單曉楓，張海月，孫武文，康元環(huán)，陳 龍，張冬星，安鼎杰，田佳鑫，錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118)

青蝦源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物生物學(xué)特性及蛋白成分分析

單曉楓，張海月，孫武文，康元環(huán)，陳 龍，張冬星，安鼎杰，田佳鑫，錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118)

為了研究維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物在青蝦感染中的致病作用以及維氏氣單胞菌的致病機(jī)理，本試驗(yàn)以青蝦源維氏氣單胞菌QXF0711B為研究對(duì)象，提取其胞外產(chǎn)物，采用打孔法測(cè)定其胞外產(chǎn)物的酶活性，并對(duì)溶血活性進(jìn)行溶血譜分析，同時(shí)分析其致病性。應(yīng)用液相質(zhì)譜與串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合方法(LC-MSMS)對(duì)其胞外產(chǎn)物蛋白成分進(jìn)行鑒定，利用Gene Ontology(GO)對(duì)已鑒定蛋白進(jìn)行生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分的分類分析。結(jié)果表明：QXF0711B菌株胞外產(chǎn)物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性，不具有明膠酶活性；其可溶解多種動(dòng)物紅細(xì)胞，尤以對(duì)魚類紅細(xì)胞溶血性更強(qiáng)，但對(duì)雞、鴨紅細(xì)胞無溶血活性。通過對(duì)菌株胞外產(chǎn)物蛋白成分分析顯示有90種蛋白：共參與45種生物學(xué)過程，主要涉及碳水化合物代謝過程、運(yùn)輸?shù)龋还灿?6種分子功能，主要涉及DNA結(jié)合、ATP結(jié)合、金屬離子結(jié)合等；為12種細(xì)胞組分，主要包括膜的有機(jī)組成、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外膜等。

維氏氣單胞菌 ； 胞外產(chǎn)物 ； 酶活 ； LC-MSMS ； GO分類分析

維氏氣單胞菌是一種人、獸、水生動(dòng)物共患病原菌[1]，其可以感染包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物，患病動(dòng)物多以出血性敗血癥、腸炎等為主要臨床表征[2-4]。胞外產(chǎn)物(Ex tracellular products，ECP) 是細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中不斷分泌到體外的、具有生物活性的蛋白酶類及毒素類物質(zhì)。ECP能夠降解宿主蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)等，并且破壞宿主的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)病原菌在宿主組織中進(jìn)行繁殖，甚至直接作用于宿主的組織，使組織發(fā)生溶解和壞死。目前有關(guān)維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物的研究在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)以青蝦源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物為研究材料，對(duì)其主要部分生物學(xué)特性及蛋白成分進(jìn)行分析，為進(jìn)一步了解維氏氣單胞菌致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 青蝦源維氏氣單胞菌QXF0711B株，由浙江省淡水水產(chǎn)研究所潘曉藝副研究員惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用斑馬魚，購(gòu)自長(zhǎng)春市某花鳥魚市場(chǎng)，體重0.3～0.4 g，體長(zhǎng)3.0～3.5 cm，暫養(yǎng)觀察2周無異常后進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)前禁食24 h

1.3 維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物(ECP)的制備 活化維氏氣單胞菌菌株QXF0711B，接種于不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基，28 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后收集培養(yǎng)物，12 000 r/min (4℃)離心30 min，收集上清液。經(jīng)0.22 μmol/L微孔濾膜過濾除菌后，加入固體硫酸銨至75%飽和度，4 ℃靜置過夜。12 000 r/min(4 ℃) 離心30 min，棄上清液，用0.02 mol/L Tris-HC1(pH值 7.4)緩沖液將沉淀重懸，經(jīng)透析，聚乙二醇(PEG)10 000濃縮，得到胞外產(chǎn)物，然后涂于TSA固體平板，確定無菌后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 胞外產(chǎn)物的酶活性及溶血性分析 在TSA固體培養(yǎng)基上分別添加可溶性淀粉(2%)、吐溫80(1%)、脫脂牛奶(8%)、明膠(4%)和兔鮮血(7%)，用打孔法測(cè)定維氏氣單胞菌ECP的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、明膠酶酶活性以及溶血活性，并以不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，30 ℃培養(yǎng) 24 h～48 h 后觀察結(jié)果。

1.5 胞外產(chǎn)物溶血譜測(cè)定 參照Sahu I等[5]的方法略有改進(jìn)。無菌采取青蝦、鯽魚、草魚、鯉魚、鰱魚、雞、鴨、兔、小鼠等動(dòng)物紅細(xì)胞，并制成2%紅細(xì)胞懸液。胞外產(chǎn)物用無菌生理鹽水在96孔板上倍比稀釋，然后加入等量的2%紅細(xì)胞，輕輕混勻，37 ℃(或28 ℃)溫箱放置1 h，然后4 ℃冰箱過夜。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)對(duì)照組：對(duì)照組A為不加任何物質(zhì)的紅細(xì)胞稀釋液，對(duì)照組B為100%溶血的紅細(xì)胞懸液。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)以50%紅細(xì)胞溶解的ECP最高稀釋度為溶血價(jià)。

