杜歡歡，蔡艷妮，江 海，2，3，宋可盈

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000；4.武漢市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)第一中學(xué)，湖北 武漢 430056)

超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜同時測定茶葉中的8種有效物質(zhì)

杜歡歡1，蔡艷妮1，江 海1，2，3，宋可盈4

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000；4.武漢市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)第一中學(xué)，湖北 武漢 430056)

建立了一種同時測定茶葉中8種有效成分(兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、茶氨酸、咖啡因)的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇水浴提取，采用Waters ACQUITY BEH C18色譜柱分離，串聯(lián)四級桿質(zhì)譜多反應(yīng)離子監(jiān)測測定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，8種有效成分在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.991，平均回收率(n=5)在94.7%±5.2%～104.7%±6.1%之間。方法的檢出限在3.0～60.0 ng/mL之間，定量限在6.0～200.0 ng/mL之間。

超高效液相色譜； 質(zhì)譜； 兒茶素； 咖啡因； 茶氨酸； 分析檢測

茶(Camelliasinensis)，屬于山茶科，為常綠灌木或小喬木植物，植株高達1～6 m。茶樹喜歡濕潤的氣候，在中國長江流域以南地區(qū)廣泛栽培。茶樹葉子制成茶葉，泡水后便可使用，是傳統(tǒng)的保健飲品，世界三大飲料之一，在我國有悠久的使用歷史[1]。三皇五帝時代便有神農(nóng)以茶解毒的故事，唐·陸羽《茶經(jīng)》：“茶之為飲，發(fā)乎神農(nóng)氏”。明《本草綱目》記載：“茶苦而寒，陰中之陰，最能降火”，能清熱解暑、消食化痰、生津止渴、降火明目[2]。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，茶中富含茶多酚、咖啡堿、氨基酸、多糖等生物活性物質(zhì)[3-4]，具有降血壓、降血糖、預(yù)防動脈粥樣硬化、抗菌消炎、利尿止痢等臨床藥理作用，同時具有抗氧化、抗衰老、助消化、緩解疲勞等保健功效[5-8]。準(zhǔn)確對茶葉中有效成分的分析檢測對茶葉鑒定、茶葉品質(zhì)評價、茶樹選育、茶葉深加工、茶產(chǎn)品開發(fā)等方面具有重要意義。

目前茶葉中有效成分的檢測方法主要有分光光度法[9]、高效液相色譜-紫外法[10-14]、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法[15]、滴定法[16]、近紅外光譜分析法[17]、核磁共振法(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)[18]、毛細管電泳法[19]及流動注射分析法[20]等。高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)具有分離度好、準(zhǔn)確度高的特點，是目前檢測兒茶素、咖啡因、茶氨酸應(yīng)用最廣泛、技術(shù)最成熟的方法。但高效液相色譜法在分析茶葉中有效成分的過程中存在速度慢、結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似的組分分離度低、一次進樣分離組分少等不足。超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜相較于高效液相色譜具有分析速度快、分離度高、檢測限低、分析準(zhǔn)確、檢測樣品種類多等特點。本文采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜建立一種同時分析茶葉中8種有效成分的分析方法，旨在為陜西茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、乙腈(色譜純，F(xiàn)isher/飛世爾)、甲醇(色譜純，MERCK默克公司)；兒茶素(Catechin，C)、表兒茶素(Epicatechin，EC)、表沒食子兒茶素(Epigallocatechin，EGC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(Gallocatechingallate，GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechingallate，ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechingallate，EGCG)、茶氨酸(L-Theanine)、咖啡因(Caffeine)等8種標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物，純度均不低于99%)。

茶葉樣品為陜西省漢中市市售綠茶，粉碎，過60目分樣篩，備用。

1.2 儀器設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜(Waters UPLC-TQD，美國Waters公司)；電噴霧離子源；MILLI-Q純水機(美國Millipore公司)；電子天平AUD220D(十萬分之一，日本島津公司)；ZN-02中草藥粉碎機(北京興時利和科技發(fā)展公司)；H-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器公司)，離心機(湖南湘儀)。

