韓曉燕，包郁明，辛鳳姣，黃 穎，Christophe BLECKER，戴小楓,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.列日大學(xué)食品學(xué)院，比利時(shí) 列日 999013）

棉籽抗菌活性肽的分離純化及鑒定

韓曉燕1，包郁明1，辛鳳姣1，黃 穎1，Christophe BLECKER2，戴小楓1,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.列日大學(xué)食品學(xué)院，比利時(shí) 列日 999013）

通過體外模擬消化系統(tǒng)對(duì)棉籽分離蛋白（cottonseed protein isolate，CPI）進(jìn)行酶解，得到具有抗菌活性的酶解產(chǎn)物，并采用超濾（ultraf i ltration，UF）、陰離子交換色譜（anion exchange chromatography，AEC）、半制備高效液相色譜（semi-preparation high performance liquid chromatography，semi-P-HPLC）分離技術(shù)對(duì)棉籽抗菌活性肽進(jìn)行分離純化，用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（electrospray ionization-tandem mass spectrometry，ESI-MS/MS）鑒定棉籽抗菌肽的氨基酸序列。在抗菌活性肽分離純化過程中，用UF對(duì)具有抗菌活性的CPI酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到3 個(gè)組分U-Ⅰ～U-Ⅲ?？咕钚詸z測表明U-Ⅲ的抗菌能力最強(qiáng)；用AEC分離U-Ⅲ得到3 個(gè)組分QF-Ⅰ～QF-Ⅲ，其中QF-Ⅱ抗菌能力最強(qiáng)；進(jìn)一步采用semi-P-HPLC分離QF-Ⅱ得到4 個(gè)組分PF-Ⅰ～PF-Ⅳ，其中PF-Ⅲ的抗菌能力最強(qiáng)，經(jīng)HPLC檢測為單一峰，ESI-MS/MS檢測分析得到該肽的氨基酸序列為ISGLIyEETR（Ile-Ser-Gly-Leu-Ile-Tyr-Glu-Glu-Thr-Arg）。

棉籽分離蛋白酶解產(chǎn)物；抗菌活性肽；分離純化；氨基酸序列

抗菌活性肽作為對(duì)抗病原體入侵的第一道防線，具有相對(duì)分子質(zhì)量小、殺菌廣譜、抗菌活性高等特點(diǎn)，對(duì)動(dòng)物與人尤其是嬰兒的免疫系統(tǒng)起著重要作用[1-2]，自20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)第一個(gè)抗菌活性肽——天蠶素后[3]，大量的天然抗菌活性肽相繼被發(fā)現(xiàn)，且結(jié)構(gòu)得到鑒定[4-6]。天然抗菌肽因其安全性和廣譜性，作為抗菌產(chǎn)品在醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用[7]。

近年來，植物蛋白來源的生物活性肽作為功能因子引起了各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。我國是產(chǎn)棉大國，棉籽產(chǎn)量穩(wěn)居世界首位（2015年約為750萬 t），棉籽蛋白含量豐富，關(guān)于其酶解消化得到棉籽生物活性肽的研究具有重要意義。目前關(guān)于棉籽活性肽的研究主要集中在抗氧化活性[8-9]及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性[10]，而在抗菌活性方面的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用超濾（ultrafiltration，UF）、陰離子交換色譜（anion exchange chromatography，AEC）及半制備高效液相色譜（semipreparation high performance liquid chromatography，semi-P-HPLC），對(duì)具有抗菌活性的棉籽分離蛋白體外模擬消化的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。超濾是按分子質(zhì)量大小對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分級(jí)和濃縮的一種技術(shù)[11]，由于其簡單輕便易操作[12]，常被用于生物活性肽制備的第一步分離技術(shù)[13]，離子交換色譜是根據(jù)樣品表面所帶電荷的不同而對(duì)其進(jìn)行分離的，不同物質(zhì)因其表面凈電荷不同，與帶相反電荷填料之間相互作用能力的強(qiáng)弱不同從而被結(jié)合或洗脫[14]。HPLC是根據(jù)樣品極性的不同對(duì)其進(jìn)行分離的，靈敏度較高，常作為樣品分離純化的最后一步[15]。

