徐 晶，姜懷志，張桂山，孫麗敏，白 曼，項(xiàng)露杰，婁玉杰

(1.長(zhǎng)春科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 , 吉林長(zhǎng)春130600 ； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 , 吉林長(zhǎng)春130118)

細(xì)毛羊皮膚毛囊不同發(fā)育時(shí)期miR-1298-5p靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

徐 晶1，姜懷志2，張桂山2，孫麗敏2，白 曼2，項(xiàng)露杰2，婁玉杰2

(1.長(zhǎng)春科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 , 吉林長(zhǎng)春130600 ； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 , 吉林長(zhǎng)春130118)

為了探討miR-1298-5p及其靶基因與細(xì)毛羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系，以細(xì)毛羊不同發(fā)育時(shí)期皮膚毛囊組織為材料，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-1298-5p的靶基因，采用RT-PCR對(duì)miR-1298-5p與其潛在靶基因FGF2進(jìn)行核酸水平相對(duì)定量檢測(cè)，利用Western Blot對(duì)潛在靶基因FGF2進(jìn)行蛋白相對(duì)定量檢測(cè)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)GF2的3′UTR存在miR-1298-5p種子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)；miR-1298-5p在皮膚毛囊不同發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)差異性表達(dá)； miR-1298-5p與其潛在靶基因之間呈現(xiàn)一種負(fù)調(diào)控趨勢(shì)，說明miR-1298-5p可能通過負(fù)調(diào)控FGF2從而調(diào)控皮膚毛囊生長(zhǎng)發(fā)育。表明結(jié)合靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果、miR-1298-5p在核酸水平表達(dá)規(guī)律及FGF2在核酸水平表達(dá)規(guī)律和蛋白表達(dá)水平表達(dá)規(guī)律初步確定FGF2為miR-1298-5p的靶基因。

細(xì)毛羊 ； 皮膚毛囊 ； miR-1298-5p ； FGF2

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，大量新的microRNA被發(fā)現(xiàn)，其功能也相繼被揭示，它可通過和特異的靶mRNA3′末端的非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，經(jīng)過互補(bǔ)程度引發(fā)靶mRNA翻譯抑制或降解[1]，從而干擾靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、分化、凋亡、腫瘤的發(fā)生及惡變。本試驗(yàn)中mir-1298-5p通過高通量測(cè)序技術(shù)獲得，其在毛囊發(fā)育的3個(gè)時(shí)期(生長(zhǎng)期、退行期、休止期)呈現(xiàn)差異性表達(dá)，并在試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。毛囊具有自我更新和周期性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，其周期性變化決定被毛的生長(zhǎng)與脫落，并受多種因子調(diào)控，有研究表明，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)是潛在的調(diào)控因子之一[2]。伴隨著毛纖維的周期性生長(zhǎng)，毛囊也經(jīng)歷著周期性的循環(huán)，即為生長(zhǎng)期、退行期和靜止期，生長(zhǎng)期是毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的活躍階段，在這個(gè)階段毛纖維細(xì)胞開始分裂、生長(zhǎng)旺盛、毛根變粗變長(zhǎng)、生長(zhǎng)快速。退行期是一個(gè)短暫的過渡期，發(fā)生在生長(zhǎng)期結(jié)束之后。休止期是毛囊發(fā)育“休息”時(shí)期，在此期間，毛發(fā)脫落、毛囊萎縮、棒狀毛被錨定、凋亡終止[3]。本試驗(yàn)以乾華細(xì)毛羊?yàn)檠芯繉?duì)象，通過基因組學(xué)和蛋白組學(xué)方法驗(yàn)證miR-1298-5p與FGF2之間的關(guān)系以及其對(duì)毛囊發(fā)育時(shí)期的調(diào)控，從而為揭示毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 隨機(jī)選擇不同時(shí)期乾華細(xì)毛羊3只，年齡為1.5周歲左右，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。采集時(shí)間分別為2014年9月羊毛生長(zhǎng)旺盛期、2015年1月羊毛生長(zhǎng)退行期和2015年5月羊毛生長(zhǎng)休止期，采集肩部皮膚組織樣，取樣大小約為1 cm2，液氮保存。

