基因型別。結(jié)果 藥敏篩檢出69株耐三代頭孢菌素志賀菌，占ESBLs志賀菌的74.19%。檢出CTX-M(CTX-M-1群和CTX-M-9群)、OXA和TEM耐藥基因，檢出率分別為79.71%、79.01%和26.09%，未檢出CTX-M-2群和SHV耐藥基因。DNA序列比對CTX-M-1群以CTX-M-15 型為主，還檢出7個(gè)其它型；CTX-M-9群則以CTX-M-14型多，其它型檢出6個(gè)；49株OXA和18株TEM耐藥基因測序后均為1型(OXA-1型和TEM-1型)。攜帶2種以上耐藥基因的志賀菌21株，占30.43%。結(jié)論 本市志賀菌對頭孢曲松等三代頭孢菌素耐藥率較高，檢出的ESBLs酶型種類多，CTX-M(CTX-M-1群的CTX-M-15 型和CTX-M-9群的CTX-M-14型)是主流酶型，且可同時(shí)攜帶多種耐藥基因，給疾病防控帶來困難。OXA-1型的高攜帶率，提示我們應(yīng)加強(qiáng)分析。B群志賀菌無論是表型的耐藥性，還是耐藥基因檢出率均高于D群志賀菌，該發(fā)現(xiàn)有助志賀菌的擴(kuò)散與流行研究。

志賀菌；耐三代頭孢菌素；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；基因分型

志賀菌是細(xì)菌性痢疾(以下簡稱菌痢)的病原，國內(nèi)外常見的腸道傳染病。由于人群普遍易感,全球每年約有1.65億人發(fā)生該菌感染，危害嚴(yán)重[1]。我國和發(fā)展中國家是菌痢的高發(fā)地區(qū)，嚴(yán)重危害人們的健康與生命。志賀菌的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases, ESBLs)有眾多的酶基因型，是ESBLs志賀菌在全球擴(kuò)散與流行的原因[2]。隨著頭孢菌素類抗菌藥物在治療菌痢的增加，耐三代頭孢菌素的ESBLs志賀菌呈上升趨勢。ESBLs主要有TEM、SHV、CTX-M和OXA等4大類耐藥基因，及數(shù)百個(gè)酶型，且在不規(guī)則使用該類抗菌藥物和抗菌藥物選擇性壓力下產(chǎn)生的酶基因型在不斷增加[3]，給治療帶來困難。為了解寧波市ESBLs志賀菌耐三代頭孢菌素情況和攜帶耐藥基因種類，我們對分離和收集到的志賀菌進(jìn)行耐藥性篩選和耐藥基因檢測與測序分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 253株志賀菌由寧波市感染性腹瀉病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室從病人標(biāo)本中分離或縣級以上醫(yī)院分離后上送，其中男性135例，女性118例，年齡10月齡～92歲，<10歲兒童占61.74%。

1.2 培養(yǎng)基和儀器 GN、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅-美藍(lán)瓊脂為北京陸橋技術(shù)有限公司產(chǎn)品，顯色培養(yǎng)基為鄭州博賽生物制品研究所產(chǎn)品，志賀菌診斷血清為衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所產(chǎn)品；MH瓊脂及抗生素藥敏紙片為英國OXOID公司產(chǎn)品；20E生化鑒定試劑條為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。DNA提取試劑為大連寶生物TaKaRa MiniBEST 細(xì)菌基因組提取試劑盒3.0，均在有效期內(nèi)使用。PCR反應(yīng)試劑均購自大連寶生物公司，PCR擴(kuò)增儀為德國Eppendorf公司的Mastercycler梯度PCR。

