郎曉輝，鐘進義，孫曉虹，嚴吉峰，周佳靜

（1.山東省煙臺護士學校，山東 煙臺 264000；2.青島大學醫(yī)學院，山東 青島 266021；3.煙臺市中醫(yī)醫(yī)院，山東 煙臺 265699）

海藻色素糖蛋白對胃癌細胞抑制作用的體內(nèi)外研究

郎曉輝1，鐘進義2，孫曉虹1，嚴吉峰1，周佳靜3

（1.山東省煙臺護士學校，山東 煙臺 264000；2.青島大學醫(yī)學院，山東 青島 266021；3.煙臺市中醫(yī)醫(yī)院，山東 煙臺 265699）

目的 觀察麒麟菜海藻色素糖蛋白（SPG）對胃癌細胞增殖活性的抑制作用。方法 將不同濃度SPG與人MGC803胃癌細胞共同培養(yǎng)，用四甲基偶氮噻唑藍（MTT）法測定胃癌細胞增殖活性。將SPG經(jīng)口給予皮下接種MFC細胞株的小鼠，10天后取胃癌組織，用MTT法測定不同劑量組小鼠胃癌細胞的增殖活性，免疫組化法檢測不同劑量組小鼠胃癌細胞內(nèi)PCNA蛋白的表達。結(jié)果 體外實驗結(jié)果顯示高劑量SPG組與腫瘤對照組48h細胞增殖活性分別為0.531±0.008和0.857±0.011，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示高劑量SPG組細胞增殖活性及PCNA蛋白陽性表達率分別為0.698±0.028和16.30%，腫瘤對照組分別為1.122±0.032和62.06%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 SPG對胃癌細胞增殖活性有抑制作用。

海藻色素糖蛋白（SPG）；胃癌細胞；增殖活性

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 細胞株與實驗動物

人MGC803胃癌細胞株、MFC細胞株購自上海研域生物科技有限公司；昆明種健康小鼠由山東魯抗醫(yī)藥實驗中心提供，每只體重18～20 g，本實驗室內(nèi)適應性喂養(yǎng)一周。

1.2 實驗樣品

SPG是從新鮮干燥麒麟菜中以乙醇浸提法制取，由本實驗室自行制備，經(jīng)紫外分光光度法測定，純度＞90%。

1.3 試劑與儀器

PCNC多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供；RPMI1640培養(yǎng)基、四甲基偶氮噻唑藍（MTT）和胎牛血清為美國GiBco公司產(chǎn)品；Rosys Anthos2010自動型酶標儀是瑞典產(chǎn)；Olympus XDS-1B型倒置顯微鏡為日本產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 體外實驗

用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基將處于對數(shù)生長期的MGC803人胃癌細胞配成瘤細胞密度為5×105/mL的細胞懸液，以每孔100 uL的量接種于96孔培養(yǎng)板上。空白對照組加入等量雙蒸水，高、中、低劑量組分別加入濃度為50、100、200 mg/L的SPG，各組均設(shè)置3個平行樣本。放置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入MTT等試劑待其反應，經(jīng)自動酶標儀于490 nm處測定吸光度（A）值，而后求取吸光度（A）的平均值，用平均A值表示各組細胞增殖活性，細胞增殖抑制率=（空白對照組A值-實驗組A值）/空白對照組A值×100%[3]。

1.4.2 體內(nèi)實驗

用生理鹽水調(diào)整MFC細胞濃度為1×107/mL，于健康昆明種小鼠右側(cè)腋窩處進行皮下接種，每只接種量為0.2 mL，共接種40只，于接種后24 h，將40只小鼠隨機分為4組，每組10只，雌雄各半，分別為腫瘤對照組及高、中、低劑量SPG組。每日上午10時經(jīng)口灌胃一次，腫瘤對照組給予生理鹽水，高、中、低劑量SPG組則分別50、100、200 mg/kg的SPG溶液，連續(xù)10天，末次給藥24 h后脫頸椎處死小鼠，對小鼠瘤組織于無菌條件下進行剝離，用1.4.1中方法測定培養(yǎng)24 h后的胃癌細胞增殖活性，用免疫組化法檢測小鼠瘤組織中PNCA蛋白的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 體外實驗結(jié)果

200和100 mg/L SPG組，培養(yǎng)48 h的細胞增殖活性分別為0.531±0.008和0.613±0.021，空白對照組為0.857±0.011，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），各組間差異具有顯著性。見表1。