1.2 主要試劑 FGF2兔多克隆抗體(1∶1 500TBST稀釋)，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(二抗1∶2 000 TBST稀釋)，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；彩色預(yù)染Marker，購(gòu)自Promega，公司：ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒；購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜美國(guó)3 M。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer 5.0軟件，分別設(shè)計(jì)miR-1298-5p和內(nèi)參U6，F(xiàn)GF2和內(nèi)參(β-Actin)的定量PCR引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析 采用miRNA在線靶基因預(yù)測(cè)軟件Targetscan v7.0、miRanda和RNA22等對(duì)miR-1298-5p靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，再結(jié)合調(diào)控皮膚毛囊發(fā)育相關(guān)通路的文獻(xiàn)選出與毛囊發(fā)育相關(guān)的基因作為候選靶基因。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用染料法進(jìn)行，20 μL體系：5×Realtime PCR SYB 10 μL，上游引物F(10 μmol/L) 1 μL，下游引物R(10 μmol/L) 1 μL，CDNA 1 μL，蒸餾水7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，72 ℃(60 ℃)10 s，72 ℃，15 s(收集熒光)，40個(gè)循環(huán)。1.6 Western Blot 將蛋白樣品與5×上樣緩沖液以4∶1進(jìn)行混合，100 ℃水浴8 min，取40 μg總蛋白上樣。濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓100 V。半干轉(zhuǎn)膜，140 mA轉(zhuǎn)膜50 min。5%脫脂奶粉室溫?fù)u動(dòng)封閉2 h。一抗(1∶1 500 TBST稀釋)，4度過夜，二抗(1∶2 000 TBST稀釋)室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光，曝光。用Image-Pro Plus 6.0分析目標(biāo)條帶的積分光密度值(IOD)，利用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-1298-5p的靶基因 圖1為Targetscan預(yù)測(cè)的miR-1298-5p的靶基因，在FGF23′UTR區(qū)有7個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合的靶位點(diǎn)，說明FGF2基因的表達(dá)有可能受到miR-1298-5p的調(diào)控。因此，預(yù)測(cè)FGF2是miR-1298-5p的潛在靶點(diǎn)，可進(jìn)行下一步驗(yàn)證。

圖1 Targetscan預(yù)測(cè)的miR-1298-5p的靶基因

2.2 miR-1298-5p熒光定量表達(dá) 圖2可見miR-1298-5p在綿羊毛囊發(fā)育生長(zhǎng)期到退行期是不斷上調(diào)的趨勢(shì)，而退行期到休止期下調(diào)，且退行期與休止期之間、生長(zhǎng)期與休止期之間的相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，而退行期高表達(dá)，說明miR-1298-5p可能對(duì)毛囊從生長(zhǎng)期進(jìn)入退行期的轉(zhuǎn)換起到驅(qū)動(dòng)作用。且miR-1298-5p在細(xì)毛羊皮膚毛囊不同發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)差異性表達(dá)。

圖2 miR-1298-5p相對(duì)表達(dá)量

2.3 靶基因FGF2熒光定量 圖3可見FGF2mRNA從生長(zhǎng)期到退行期略有下降，而從退行期到休止期不斷上調(diào)。且FGF2mRNA的表達(dá)量在生長(zhǎng)期和休止期、退行期和休止期之間均差異顯著(P<0.05)。miR-1298-5p與FGF2熒光定量有負(fù)調(diào)控趨勢(shì)，F(xiàn)GF2可能是miR-1298-5p的潛在靶基因。

圖3 FGF2mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4 靶基因FGF2蛋白相對(duì)定量 圖4可見，F(xiàn)GF2在綿羊毛囊中從生長(zhǎng)期到退行期是下調(diào)的，而退行期到休止期是不斷上調(diào)的趨勢(shì)，且生長(zhǎng)期與休止期、退行期與休止期之間的蛋白表達(dá)量有顯著差異(P<0.05)，生長(zhǎng)期低表達(dá)而休止期高表達(dá)，說明FGF2是一個(gè)毛囊生長(zhǎng)期拮抗劑。miR-1298-5p和 FGF2蛋白定量表達(dá)趨勢(shì)相反，因此，可以初步確定FGF2是miR-1298-5p的潛在靶基因。

圖4 FGF2蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

miRNA是一類含有20到24個(gè)堿基的小分子RNA片段，具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性，能精細(xì)地調(diào)節(jié)著某些特定細(xì)胞和組織類型的靶基因表達(dá)[4]。miRNA主要是通過與靶基因mRNA 的3′UTR區(qū)特異結(jié)合引起mRNA 的降解或抑制蛋白的翻譯，因此，研究人員逐漸將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向miRNA與其靶基因的調(diào)控關(guān)系方面的研究。Wang等人[5]在研究miR-133a及其靶基因?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌功能時(shí)利用過表達(dá)miR-133a來驗(yàn)證其與靶基因的互相調(diào)控作用。