1.3 細(xì)菌分離與鑒定 志賀菌檢測采用文獻(xiàn)方法[4-5]進(jìn)行。1)直接分離培養(yǎng): 標(biāo)本接種于SS平板和麥康凱平板或顯色培養(yǎng)基，36±1 ℃培養(yǎng)24 h；2)增菌分離培養(yǎng): 標(biāo)本接種于GN肉湯，36±1 ℃增菌培養(yǎng)8 h,再用上述平板分離。挑取可疑菌落接種于克氏雙糖瓊脂36±1 ℃培養(yǎng)24 h，雙糖管為-/+、H2S-似可疑菌，用營養(yǎng)瓊脂分純，API進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。符合志賀菌生化的菌株，再用診斷血清作玻片凝集，確定血清型。253株志賀菌分為福氏志賀菌(B群)170株，占67.19%、宋內(nèi)志賀菌(D群)83株，占32.81%。

1.4 藥敏篩查ESBLs志賀菌與耐藥基因檢測

1.4.1 藥敏篩查 用K-B紙片法檢測21種常用抗菌藥物篩查耐三代頭孢菌素的志賀菌，質(zhì)控方法和結(jié)果判定參照CLSI(2014)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[6]；ESBLs表型確證采用CLSI推薦的紙片法[7]。質(zhì)控菌株為大場埃希氏菌(ATCC25922)。

1.4.2 耐藥基因檢測 1)引物合成 CTX(CTX-M-1型、CTX-M-2型和CTX-M-9型)、OXA、TEM、SHV的引物序列根據(jù)GenBank，使用軟件Primer 5. 0進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海塞百盛生物工程公司合成。所用引物見表1。2) DNA提取 待檢菌接種營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)過夜，采用TaKaRa公司的MiniBEST細(xì)菌基因組提取試劑盒(3.0)。按說明書操作提取志賀菌基因組DNA。3)PCR擴(kuò)增 采用Premix TapTM試劑盒(2.0)按說明書配置PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增志賀菌耐藥基因。CTX-M(1、2、9群)、SHV、TEM和OXA等耐藥基因的PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃摸板變性1 min，55 ℃退火45 s(SHV為60 ℃退火45 s)，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含0.5 μg/mL溴化乙錠)電壓10V/cm，電泳30 min，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察標(biāo)準(zhǔn)分子量條帶與檢測預(yù)期條帶的分子量大小。

表1 志賀菌耐藥基因PCR引物及產(chǎn)物長度
Tab.1 PCR primers and the length of products for resistance genes ofShigella

基因名稱Gene序列(5'-3')Sequence(5'-3')產(chǎn)物長度(bp)lengthofproductsOXA[8]F:TTTTCTGTTGTTTGGGTTTT610R:TTTCTTGGCTTTTATGCT-TGTEM[9]TEM[9]F:ATAAAATTCTTGAAGACGAAA851R:GACAGTTACCAATGCTTAATCASHV[10]SHV[10]F:ATGCGTTATATTCGCCTGTG477R:GTTAGCGTTGCCAGTGCTCGCTX-M-1群[11]F:ACGCTGTTGTTAGGAAGTGT862R:TTGAGGCTGGGTGAAGTAAGCTX-M-2群[11]F:ACGCTACCCCTGCTATTTAG868R:CAGAAACCGTGGGTTACCTX-M-9群[11]F:AGTGCAACGGATGATGTTC870R:GGCTGGGTAAAATAGGT-CAC

1.4.3 測序與基因分型 PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送上海英駿公司，用ABI3730全自動(dòng)基因分析儀對測序引物擴(kuò)增片段進(jìn)行正反方向核苷酸序列測定，測序結(jié)果進(jìn)行consed拼接，在GenBank(www.ncb.inlm.nih.gov) 用BLAST分析比較后確定擴(kuò)增產(chǎn)物基因型別。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏結(jié)果 253株志賀菌經(jīng)9類20種抗菌藥物耐藥性檢測，除2株B群志賀菌對抗菌藥物全部敏感外，有233株志賀菌耐藥在4～13種之間，以耐4～6類為多，按多重耐藥性定義(同時(shí)耐抗菌藥物≥3類)為多重耐藥菌。耐三代頭孢菌素前三的是頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢他啶，耐藥率分別為53.57%、25.69%和21.74%，未檢出耐碳青霉烯類抗生素的志賀菌。見表2。