表1 UPLC流動相梯度程序

1.3 液相色譜分析條件

液相色譜的色譜柱為ACQUITY BEH C18柱(50.0 mm×2.5 mm，粒徑1.7 μm)，流速為250 μL/min，柱溫為30 ℃，進樣體積為5 μL。流動相選擇的A是乙腈，B是體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸，流動相梯度見表1。

1.4 質(zhì)譜分析條件

質(zhì)譜分析的離子源為電噴霧正離子源(ESI+)，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，離子源溫度為120 ℃，去溶劑氣流量為500 L/hr，溶劑氣溫度為300 ℃。

1.5 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取0.50 g均勻磨碎的茶葉樣品放入三角燒瓶中，加入70 ℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲醇水溶液25.0 mL，稱定質(zhì)量。用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，立即移?0 ℃水浴中，浸提10 min，用濾紙擦干燒瓶表面后，再次稱定質(zhì)量，不足部分用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇水溶液補足，3000 r/min離心，取上清液5.0 mL，用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇水溶液定溶于10 mL容量瓶，用0.22 μm濾膜過濾，待測[14]。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取8種茶葉有效成分標(biāo)準(zhǔn)品：

C為2.40 mg； Caffeine為2.57 mg； GCG為2.18 mg； EGCG為2.12 mg； ECG為2.00 mg； EC為1.50 mg； EGC為1. 95 mg； L-Theanine為2.34 mg。

用超純水定容至10 mL，得到8種有效成分標(biāo)準(zhǔn)品母液，濃度分別是：C為0.24 mg/mL；Caffeine為0.257 mg/ mL；GCG為0.218 mg/mL；EGCG為0.212 mg/mL；ECG為0.200 mg/mL；EC為0.15 mg/mL；EGC為0.195 mg/mL；L-Theanine為0.234 mg/mL。

1.7 方法學(xué)實驗

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢測限、定量限實驗

依據(jù)樣品中8種物質(zhì)的含量，分別稀釋1.6中標(biāo)準(zhǔn)母液，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。濃度梯度見表2。按照1.3、1.4所述的液相和質(zhì)譜條件進樣分析，以各組分的分峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，分別繪制出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

根據(jù)8種有效成分質(zhì)譜MRM模式下響應(yīng)不同，將配制好的最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進樣，按照3倍信噪比(S/N)所對應(yīng)的信號峰面積可計算得到方法的檢出限(LOD)，按10倍信噪比(S/N)所對應(yīng)的信號峰面積可計算得到方法的定量限(LOQ)。

表2 8種有效成分標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度梯度 單位：μg/mL

1.7.2 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性實驗

取制備好的茶葉樣品，連續(xù)進樣5次，每次進樣5.0 μL，計算8種物質(zhì)(C、Caffeine、GCG、EGCG、ECG、EC、EGC、L-Theanine)峰面積的RSD值，計算方法的精密度。

分別取樣品溶液，放置不同的時間(0、4、8、12、24 h)，在液相色譜-質(zhì)譜分析條件下進樣分析，計算8種物質(zhì)(C、Caffeine、GCG、 EGCG、ECG、EC、EGC、L-Theanine)峰面積的RSD值，考察方法的穩(wěn)定性。