1.6 胞外產(chǎn)物致病性的測(cè)定 將190尾健康斑馬魚隨機(jī)分成4組：試驗(yàn)Ⅰ組為純維氏氣單胞菌組、不含有ECP，試驗(yàn)Ⅱ組注射維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物，試驗(yàn)Ⅲ組注射處理后的維氏氣單胞菌菌體與胞外產(chǎn)物的混合物，對(duì)照組注射無菌PBS(具體情況見表1)，試驗(yàn)所有組所用斑馬魚腹腔注射10 μL/尾。感染后觀察7 d，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)量。

1.7 胞外產(chǎn)物蛋白成分鑒定及GO功能分析 純化菌株QXF0711B胞外產(chǎn)物，采用液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合的方法(LC-MSMS)對(duì)胞外產(chǎn)物蛋白成分進(jìn)行鑒定。通過Blast檢索序列相似的模式生物蛋白，對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行GO功能分析(生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分)，信息來自UNIPROT(http://www.uniprot.org)網(wǎng)站。

2 結(jié)果

2.1 胞外產(chǎn)物的酶活性及溶血性 提取維氏氣單胞菌QXF0711B的胞外產(chǎn)物，測(cè)定其酶活性與溶血活性發(fā)現(xiàn)：淀粉平板加入盧戈氏碘液后加樣孔周圍出現(xiàn)透明環(huán)；吐溫80平板加樣孔周圍出現(xiàn)了不透明的白色暈圈；脫脂牛奶平板加樣孔周圍出現(xiàn)了透明環(huán)；兔血培養(yǎng)基平板加樣孔周圍出現(xiàn)了無色透明環(huán)；明膠酶培養(yǎng)基平板加樣孔周圍無變化(見中插彩版圖1)。結(jié)果表明，維氏氣單胞菌QXF0711B株胞外產(chǎn)物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性以及對(duì)兔血具有溶血活性，不具有明膠酶活性。

2.2 胞外產(chǎn)物溶血譜測(cè)定結(jié)果 菌株QXF0711B胞外產(chǎn)物對(duì)鯉魚的溶血價(jià)最高為26；其次為青蝦、鯽魚、鰱魚和草魚，溶血價(jià)均為25；烏鱧溶血價(jià)為24；對(duì)小鼠和兔溶血價(jià)分別為23、22；對(duì)雞、鴨紅細(xì)胞無溶血作用。

2.3 致病性結(jié)果 健康斑馬魚攻毒后均有不同程度的死亡現(xiàn)象產(chǎn)生，在試驗(yàn)Ⅰ組，當(dāng)攻菌濃度為5.4×108CFU/mL時(shí)全部死亡；試驗(yàn)Ⅱ組ECP濃度0.56 mg/mL時(shí)死亡率為100%，0.28 mg/mL時(shí)死亡率為70%，且在攻毒后6 h即發(fā)生死亡；試驗(yàn)Ⅲ組具有較強(qiáng)的致病性，5.4×107CFU/mL的菌液混有0.28 mg/mL胞外產(chǎn)物時(shí)死亡率為100%，且攻毒后4 h即發(fā)生死亡，12 h時(shí)已死亡60%；PBS對(duì)照組沒有出現(xiàn)死亡(表1)。2.4 質(zhì)譜鑒定與蛋白功能分析 運(yùn)用LC-MSMS方法分析維氏氣單胞菌QXF0711B胞外產(chǎn)物，共檢測(cè)出90種蛋白，其中有26種為功能未知蛋白，25種假定蛋白，其余蛋白分別為肽酶S8、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氣單胞菌毒力因子、亮氨酸-tRNA連接酶、亞硫酸鹽還原酶、氧化還原酶等。

根據(jù)所鑒定蛋白的GO注釋信息，對(duì)其進(jìn)行GO分類：其中參與生物學(xué)過程的蛋白有59種，這些生物學(xué)過程主要包括運(yùn)輸、DNA模板、碳水化合物代謝過程等；參與分子功能的蛋白共有80種，其中具有DNA結(jié)合、ATP結(jié)合、金屬離子結(jié)合、受體活性功能的蛋白較多；參與細(xì)胞組分的蛋白共有41種，這些蛋白主要位于膜的有機(jī)組成、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外膜等。