表2 B群志賀菌和D群志賀菌耐藥情況
Tab.2 Resistance of group B and group DShigella

抗生素類別AntibioticsCategory抗菌藥物AntimicrobialsB群志賀菌N=170GroupBShigellaN=170D群志賀菌N=83GroupDShigellaN=83志賀菌N=253ShigellaN=253耐藥菌株數(shù)Numberofresistantstrains耐藥率(%)Rateofresistance(%)耐藥菌株數(shù)Numberofresistantstrains耐藥率(%)Rateofresistance(%)耐藥菌株數(shù)Numberofresistantstrains耐藥率(%)Rateofresistance(%)青霉素類Penicillins氨芐西林Ampicillin15088.246072.2921083.00哌拉西林Piperacillin10762.945768.6716464.82酶復(fù)合制劑Enzymeinhibitorcomplex氨芐西林/舒巴坦Ampicillin/sulbactam4425.8811.203614.22頭孢類Cephalosporins頭孢吡肟Cefepime2615.291012.05239.09頭孢曲松Ceftriaxone10561.764959.0415460.87頭孢他啶Ceftazidime8348.823542.1711846.64頭孢噻吩Cephalosporin14786.476881.9221584.98頭孢噻肟Cefotaxime13881.186578.3120380.24頭孢哌酮Cefoperazone7745.292125.309838.74頭孢唑林Cefazolin14685.884655.4219235.89單環(huán)內(nèi)酯胺類Monobactams氨曲南Aztreonam6638.823238.559838.74四環(huán)素類Tetracyclines四環(huán)素Tetracycline15691.765667.5021283.79強(qiáng)力霉素Doxycycline14484.714351.8118874.31喹諾酮類Quinolones萘啶酸Nalidixicacid16094.117387.9523392.09環(huán)丙沙星Ciprofloxacin4325.2944.824718.58諾氟沙星Norfloxacin6135.8833.616425.30氧氟沙星Ofloxacin4928.8211.205019.76氯霉素類Chloramphenicols氯霉素Chloramphenicol11366.47910.8412147.83碳青霉烯類Carbapenems亞胺培南Imipenem000000葉酸代謝抑制劑Folatemetabolisminhibitor復(fù)方SMZCompoundsulfamethoxazole11467.066375.9017769.96

2.2 產(chǎn)酶情況 對233株多重耐藥志賀菌經(jīng)紙片確認(rèn)，證實(shí)93株為產(chǎn)ESBLs志賀菌，檢出率為39.91%，其中B群志賀菌76株，占32.62%，D群志賀菌17株，占7.30%。屬耐三代頭孢菌素的69株，占ESBLs志賀菌的74.19%。

2.3 耐藥基因分布 69株耐三代頭孢菌素志賀菌中檢出CTX-M(CTX-M-1群和CTX-M-9群)、OXA和TEM耐藥基因，未檢出CTX-M-2群和SHV耐藥基因，攜帶率以CTX-M基因(CTX-M-1群和CTX-M-9群)最高，占79.71%；OXA耐藥基因次之。見表3。耐藥基因陽性產(chǎn)物測序后, 與GenBank的blast比對，CTX-M-1群以CTX-M-15 型為主(26/69)，其它酶型包括CTX-M-3型(7株)、CTX-M-55型(5株)、CTX-M-79型(4株)、CTX-M-22型(4株)、CTX-M-5型(3株)、CTX-M-64型(3株)、CTX-M-123型(1株)；CTX-M-9群以CTX-M-14型為主(32/69)，其它酶型包括CTX-M-24型(15株)、CTX-M-27型(4株)、CTX-M-19型和CTX-M-21型(各2株)、 CTX-M-16型和CTX-M-13型(各1株)。49株OXA和18株TEM耐藥基因測序后均為1型(OXA-1型和TEM-1型)。攜帶兩種以上耐藥基因的志賀菌21株，占30.43%，分別是CTX-M-1群(CTX-M-15型)+TEM-1型5株，占7.25%；OXA-1型+CTX-M-1群(CTX-M-15型)4株，占5.80%；CTX-M-9群(CTX-M-14型)+TEM-1型7株，占10.14%；OXA-1型+CTX-M-9群 (CTX-M-14型) 5株，占7.25%。