為研究miR-1298-5p在細(xì)毛羊毛囊發(fā)育周期中的調(diào)控機(jī)制，本研究利用了生物信息軟件Targetscan、miRanda和miRDB等對(duì)miR-1298-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)及歸類，并通過閱讀大量有關(guān)毛囊發(fā)育的文獻(xiàn)，最終篩選出與毛囊發(fā)育周期相關(guān)的靶基因FGF2。Park等[6]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及抑制細(xì)胞凋亡的重要作用，此外FGF2也通過激活相關(guān)的信號(hào)通路因子進(jìn)而發(fā)揮作用。Kiso等[7]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2與PDGF在促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠真皮乳頭細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)毛發(fā)再生方面具有協(xié)同作用。Hwang等[8]在研究腺苷對(duì)體外培養(yǎng)小鼠觸須毛囊真皮乳頭作用的過程中發(fā)現(xiàn)，腺苷通過提高FGF2與FGF7的表達(dá)，從而促進(jìn)真皮乳頭細(xì)胞的增殖。Santos[9]等研究發(fā)現(xiàn)，綿羊卵泡細(xì)胞中存在FGF2，并且10 ng/mL FGF2可抑制體外培養(yǎng)綿羊卵泡細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)卵泡細(xì)胞的生長(zhǎng)。FGF2通過FGFR1間接作用于胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)激活PI3K/AKT1和ERK1/2信號(hào)通路，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡[10]。Yang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2與FGF10通過激活MAPK信號(hào)通路為介質(zhì)，引起綿羊胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移。總之，miRNA及其靶基因?qū)?xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程的重要作用正不斷的被研究者得到驗(yàn)證。

本試驗(yàn)通過生物學(xué)試驗(yàn)方法檢測(cè)靶基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平來驗(yàn)證FGF2是否為miR-1298-5p的靶基因，結(jié)果表明miR-1298-5p和 FGF2熒光定量及蛋白定量均呈相反趨勢(shì)，因此，可以初步確定FGF2是miR-1298-5p的靶基因。Western Blot試驗(yàn)表明，F(xiàn)GF2在綿羊毛囊中從生長(zhǎng)期到退行期是下調(diào)的，而退行期到休止期是不斷上調(diào)的，生長(zhǎng)期低表達(dá)而休止期高表達(dá)，說明FGF2是一個(gè)毛囊生長(zhǎng)期的拮抗劑。這與Reiter M等的研究一致。Reiter等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2表達(dá)下降時(shí)，毛囊意味著進(jìn)入生長(zhǎng)期，F(xiàn)GF2的表達(dá)上調(diào)，使休止期毛囊的數(shù)量增加，意味著毛囊進(jìn)入休止期。因此，F(xiàn)GF2可能是miR-1298-5p的靶基因，但是否具有調(diào)控作用，還需要做Luciferase報(bào)告基因試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Target Gene Prediction and Identification of miR-1298-5p in different stage Skin and Hair Follicles of Fine Wool Sheep

XU Jing1，JIANG Huai-zhi2, ZHANG Gui-shan2，SUN Li-min2，BAI Man2，XIANG Lu-jie2, LOU Yu-jie2

(1.College of Animal Science and Technology,Changchun Sci-Tech University，Changchun 130060，China ; 2.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118 , China)

To investigate the relationship among hair follicle development，miR-1298-5p, and its target genes in fine wool sheep.Using different stage skin and hair follicles from fine wool sheep as materials，potential target genes of miR-1298-5p were predicted by bioinformatics analysis，and the relative expressions of miR-1298-5p and its potential target gene FGF2were analyzed by RT-PCR and Western blot.Results：Bioinformatics analysis showed that 3′UTR of FGF2had a binding site for mir-1298-5p.And the results showed that both miR-1298-5p and FGF2showed differential expression at different hair follicle development stages. We also showed that miR-1298-5p negatively regulated FGF2expression. All these indicated that miR-1298-5p may play an important role in skin and hair follicle cycling development by regulating FGF2. Based on the target gene prediction and the expression of miR-1298-5p and FGF2，F(xiàn)GF2was preliminarily considered as a target gene of miR-1298-5p.

Fine wool sheep; Skin and hair follicles; MiR-1298-5p; FGF2

LOU Yu-jie

2016-07-04

吉林省教育廳項(xiàng)目(2015566)

徐晶(1981-)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)榉雌c動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與遺傳，E-mail:xujing19811007@126.com

婁玉杰，E-mail：904973880@qq.com

Q78

A

0529-6005(2017)04-0020-03