平行取茶葉樣品5份制備樣品溶液，進行液相色譜-質(zhì)譜檢測，檢測后計算8種物質(zhì)含量的RSD值，考察方法的重復(fù)性。

1.7.3 回收率實驗

采用加標(biāo)回收率實驗，在經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的樣品中精密加入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品(C為0.60 μg；Caffeine為111.8 μg；GCG為54.4 μg；EGCG為263.4 μg； ECG為181.4 μg；EC為280.5 μg；EGC為130.0 μg；L-Theanine為152.0 μg)，制備供試溶液，通過檢測分別計算出8種有效成分的加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將8種有效成分的標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成1.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)的水溶液，在流動相混合狀態(tài)下，按10 μL/min流速進樣，通過全掃描(Scan模式)確定8種化合物的(M+1)質(zhì)子化離子峰(母離子)的質(zhì)荷比(m/z)。二級質(zhì)譜分析(子離子掃描)得到各自碎片離子的信息，選取豐度較高、干擾較小的兩個碎片子離子，作為定量離子和定性離子，優(yōu)化錐孔電壓(Cove voltage)和碰撞電壓(Collision energy)，得到最優(yōu)質(zhì)譜分析條件。圖1為表兒茶素(EC)的離子掃描圖，母離子(圖1(a))291，子離子(圖1(b))139。同理得到其他標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的母離子、子離子，結(jié)果見表3。

(a) EC母離子 (b) EC子離子圖1 EC母離子與子離子的二級質(zhì)譜

表3 8種有效成分UPLC-MS/MS測定參數(shù)

注：Q為定量離子，q為定性離子

2.2 方法學(xué)考察的結(jié)果

2.2.1 線性范圍、檢出限和定量限

在優(yōu)化的液相-質(zhì)譜條件下對茶葉中8種有效成分進行分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖2。結(jié)果表明8種物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)r均達到0.991以上，尤其Caffeine和EC能達到0.999以上，表明在該液相質(zhì)譜條件下8種成分具有良好的線性關(guān)系。

根據(jù)1.7.1所述方法確定檢出限和定量限。結(jié)果表明，8種有效成分的最低檢出限LOD在3.0～60.0 ng/mL之間,最低定量限LOQ在6.0～200.0 ng/mL之間。結(jié)果見表4。

表4 8種有效成分的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

注：各標(biāo)準(zhǔn)品的名稱見色譜圖右上角所示。圖2 茶葉中8種有效成分標(biāo)準(zhǔn)品在ESI+模式下的MRM色譜圖

2.2.2 精密度、穩(wěn)定性與重復(fù)性

實驗結(jié)果表明，8種有效成分的精密度實驗的峰面積RSD值均小于5%，說明方法精密度良好；檢測不同時間的茶葉樣品，得到8種有效成分的峰面積并計算出RSD值均小于5%，結(jié)果顯示8種有效成分檢測結(jié)果在24 h內(nèi)無顯著差異，表明了該方法穩(wěn)定性良好；對8種有效成分的含量做了5次平行實驗，結(jié)果顯示5次重復(fù)性實驗的RSD值均小于3%，表明了該方法的重復(fù)性良好。

2.2.3 回收率

對茶葉中8種有效成分分析進行回收率考察，不同組分進行5次平行測定，測定結(jié)果見表5。結(jié)果表明8種有效成分的回收率在94.7%±5.2%～104.7%±6.1%之間。

表5 8種有效成分回收率及其RSD(n=5)

2.3 樣品的測定結(jié)果

按照1.5中的方法處理漢中綠茶得到3個平行樣品溶液，在色譜質(zhì)譜優(yōu)化條件下進樣分析，8種有效成分MRM圖像分離度良好。將所得峰面積帶入2.2.1中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中8種有效成分的含量：L-Theanine為3.26±0.04 mg/g，EGC為5.19±0.17 mg/g，C為0.02±0.004 mg/g，Caffeine為3.10±0.07 mg/g，EC為11.26±0.23 mg/g，EGCG為5.92±0.19 mg/g，GCG為2.53±0.03 mg/g，ECG為4.19±0.03 mg/g。

3 討 論

3.1 兒茶素類同分異構(gòu)體問題

茶葉中的有效成分，有多對同分異構(gòu)體。如僅以m/z進行分析，區(qū)別不開，但它們的結(jié)構(gòu)不同，用色譜可以區(qū)分。比如GCG和EGCG是一對同分異構(gòu)體，母離子m/z為460，子離子都為139。但GCG的出峰時間為4.92 min，EGCG的出峰時間為4.23 min，用液相色譜就能夠容易區(qū)分。C和EC也具有相同的現(xiàn)象，母離子m/z為291，子離子都為139，但C的出峰時間為2.13 min，EC的出峰時間為3.94 min，同樣用液相色譜就能夠容易區(qū)分開。