表3 69株耐三代頭孢菌素志賀菌檢出耐藥性基因情況
Table 3 The detection of resistance genes from 69 strains of the third-generation cephalosporins-resistantShigella

血清群Sero-group檢測株數(shù)No.ofdetectedstrainsCTX-M-1CTX-M-2CTX-M-9OXATEMSHV+%+%+%+%+%+%B群GroupB552036.36002743.644276.361730.9100D群GroupD14321.4300535.71750.0017.1400合計(jì)692333.33003246.374979.011826.0900

3 討 論

國內(nèi)外細(xì)菌耐藥性監(jiān)測顯示志賀菌的耐藥性在增強(qiáng)，多重耐藥菌ESBLs株越來越多，耐第三代頭孢菌素志賀菌明顯增多[12]，這可能是不規(guī)則用藥和各領(lǐng)域廣泛使用抗菌藥物的結(jié)果，而志賀菌通過自身多機(jī)制協(xié)同獲得耐藥也是增強(qiáng)的原因。藥敏檢測顯示有92.09%(233/253)的志賀菌為多重耐藥菌，菌株對抗菌藥物的耐藥性較強(qiáng)，對頭孢曲松等三代頭孢菌素耐藥率高達(dá)53.57%(133/253),其中ESBLs株36.76%(93/253)，產(chǎn)酶率74.19%(69/93)，耐藥譜幾乎覆蓋了除耐碳青霉烯以外的所有抗生素,其耐藥性有超過大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細(xì)菌的趨勢[13]，由此可見我市志賀菌耐藥的嚴(yán)重性，應(yīng)引起我們的高度重視。此外，還發(fā)現(xiàn)耐藥性與菌株的血清型存在關(guān)聯(lián)，D群志賀菌無論是耐藥種類，還是ESBLs株數(shù)均明顯低于B群志賀菌，其原因有待進(jìn)一步探討。

志賀菌對三代頭孢菌素的耐藥是由質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生，可水解滅活頭孢菌素類等多種抗生素，其ESBLs流行酶型與各地使用抗生素種類有關(guān)，且耐藥基因的種類在增加中[14]。從69株耐三代頭孢菌素志賀菌中檢出了CTX-M(CTX-M-1群、CTX-M-9群)、TEM和OXA三類耐藥基因，檢出率分別為79.71%、79.01%和26.09%，其中有30.43%(21/69)的志賀菌攜帶二種以上耐藥基因，表明本市志賀菌具有攜帶多種耐藥基因能力,可通過多種耐藥傳播機(jī)制或渠道獲得，其復(fù)雜性有待進(jìn)一步研究。CTX-M耐藥基因自1995年擴(kuò)散以來，迅速成為全球流行最廣的ESBLs基因型。在我國以CTX-M-9群最為多見，并從北京、河北等地的志賀菌中分離到多種CTX-M。檢測顯示本市志賀菌耐藥流行優(yōu)勢酶型以CTX-M(CTX-M-1群、CTX-M-9群)為主，OXA為輔，與國內(nèi)外報(bào)道的以CTX-M 為主結(jié)論一致，但不同于TEM 和SHV為輔的結(jié)論[15]。陽性產(chǎn)物測序與GenBank Blast比對顯示，CTX-M-1群以CTX-M-15型為主，還檢出了CTX-M-3等其它7個(gè)型；CTX-M-9群以CTX-M-14型為主，檢出了CTX-M-24等其它6個(gè)型。前者與北京地區(qū)報(bào)道相同[16]，后者亞型與俞云松等一致[17]，是我市志賀菌中流行優(yōu)勢酶基因型的代表型。同時(shí)，有30.43%(21/69)耐三代頭孢菌素志賀菌攜帶兩種及以上耐藥基因，反映了我市志賀菌的攜帶耐藥基因的多樣性與復(fù)雜性，合理、規(guī)范地使用抗菌藥物，是減少志賀菌耐藥性的關(guān)鍵。耐藥基因比較結(jié)果顯示CTX-M-15型與CTX-M-3型的序列僅有一個(gè)氨基酸的差別(Asp240→Gly的替換)，卻能增強(qiáng)志賀菌對頭孢他啶的催化能力；CTX-M-64型是CTX-M-14型和CTX-M-15型的嵌合體，對三代頭孢菌素增加了水解活性[18]，提高了志賀菌的耐藥性。