表1 QXF0711B菌株及其胞外產(chǎn)物致病性分析

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)青蝦源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物的酶活性進(jìn)行了初步分析。與目前已報(bào)道的維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物酶活性存在差異[6]，具體原因可能與分離種類、菌株致病性等不同有關(guān)。因?yàn)椴≡a(chǎn)生的溶血活性可以導(dǎo)致各組織溶血現(xiàn)象的產(chǎn)生、蛋白酶具有分解膠原等蛋白成分的作用、淀粉能使糖原分解、脂肪酶可分解脂類，因此，當(dāng)維氏氣單胞菌感染青蝦時(shí)，其分泌的ECP的溶血活性與酶活性導(dǎo)致青蝦的各組織溶解，從而為細(xì)菌提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌增殖的同時(shí)酶量也隨即增多，對(duì)青蝦外殼、肌肉的破壞程度也不斷增加，從而引起青蝦的出現(xiàn)“軟殼綜合征”[3]。

維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物可溶解多種動(dòng)物的紅細(xì)胞，但對(duì)不同動(dòng)物的紅細(xì)胞的敏感性存在差異，其溶血價(jià)也不同。鄔向東[7]等發(fā)現(xiàn)鱔魚源嗜水氣單胞菌胞外產(chǎn)物，賀揚(yáng)[6]等發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)鮰源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物對(duì)魚類紅細(xì)胞溶血價(jià)比對(duì)其他動(dòng)物高，與本試驗(yàn)胞外產(chǎn)物對(duì)魚類紅細(xì)胞的溶血價(jià)比其他動(dòng)物要高的結(jié)果相似。雖然試驗(yàn)菌株分離自青蝦，但菌株ECP對(duì)鯉魚紅細(xì)胞溶血價(jià)要高于青蝦，其原因可能是菌株在不同動(dòng)物上致病機(jī)理有所區(qū)別有關(guān)，具體原因，需進(jìn)行深入研究。

通過對(duì)致病性的分析發(fā)現(xiàn)，菌體與胞外產(chǎn)物混合感染斑馬魚時(shí)毒力最強(qiáng)，短時(shí)間內(nèi)即發(fā)生死亡；單獨(dú)感染胞外產(chǎn)物也即可導(dǎo)致斑馬魚的發(fā)病和死亡，死亡率也較高；但感染維氏氣單胞菌菌體時(shí)，死亡數(shù)量開始較少，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，死亡數(shù)量呈遞增趨勢(shì)，其原因可能注射病原菌組不含有ECP，對(duì)魚的致死性依賴于細(xì)菌在體內(nèi)的增殖。

經(jīng)過GO分類分析發(fā)現(xiàn)，蛋白具有較為廣泛的生物學(xué)功能覆蓋范圍，從生物學(xué)過程中可以看出胞外產(chǎn)物參與調(diào)控的蛋白多是參與能量代謝相關(guān)途徑，如碳水化合物代謝等。細(xì)胞組分分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白更多定位于生命活動(dòng)的主要場(chǎng)所膜的有機(jī)組成、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外膜。分子功能分析表明，這些蛋白的功能集中在DNA結(jié)合、ATP結(jié)合以及金屬離子結(jié)合等。

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Bioactivity Analysis of extracellular products ofAeromonasveroniistrain isolated from Freshwater Shrimp

SHAN Xiao-feng，ZHANG Hai-yue，SUN Wu-wen, KANG Yuan-huan ，CHEN Long，ZHANG Dong-xing，AN Ding-jie，TIAN Jia-xin，QIAN Ai-dong

(College of Animal Science and Technology， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China)

In order to study the pathogenic role of extracellular products(ECP) and pathogenic mechanism ofAeromonasveroniiisolated from freshwater shrimp,the extracellular products fromAeromonasveroniiQXF0711B were extracted，and the enzyme activity and hemolytic activity of extracellular products were determined by plat stiletto method.LC-MSMS and Gene Ontology method were used to identify the protein components of the extracellular products and analyzing the biological process，molecular function and cellular components of ECP，respectively.Biologic activities showed that the ECP possess amylase and lipase activity，protease and hemolytic activity，but no gelatinase activity.The hemolytic effect of ECP showed a high hemolytic activity to fish erythrocyte，while no hemolytic activity to chicken and duck erythrocyte.The component analysis showed that 90 kinds of proteins were detected in the extracellular products.These proteins involved in 45 kinds of biological processes，especially carbohydrate metabolism process and transport，46 kinds of molecular functions about DNA binding，ATP binding and metal ion binding mainly，and 12 kinds of cellular components including integral component of membrane，cytoplasm and cell outer membrane.

Aeromonasveronii; extracellular products; enzyme activity; LC-MSMS; GO classification analysis

QIAN Ai-dong

2016-09-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201927)；吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204065NY)

單曉楓(1977-)，男，副教授，博士，從事動(dòng)物細(xì)菌學(xué)方面的研究，E-mail：sxf1997@163.com

張海月(1990-)，女，博士生，主要從事分子細(xì)菌學(xué)研究，E-mail：748436536@qq.com

錢愛東，E-mail：qianaidong0115@163.com

S945.4

A

0529-6005(2017)04-0105-03

注：張海月與單曉楓對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)