朱利群 王 純 陳菊香

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血清miRNA-200b在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

朱利群 王 純 陳菊香

目的 探究血清miRNA-200b在非小細胞肺癌(NSCLC)患者中的表達水平。方法 選擇45例NSCLC患者為觀察組，同時選取30例經(jīng)診斷無腫瘤疾病的健康對照組。qRT-PCR檢測各組血清miRNA-200b的表達水平。結(jié)果

觀察組患者miRNA-200b血清表達水平明顯高于對照組(P<0.0001)。觀察組患者血清miRNA-200b水平隨著臨床分期的升高而顯著上升(P<0.05)；另外，NSCLC患者中肺鱗癌患者血清miRNA-200b表達顯著高于腺癌(P<0.0001)。此外，ROC分析miRNA-200b診斷NSCLC最佳cutoff值為0.276(敏感性46.7%，特異性93.3%，AUC值0.779)。結(jié)論 NSCLC患者血清miRNA-200b水平顯著升高，在NSCLC患者的疾病發(fā)展過程中起到重要的作用，可作為無創(chuàng)早期診斷NSCLC的指標(biāo)之一。

miRNA-200b；非小細胞肺癌；血清

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1059～1061)

肺癌已成為全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，包括中國在內(nèi)的世界各地每年因肺癌死亡的人數(shù)在150萬左右[1-3]。肺癌按病理主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，后者占據(jù)所有肺癌患者的80%以上[4-5]。盡管近年來非小細胞肺癌的治療效果有較大的提高，最低的5年生存率在15%左右，延誤治療的首選已從手術(shù)替換為靶向藥物[6-7]。目前，肺癌患者的早期診斷大多采用低劑量的CT，但其具有較高的假陽性率、過度診斷以及潛在輻射暴露危害等局限性。因此，非侵入性的腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與檢測將有助于早期肺癌患者的診斷，且能夠明顯減少患者的死亡率[8]。miRNA是參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼小RNA，通過結(jié)合mRNA的3’非編碼區(qū)調(diào)控基因的表達。miRNA可由細胞分泌至血液中，也可在其死亡后釋放[9-10]。已有研究顯示，癌癥患者外周血miRNA表達出現(xiàn)異常，且不同惡性腫瘤的miRNA表達不同。miRNA可作為癌基因或抑癌基因參與各種疾病過程[11]。因此，血液miRNA可作為惡性腫瘤確診的生物標(biāo)志物，由于其屬于無創(chuàng)檢驗，且特異性良好，已越來越受到臨床的推崇。本研究將對非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血清2種miRNA進行檢測，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2014年2月至2015年9月在本院腫瘤科就診的NSCLC患者45例為觀察組，其中男性34例，女性11例，年齡為45～76歲，平均年齡(61.3±18.6)歲，吸煙患者為39例。所有患者均經(jīng)病理檢查證實為NSCLC，包括29例腺癌和16例肺鱗癌，其中Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者分別為27、11和7例，且患者均無放化療史及相關(guān)免疫治療史。同時選取30例經(jīng)診斷無腫瘤疾病的健康對照組，男性22例，女性8例，年齡為32～69歲，平均年齡(58.3±17.7)歲，吸煙患者為25例。一般指標(biāo)無顯著性差異(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 所有患者均采集靜脈EDTA抗凝血5 mL，對全血總RNA提取采用QIAGEN miRNAeasy Mini kit試劑盒進行抽提。Nanodrop 2000(Thermo公司)檢測RNA濃度，且OD260/280值在1.8～2.2之間為合格樣本。

1.2.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 采用ABI公司生產(chǎn)的TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將各組織樣本總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，總體系為15 μl。PCR程序為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。PCR結(jié)束后獲得的cDNA均保存于-20 ℃冰箱。

1.2.3 qRT-PCR 首先從miRBase數(shù)據(jù)庫中查出miR-200b的序列，隨后ABI公司定制合成Taqman熒光探針，通過ABI公司的Step One熒光定量PCR儀對miRNA-200b和內(nèi)參U6snRNA進行QPCR檢測，所有入組標(biāo)本均重復(fù)3個復(fù)孔。實時定量PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min，然后以95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min進行40 個循環(huán)。miRNA的相對表達水平為2-ΔΔCT，ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)病理組織-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)正常組織。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組血清miRNA-200b的表達水平比較

各組提取總RNA 純度均符合后續(xù)實驗要求，且經(jīng)溶解曲線發(fā)現(xiàn)為單一峰，跑膠驗證為目的帶。由圖1可見，觀察組患者miRNA-200b血清相對表達水平為(0.327±0.182)，明顯高于對照組的(0.128 ±0.051)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。