OXA耐藥基因具有較強(qiáng)的擴(kuò)散能力，也是引起頭孢類抗菌藥物耐藥的重要原因，有些亞型對碳青霉烯類抗菌藥物有較高的活性，更引起人們的關(guān)注。以往該基因很少從產(chǎn)ESBLs志賀菌中檢出，主要存在于銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中[19]。檢測發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs志賀菌攜帶OXA-1型耐藥基因高達(dá)79.01%，高于苗元等報(bào)道的25.3%志賀菌攜帶OXA-1型耐藥基因[20]，且對氨芐西林等青霉素類抗菌藥物的耐藥性較高，符合OXA耐藥特征。其檢出率僅次于CTX-M，也是本地志賀菌主要的流行耐藥酶型，與OXA不屬于志賀菌主要耐藥酶型的結(jié)論不同[21]，在國內(nèi)較少見報(bào)道，我們應(yīng)加強(qiáng)檢測與分析，有利于發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類的新亞型。在分子水平上OXA耐藥基因可分為五個(gè)組，志賀菌的OXA耐藥基因?qū)俚贗II組，主要包括OXA-1、OXA-4、OXA-30和OXA-31等型。42株攜帶OXA耐藥基因志賀菌的陽性產(chǎn)物經(jīng)測序分析均為OXA-1型，無其它型別，顯示本市攜帶OXA耐藥基因志賀菌的主要流行型是OXA-1，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]。此外，存在不同血清群志賀菌攜帶OXA耐藥基因有所差別的現(xiàn)象。B群志賀菌有76.36%(42/55)的菌株攜帶率，高于D群志賀菌的50.00%(7/14)，應(yīng)進(jìn)一步探討血清學(xué)與耐藥性的相關(guān)性。

本次檢測的TEM耐藥基因是產(chǎn)ESBLs志賀菌中檢出率最低的(18/69)，經(jīng)測序分型全部為TEM-1型，與國內(nèi)TEM耐藥基因流行型一致[23]。其耐藥性是通過酶活性中心附近的編碼基因發(fā)生1個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，形成一系列酶蛋白衍生物，影響底物識別和形成速率，進(jìn)而影響到酰基酶的水解，從而拓展了對頭孢類抗菌藥物的特異性，突變所在的活性位點(diǎn)不同，造成不同的耐藥譜，仍有待我們繼續(xù)關(guān)注與檢測。TEM-1型耐藥基因雖不是導(dǎo)致志賀菌對三代頭孢菌素耐藥的主要原因，但可協(xié)助菌株增強(qiáng)耐藥性。并且該耐藥基因是革蘭陰性菌中最常見的傳統(tǒng)β-內(nèi)酰胺酶，也是引起醫(yī)院感染細(xì)菌暴發(fā)疫情的主要酶型，應(yīng)引起我們的關(guān)注。SHV耐藥基因的特征與TEM耐藥基因相似，都是傳統(tǒng)的β-內(nèi)酰胺酶，有許多亞型，曾在國內(nèi)仍至亞洲發(fā)生過流行，本次雖未檢出，尚須加強(qiáng)檢測與防范。