表1 SPG對MGC803人胃癌細胞增殖活性影響的體外實驗結(jié)果（±s）

表1 SPG對MGC803人胃癌細胞增殖活性影響的體外實驗結(jié)果（±s）

注：與空白對照組比較 α P＜0.05，與高劑量組比較β P＜0.05

38.04 28.47 7.58 -組別吸光度A值 抑制率（%）高劑量組中劑量組低劑量組空白對照組0.531±0.008α0.613±0.021α,β0.792±0.003α,β0.857±0.011

2.2 體內(nèi)實驗結(jié)果

2.2.1 小鼠MFC胃癌細胞增殖活性

高劑量SPG組為0.698±0.028，腫瘤對照組為1.122±0.032，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 SPG對小鼠胃癌細胞增殖活性影響的體內(nèi)實驗結(jié)果（±s）

表2 SPG對小鼠胃癌細胞增殖活性影響的體內(nèi)實驗結(jié)果（±s）

注：與腫瘤對照組比較α P＜0.05，與高劑量組比較βP＜0.05

37.79 27.54 7.13 -組別吸光度A值抑制率（%）高劑量組中劑量組低劑量組腫瘤對照組0.698±0.028α0.813±0.020β1.042±0.069 1.122±0.032

2.2.2 PNCA蛋白表達結(jié)果

增殖細胞核抗原PCNA，呈棕黃色顆粒，在細胞核內(nèi)表達。實驗結(jié)果顯示高劑量SPG組的胃癌細胞內(nèi)PNCA蛋白呈陽性表達的細胞數(shù)少，染色多淺淡；腫瘤對照組的胃癌細胞內(nèi)PNCA蛋白呈陽性表達的細胞數(shù)多，染色大多濃重。高劑量SPG組和腫瘤對照組胃癌細胞內(nèi)PNCA則分別為16.48%和62.06%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），兩者差異具有顯著性。見表3。

表3 瘤細胞PNCA蛋白的陽性表達率（%）

3 討 論

海藻色素糖蛋白（Seaweed pigment glycoprotein，SPG）是海藻中一種硫酸多糖與藻膽蛋白天然結(jié)合的色素糖蛋白。近年來有研究表明其具有抗腫瘤、抗氧化等生物學活性。本研究采用體內(nèi)實驗與體外實驗相結(jié)合的方法，觀察其對胃癌細胞增殖的影響。

本研究用四甲基偶氮噻唑藍（MTT）法測定細胞增殖活性水平，其吸光度A值與細胞的代謝活性成正比。體內(nèi)外實驗結(jié)果均顯示：SPG組吸光度A值較之腫瘤對照組低，統(tǒng)計分析差異有顯著性，且存在劑量反應關(guān)系，高劑量組更低于中劑量組，說明SPG對胃癌細胞增殖活性具有一定的抑制作用。

增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）在細胞核內(nèi)表達，是DNA合成過程中多聚酶的輔助蛋白，其表達狀況可以反映細胞增殖狀態(tài)[7]。PCNA表達的強弱與DNA合成活躍度呈正比關(guān)系，PCNA表達越強，說明DNA合成越活躍，PCNA表達減弱，說明DNA合成減弱。本研究體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，SPG組PCNA表達的陽性率較之腫瘤對照組低，統(tǒng)計分析差異有顯著性，且存在劑量反應關(guān)系，高劑量組低于中劑量組，中劑量組低于低劑量組，說明SPG具有抑制胃癌細胞增殖的作用。

綜合本次研究的體內(nèi)外實驗結(jié)果：SPG在降低胃癌細胞的增殖活性和PCNA蛋白表達水平方面有作用。本研究中實驗數(shù)據(jù)顯示的結(jié)果與之前文獻報道的有關(guān)藻膽蛋白可抑制腫瘤細胞增殖活性的實驗結(jié)果相一致。

[1] 鐘進義,等.海藻光敏色素糖蛋白對乳腺癌細胞侵潤轉(zhuǎn)移的抑制作用及信號調(diào)控的研究[A].中國環(huán)境誘變劑學會.中國科學技術(shù)協(xié)會第十屆年會21分會場論文匯編[C].中國環(huán)境誘變劑學會:2008:5.

[2] 楊 青,等.海藻色素糖蛋白對肝癌細胞Caspase-3和Bax蛋白表達的影響(英文)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2011,(09):1771-1774.

[3] 郎曉輝,等.明日葉查爾酮對小鼠H22肝癌細胞增殖活性的抑制作用[J].生態(tài)毒理學報,2011,(03):261-264.

本文編輯：趙小龍

R735.7

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ISSN.2095-8242.2017.21.4021.02