生物活性肽結(jié)構(gòu)鑒定主要包括氨基酸序列分析儀測定法[16]和質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）法[17]，目前，在小肽結(jié)構(gòu)鑒定方面應(yīng)用較多的是基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrix assisted laser desorption ionization，MALDI）-MS[18]和電噴霧（electrospray ionization，ESI）-MS技術(shù)[6,19]。在ESI-MS中，高分子質(zhì)量的物質(zhì)通常會(huì)帶有多個(gè)電荷，電荷狀態(tài)的分布可以精確對(duì)分子質(zhì)量定量，并且可以同時(shí)提供精確的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息，這是ESI-MS相對(duì)于其他電離質(zhì)譜所特有的優(yōu)點(diǎn)[20]。因此本實(shí)驗(yàn)選用ESI-MS/MS對(duì)純化得到的棉籽抗菌活性肽的氨基酸序列進(jìn)行鑒定，為棉籽蛋白的精深加工及功能性棉籽肽的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棉籽分離蛋白（cottonseed protein isolate，CPI）本課題組自制[21]；金黃色葡萄球菌 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所棉花病害防治實(shí)驗(yàn)室。

Tris Base 美國Sigma公司；鹽酸、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；三氟乙酸（色譜純） 薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾管（10 kD及3 kD） 美國Millipore公司；5810 R型及5424 R型離心機(jī) 德國Eppendorf公司；UC-6 200型超聲波清洗器 美瑞泰克科技有限公司；AKTA Pure型蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司；Prostar 218 LC型semi-P-HPLC儀、1200 LC型HPLC儀美國安捷倫公司；Arium Comfort型超純水儀 德國賽多利斯公司；Easy-nLC 1000型納升級(jí)液相色譜儀、Q Exactive型質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 棉籽蛋白酶解產(chǎn)物制備

準(zhǔn)確稱取5.0 g棉籽分離蛋白粉，加入250 mL蒸餾水配制成2%的蛋白溶液，加入胃蛋白酶5 000 U/g底物，在37 ℃，pH 2.0條件下酶解2 h，用0.9 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至5.3，加入胰蛋白酶5 000 U/g底物后，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.6，37 ℃恒溫振蕩酶解2 h，100 ℃滅酶10 min終止消化反應(yīng)，并參照鄰苯二甲醛（ortho-phthalaldehyde，OPA）法[22]測定其水解度。

冷凍干燥所得酶解產(chǎn)物，用滅菌水（121 ℃，高壓蒸汽滅菌21 min）溶解，配成100 mg/mL的酶解產(chǎn)物溶液，用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌，檢測其抗菌活性，并作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)樣品備用。

1.3.2 抗菌活性測定

參考王娣等[23]報(bào)道的濾紙片-瓊脂擴(kuò)散法，以50 μg/mL的抗生素卡那霉素（kanamycin，Kan）為對(duì)照測定酶解產(chǎn)物及分離所得不同組分的抗菌活性。

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床過夜培養(yǎng)，用紫外分光光度計(jì)在600 nm波長處調(diào)節(jié)菌懸液光密度（optical density，OD）值至1，即菌落形成約為1×108CFU/mL，再稀釋1 000 倍（逐步依次稀釋10 倍，稀釋3 次），備用。

取熔化的LB固體培養(yǎng)基及營養(yǎng)肉汁-瓊脂培養(yǎng)基約20 mL倒入無菌培養(yǎng)皿中，水平放置，待其凝固后，在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記菌種及濾紙片的擺放位置等。取100 μL菌液均勻涂布于相應(yīng)固體培養(yǎng)基上，待菌液完全滲入培養(yǎng)基后，在不同的標(biāo)記位置上放上對(duì)應(yīng)藥液浸泡后的濾紙片，重復(fù)3 次。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，測定抑菌圈直徑大小，以此為指標(biāo)確定抗菌能力。

1.3.3 UF分離

將具有抗菌活性的棉籽蛋白酶解產(chǎn)物依次經(jīng)過截流分子質(zhì)量（MW）為10 kD和3 kD UF膜進(jìn)行離心超濾[24]， 4 000 r/min，離心50 min，將酶解液按分子質(zhì)量大小分為3 部分：U-Ⅰ（MW≥10 kD）、U-Ⅱ（10 kD＞MW≥3 kD）及U-Ⅲ（3 kD＞MW）。收集每部分的超濾液，真空冷凍干燥得到各組分肽粉，用滅菌水（121 ℃，高壓蒸汽滅菌21 min）將所得各組分的肽粉配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液，并檢測其抗菌活性（檢測方法見1.3.2節(jié)），選取抗菌活性最強(qiáng)的組分作為進(jìn)一步分離純化樣品。