總之，本市志賀菌攜帶多種產(chǎn)ESBLs耐藥基因，在表型上表現(xiàn)出較強(qiáng)耐藥性。共檢出CTX-M(CTX-M-1群和CTX-M-9群)、OAX、TEM三群耐藥基因，檢出率較高。測序發(fā)現(xiàn)CTX-M(CTX-M-1群和CTX-M-9群)耐藥基因的型別多樣，以CTX-M-15型和CTX-M-14型為主流酶型，其菌株的耐藥基因是在質(zhì)粒上編碼，可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座和接合轉(zhuǎn)移等多種方式在志賀菌內(nèi)或不同細(xì)菌間傳遞，造成產(chǎn)ESBLs志賀菌的擴(kuò)散與流行。不同血清群志賀菌無論是表型的耐藥性，還是攜帶耐藥基因，均為B群高于D群志賀菌，這對細(xì)菌耐藥的流行防控具有重要意義。因此，在日常檢測中應(yīng)加強(qiáng)對志賀菌的耐藥性監(jiān)測，及時(shí)分析，為臨床合理治療、科學(xué)用藥提供幫助，杜絕不規(guī)范用藥，以減少菌痢的發(fā)生。

[1] Mandomando I, Jaintilal D, Pons MJ, et al. Antimicrobial susceptibility and mechanisms of resistance inShigellaandSalmonellaisolates from children under five years of age with diarrhea in rural Mozambique[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 5(6): 2450-2454. DOI: 10.1128/AAC.01282-08

[2] Nguyen TV, Le PV, Le CH, et al. Antibiotic resistance in diarrheagenicEscherichiacoliandShigellastrains isolated from children in Hanoi, Vietnam[J]. Antinicrob Agents Chanother, 2005, 49(2): 816-819. DOI: 10.1128/AAC.49.2.816-819.2005

[3] Tan WB. Advances in genetic mechanism of bacteria resistance[J]. J Patho Biol, 2009, 4(7):543-544.(in Chinese)

譚文彬. 細(xì)菌耐藥的基因機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國病原生物雜志,2009,4(7):543-544.

[4] Ye YW, Wang YS, Shen ZY. National Guide To Clinical Laboratory Procedures[M].The third edition. Nanjing: Southeast University Press, 2003:822-823.(in Chinese)

葉應(yīng)嫵,王毓三,申子喻.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].3版.南京:東南大學(xué)出版社, 2003: 822-823.

[5] Ministry of Health of the PRC. WS 287-2008 The diagnostic criteria of bacterial and amebic dysentery[S]. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2009. (in Chinese)

中華人民共和國衛(wèi)生部. WS 287-2008細(xì)菌性和阿米巴性痢疾診斷標(biāo)準(zhǔn)[S]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2009.

[6] CLSI. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; Approved standard[S]. 14th ed. Wayne: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014.

[7] Clinical and Laboratory Standards Institute.M100-S20 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；twentieth informational supplement[S].Wayne: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014.

[8] Ashraf M, Furuta AK, Shimomura K, et al. Genetic characterization of multidrug resistance inShigellaspp. from Japan[J]. J Med Microbiol, 2006, 55(pt12): 1685-1691. DOI: 10.1099/jmm.0.46725-0

[9] Wang Y, Xu YC, Yang QW, et al. The research on TEM-type-β-lactamases among clinical isolates ofEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniain nineteen hospitals[J]. J Clinic Lab Sci,2008,26(2)：85-89.(in Chinese)

王瑤,徐英春,楊啟文,等.19家醫(yī)院大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中TEM型β-內(nèi)酰胺酶的研究[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2008,26(2)：85-89.