3.2 Caffeine與C出峰時間重合問題

在實驗中發(fā)現(xiàn)Caffeine與C出峰時間均為2.13 min，在液相紫外檢測時不能有效分開，不能進行精確定量，出現(xiàn)檢測錯誤。利用質(zhì)譜，就可以根據(jù)其母離子和子離子對其進行分開的檢測，得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

3.3 質(zhì)譜調(diào)諧過程中兒茶素類化合物母核問題

在實驗中發(fā)現(xiàn)，這幾種兒茶素的正離子定量子離子大多數(shù)為139。兒茶素化合物的基本結(jié)構(gòu)見圖3，在經(jīng)過碰撞打碎之后形成的139子離子最可能的正離子子離子見圖4。

圖3 兒茶素類化合物結(jié)構(gòu)式 圖4 兒茶素類化合物子離子139母核

3.4 方法優(yōu)勢與不足

本方法采用超高效液相分離，利用質(zhì)譜進行檢測，具有較高的分離度，各組分分離檢測效果理想。重復(fù)性、準(zhǔn)確性、精密度良好，同時回收率達到了94.7%±5.2%～104.7%±6.1%之間，具有良好的回收率；本實驗的檢測周期僅為9.5 min，比高效液相檢測明顯縮短了時間；樣品的處理方法簡便；對儀器試劑要求低，使用的都是常用的試劑、儀器。

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在對茶葉的鑒別和質(zhì)量控制中具有較大的應(yīng)用價值，由于其儀器價格昂貴，普及程度較低，質(zhì)譜圖的解析對專業(yè)人員的技術(shù)要求高。但隨著超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的普及，這項技術(shù)將在茶葉生化成分的定性和定量分析、未知組分的結(jié)構(gòu)鑒定、茶葉質(zhì)量安全檢測和指紋圖譜等方面的研究中得到廣泛應(yīng)用，對不同類別茶葉質(zhì)量做出更準(zhǔn)確的評價。

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[責(zé)任編輯：謝 平]

Simultaneous determination of eight active substances in tea by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

DU Huan-huan1，CAI Yan-ni1，JIANG Hai1，2，3，SONG Ke-ying4

(1.School of Bioscience and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China；2.Provincial Bio-Resource Key Laboratory，Hanzhong 723000，China；3.Qinling-Bashan Mountains Bioresources Comprehensive Development C. I. C.，Hanzhong 723000，China；4.The First Senior Middle School of Wuhan Economic and Technological Development，Wuhan 430056，China)

A determination method was developed using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry to simultaneously determining eight kinds of effective components in tea (Catechin,Epicatechin,Epigallocatechin,Gallocatechingallat,Epicatechingallate,Epigallocatechingallate,L-Theanine and Caffeine). The sample was extracted with 70% methanol by water bath,using Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18chromatographic column and Mass spectrometry was conducted by using positive (ESI+) electrospray ionization and Multi-reactions monitoring (MRM) models,with external standard method. The results showed that the eight kinds of active ingredients in their respective inside had good linear range and the correlation coefficient was greater than 0.991,the average recoveries (n=5) between 94.7%±5.2% and 104.7%±6.1%.Method detection limit between 3.0～60.0 ng/mL,method of quantitative limit between 6.0～200.0 ng/mL.

ultra performance liquid chromatography(UPLC)； mass spectrometry； catechins； caffeine； L-Theanine； analysis of detection

2096-3998(2017)03-0074-07

2017-01-06

2017-02-27

陜西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計劃項目(SDBXM25-2015)

杜歡歡(1990—)，男，陜西省咸陽市人，陜西理工大學(xué)碩士研究生，主要研究方向為食品質(zhì)量與安全控制技術(shù)；[通信作者]江海(1977—)，男，四川省西昌市人，陜西理工大學(xué)高級實驗師，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為資源生物的開發(fā)利用和食品質(zhì)量安全控制。

TS272.7

A