圖1 各組患者血清miRNA-200b的表達水平比較

2.2 miRNA-200b表達與臨床病理特征的相關(guān)性

分析不同分期的NSCLC患者miRNA-200b的表達水平發(fā)現(xiàn)，血清miRNA-200b水平隨著患者臨床分期的升高而顯著上升，其在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者的表達水平分別為(0.213±0.132)、(0.277±0.101)和(0.359±0.178)(圖2)。此外，NSCLC患者中肺鱗癌患者血清miRNA-200b表達水平為(0.427±0.242)，顯著高于腺癌患者(0.199±0.103)(圖3)。

圖2 不同臨床時期NSCLC患者miRNA-200b的表達水平比較

圖3 不同類型NSCLC患者miRNA-200b的表達水平對比

2.3 觀察組患者血清miRNA-200b表達水平診斷價值

通過線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，最佳cutoff值為0.276，其中敏感性46.7%，特異性93.3%，AUC值0.779(95%CI范圍0.664～0.894；P<0.001)(圖4)。

圖4 NSCLC患者血清miRNA-200b水平作為診斷的ROC曲線圖

3 討論

許多研究表明，外周血miRNA在診斷不同人類疾病中可作為強有力的生物標(biāo)志物。外周血中的miRNA主要由凋亡或壞死細胞釋放，但也有細胞為和其他細胞之間相互作用而主動分泌的。因為外周血miRNA大多在外泌體和凋亡小體中，因此其能夠保持高度的穩(wěn)定[12-13]。近年來研究表明，正常肺組織惡化過程中有許多miRNA參與，其中部分表達升高與肺癌呈正相關(guān)性，特異性較高[14]。由于臨床占位穿刺或者纖支鏡活檢組織均有創(chuàng)傷性，因而外周血等無創(chuàng)檢測得到越來越多的應(yīng)用，且對于早期預(yù)防、確診等有重要的臨床意義。

miRNA-200家族包括miR-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141和miRNA-429共5個成員。已有的報道顯示，miRNA-200家族在不同腫瘤中均有不同的表達，其中miRNA-200b在宮頸癌組織中高表達，而在膽囊癌等腫瘤中表達下調(diào)[15]。此外，前列腺癌和卵巢癌患者外周血中miRNA-200b較正常人水平明顯升高[16]。從目前的研究結(jié)果來看，miRNA-200b與多個腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，其可能在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。

本研究通過對NSCLC患者血清miRNA-200b水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)其與正常人相比顯著升高。隨后分析患者miRNA-200b與臨床病理特征的相關(guān)性顯示，隨著臨床分期從Ⅰ期到Ⅲ期增加，miRNA-200b水平明顯升高，與NSCLC疾病發(fā)展呈正相關(guān)。同時，研究還發(fā)現(xiàn)NSCLC處于Ⅰ期時血清miRNA-200b的均值水平已高于對照組，表明其在NSCLC早期診斷具有一定的意義。此外，對于NSCLC不同腫瘤類型中的分析發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌患者中血清miRNA-200b水平高于腺癌，顯示出miRNA-200b對于NSCLC中肺鱗癌的診斷價值更高。最后，ROC分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-200b的敏感性為46.7%，而特異性已超過90%，達到93.3%。敏感性較低可能考慮為miRNA-200b在血清中濃度較低導(dǎo)致的結(jié)果偏倚所致，因此還需要更多的臨床標(biāo)本和實驗進一步證實。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清miRNA-200b水平顯著升高，與臨床分期的呈正相關(guān)，且與肺鱗癌相關(guān)性更高，表明其在NSCLC患者的疾病發(fā)展過程中起到重要的作用，可作為無創(chuàng)早期診斷NSCLC的指標(biāo)之一。

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(編輯：甘 艷)

Expression of Serum miRNA-200b in Non-small Cell Lung Cancer and Its Clinical Significance

ZHULiqun,WANGChun,CHENJuxiang.People’sHospitalofLiyang,Liyang,213300

Objective To investigate the expression of serum miRNA-200b in non-small cell lung cancer(NSCLC) and its clinical significance.Methods A total of 45 NSCLC patients were selected as the observation group and 30 healthy humans without any cancer was the control group.The expression of serum miRNA-200b of the 2 groups were measured by qRT-PCR.Results The expression of serum miRNA-200b were significantly higher in the observation group (P<0.0001);Besides,serum miRNA-200b expression significantly increased with higher clinical staging(P<0.05);In addition,miRNA-200b was significantly correlated with patients with lung squamous cell carcinomas than lung adenocarcinomas (P<0.0001);Furthermore,the best cutoff value for serum miRNA-200b to diagnose NSCLC patients was 0.276 (sensitivity 46.7%,specificity 93.3%,and AUC 0.779).Conclusion NSCLC were associated with up-regulation of the expression of serum miRNA-200b and it has a critical role in NSCLC progression.miRNA-200b could be a novel serum miRNA biomarker for non-invasive early diagnosis of NSCLC.

miRNA-200b;Non-small cell lung cancer(NSCLC);Serum

213300 江蘇省溧陽市人民醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.005

R734.2

A

1001-5930(2017)07-1059-03

2016-08-08

2017-03-09)