[10] Woodfond N. Rapid characterization of beta-lactamases by multiplex PCR[J]. Methods Mol Biol, 2010, 64(2): 181-192.

[11] Eckert C, GautierV, Saladin-Allard M, et al. Dissemination of CTX-M-type-lactamases among clinical isolates of Enterobacteriaceae in Paris, France[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(4): 1249-1255. DOI: 10.1007/978-1-60327-279-7_14

[12] Fu YM, Zhang WL, Xu JF, et al. Analysis of CTX-M genotype and resistance of extended-spectrum β-lactamase-producing isolates ofKlebsiellapneumonia[J]. J Harbin Medical Univ, 2006,40(6):433-436.(in Chinese)

付英梅,張文莉,許建豐,等. 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌CTX-M基因型和耐藥性分析[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2006,40(6):433-436.

[13] Zhu DA, Sun JY, Fan HQ, et al. The resistance ofShigellaand the genotype screening of extended-spectrum β-lactamase in Shanghai[J]. Chin J Infect Chemother, 2009, 9(2): 126-129.(in Chinese)

朱東安,孫景勇,范惠清,等.上海地區(qū)志賀菌耐藥性及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因分型[J].中國感染與化療雜志,2009,9(2):126-129.

[14] Mandomando I, Jaintilal D, Pons MJ, et al. Antimicrobial susceptibility and mechanisms of resistance inShigellaandSalmonellaisolates from children under five years of age with diarrhea in rural Mozambique[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(6): 2450-2454. DOI: 10.1128/AAC.01282-08

[15] Fankhauser C, Zingg W, Francois P, et al. Surveillance of extended spectrum deta lactamase producingEnterobacteriaceaein a Swiss tertiary care hospirtal[J]. Swiss Med Wkly, 2009, 139(51-52): 747-751.

[16] Bao CM, Guo TS, Cui EB, et al. The research for the distribution of resistant genes of ESBLs-producing isolates ofShigellasonnei[J]. Military Med, 2011, 35(2):122-127.(in Chinese)

鮑春梅,郭桐生,崔恩博,等,產(chǎn)ESBLs宋內(nèi)志賀菌耐藥基因分布研究[J]．軍事醫(yī)學(xué),2011,35(2):122-127.

[17] Yu YS, Ji SJ, Chen YG. Advances of producing CTX-type extended spectrum beta-lactamase[J]. Clinic Microbiol Anti-infect Forum, 2004, 10.(in Chinese)

俞云松,季淑娟,陳亞崗. 產(chǎn)CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶研究進(jìn)展. 臨床微生物與抗感染論壇, 2004, 10.

[18] Nagano Y, Nagano N, Wachino J, et al. Novel chimeric beta-lactamase CTX-M-64, a hybrid of CTX-M-15-Like and CTX-M-14 beta-lactamases, found in aShigellasonneistrain resistant to various oxyimino-cephalosporins, including ceftazidime[J]. Antinicrob Agents Chemother, 2009, 53(1): 69-74. DOI: 10.1128/AAC.00227-08

[19] Weldhagen G, Poirel L, Nordmann P. Ambler class A extended-spectrum beta-lactamases inPseudomonasaeruginosa: novel developments and clinical impact[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47: 2385-2392

[20] Miao Y, Lu LX, Wu BH, et al. The research on resistant characteristics of OXA-1-type extended-spectrum beta-lactamase-carrying isolates ofShigellain Beijing[J]. Hebei Med, 2014, 36(7): 1081-1082.(in Chinese)

苗元,盧立新,吳本和,等.北京地區(qū)攜帶OXA-1型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶志賀菌耐藥特點(diǎn)研究[J].河北醫(yī)藥,2014,36(7):1081-1082.

[21] Ji WJ, Xu XW, Dong F. The research on genotype and resistance of extended-spectrum beta-lactamase-producing isolates ofShigellafrom pediatric [J]. J Microbiol Immunol, 2010, 30(5): 472-476.(in Chinese)

紀(jì)文靜，徐樨巍，董方．兒科產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶志賀菌的基因型和耐藥性研究．中華微生物和免疫學(xué)雜志,2010,30(5): 472-476.

[22] Zhang CL, Liu QZ, Wang J, et al. Epidemic and virulence characteristic ofShigellaspp. with extended-spectrum cephalosporin resistance in Xiaoshan District, Hangzhou, China[J]. BMC Infect Dis,2014,14:260.DOI: 10.1186/1471-2334-14-260

[23] Guo P, He XS, Mei CZ, et al. Detection of Beta lactamase and integron genes in 242 strains ofKlebsiellapneumoniaisolated in a hospital from 2012 to 2013[J]. Chin J Zoonoses, 2015, 31(5): 437-440. (in Chinese)

郭普, 賀曉珊, 梅傳忠,等. 某醫(yī)院2012-2013年242株肺炎克雷伯菌β-內(nèi)酰胺酶及整合子耐藥基因檢測[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)2015, 31(5): 437-440.

Gene typing of ESBLs-producing third-generation cephalosporins-resistantShigellain Ningbo, China

ZHOU Wei-yan, ZHENG Jian, YE Shuo, SHEN Xuan-yi, XU Jing-ye, XU Xiao-min

(NingboMunicipalCenterforDiseasesPreventionandControl,Ningbo315010,China)

We investigated the third-generation cephalosporins-resistantShigellaand its genotype in Ningbo, China, providing a basis for disease prevention and control. Pathogenic bacteria were analyzed by direct isolation combined with enrichment culture isolation. Antimicrobial susceptibility was determined by K-B disk diffusion method and PCR was used for detecting multidrug resistance genes likeCTX-M,OXA,TEMandSHV. BLAST analysis was used to determine the genotype. Results showed that 69 strains of third-generation cephalosporins-resistantShigellawere detected by drug sensitivity screening, accounting for 74.19% of ESBLsShigella. Drug resistance geneCTX-M(CTM-M-1 andCTM-M-9),OXAandTEMwere detected. The detection rate were 79.71%, 79.01% and 26.09% respectively.With noCTX-M-2 andSHV, DNA sequence alignment showedCTX-M-1 group were mainly ofCTX-M-15 type besides seven other types;CTX-M-9 group were mainly ofCTX-M-14 type besides six other types; 49 strains ofOXAand 18 strains of TEM were sequenced to be type 1 (OXA-1 andTEM-1 type). The 21Shigellastrains carrying more than two drug resistance genes accounts for 30.43%.Shigellain Ningbo has high third-generation cephalosporins-resistance rate and many kinds of ESBLs enzymes were detected. The mainstream enzyme type was CTX-M，meanwhile they also carried a variety of drug resistance genes, which could bring difficulties to disease prevention and control. The high carrying rate of OXA-1 type suggests that we should pay more attention. The detection rate of group B was higher than that of group D, including not only the phenotype resistance but also the drug-resistance genes; these findings will be useful in the study of the drug resistance prevalence ofShigella.

Shigella; third-generation cephalosporins-resistant; ESBLs; gene typing

Xu Xiao-min Email: xjl19990802@sina.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.014

許小敏，Email：xjl19990802@sina.com

1.寧波市疾病預(yù)防控制中心，寧波 315010； 2.寧波市第二醫(yī)院，寧波 315010

R378

A

1002-2694(2017)06-0542-06

2017-01-12 編輯：李友松

寧波市重大(重點(diǎn))項(xiàng)目(No.2013C51014)和寧波市優(yōu)秀中青年衛(wèi)生技術(shù)人才項(xiàng)目(No.2011145)聯(lián)合資助

Supported by the Major (Key) Project of Ningbo (No.2013C51014);and the health Technical Personnel Project of Excellent Young and Middle-aged in Ningbo(No.2011145)