1.3.4 AEC分離

對(duì)UF后抗菌活性較強(qiáng)的組分進(jìn)行AEC分離純化，其純化條件如下：色譜柱：QFF 1 mL GE；緩沖液：A為20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），B為含1 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）；波長：220 nm；進(jìn)樣量：約為4 mL；流速：1 mL/min；洗脫條件：先用緩沖液A洗脫15 個(gè)體積，然后采用緩沖液B從0%～100%梯度洗脫20 個(gè)體積，再用A洗脫5 個(gè)體積。

收集每個(gè)洗脫峰，真空冷凍干燥，配成10 mg/mL的溶液，并檢測每個(gè)洗脫峰的抗菌活性，選取抗菌活性最強(qiáng)的峰組分作為進(jìn)一步分離純化樣品。

1.3.5 semi-P-HPLC分離

semi-P-HPLC對(duì)AEC得到的活性最高的組分進(jìn)一步分離純化，其分離條件為：色譜柱：Innoval C18（21.2 mm×250 mm，4.5 μm）；洗脫液A：含0.5%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）超純水（超聲處理15 min，以除去氣泡），洗脫液B：乙腈；波長：220 nm；進(jìn)樣量：1 mL；流速：10 mL/min；采用梯度洗脫：0～50 min，洗脫液B從5%逐漸升至20%，A相應(yīng)從95%降至80%；50～55 min，用20% B及80% A進(jìn)行洗脫；55.0～55.1 min，洗脫液B從20%降至5%，A相應(yīng)從80%升至95%；55.1～60.0 min，5% B及95% A洗脫5 min。

收集分離的單一峰，進(jìn)行真空冷凍干燥，測定每個(gè)收集峰的抗菌活性，并用HPLC檢測其純度。

1.3.6 抗菌肽純度檢測

使用分析型HPLC對(duì)分離純化出的棉籽抗菌活性肽進(jìn)行純度檢測，色譜條件如下：色譜柱：Innoval C18（ 4.6 mm×250 mm，4.5 μm）；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：25 μL；流速：1 mL/min；流動(dòng)相：含0.1% TFA的超純水和乙腈；洗脫條件：5%～10%乙腈梯度洗脫30 min。

1.3.7 抗菌肽的氨基酸結(jié)構(gòu)測定

首先采用毛細(xì)管HPLC對(duì)抗菌活性肽進(jìn)行脫鹽處理，色譜條件如下：色譜柱：Column Technology Inc RP-C18（0.15 mm×120 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸的水溶液，B為含0.08%甲酸的80%乙腈溶液；檢測波長：220 nm；柱溫：300 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：600 nL/min；采用梯度洗脫：0～8 min，洗脫液B從6%逐漸升至9%，A相應(yīng)從94%降至91%；8～24 min，洗脫液B從9%逐漸升至14%，A相應(yīng)從91%降至86%；24～60 min，洗脫液B從14%逐漸升至30%，A相應(yīng)從86%降至70%；60～75 min，洗脫液B從30%逐漸升至40%，A相應(yīng)從70%降至60%；75～78 min，洗脫液B從40%升至95%，A相應(yīng)從60%降至5%；78～85 min，95% B及5% A進(jìn)行洗脫；85～86 min，洗脫液B從95%降至6%，A相應(yīng)從5%升至94%；86～90 min，6% B及94% A進(jìn)行洗脫。

酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管HPLC脫鹽及分離后用Q Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測方式：正離子；母離子掃描范圍：m/z 50～750；多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：一級(jí)質(zhì)譜在m/z 200時(shí)分辨率為70 000；一級(jí)延遲時(shí)間：10 ms；每次全掃描后采集10 個(gè)碎片圖譜；二級(jí)在m/z 200時(shí)分辨率為17 500；二級(jí)最大延遲時(shí)間：60 ms。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬消化酶解CPI

體外模擬消化所得C P I酶解產(chǎn)物的水解度為（24.72±1.07）%，對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌都有一定的抗性，其抑菌圈直徑大小分別為（1.10±0.06） cm和（0.80±0.08） cm，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

2.2 UP結(jié)果

表1 酶解物UP后各組分抑菌圈直徑Table 1 Inhibitory zone diameters of ultrafiltration fractions of cottonseed protein hydrolysates

將具有抗菌活性的CPI酶解產(chǎn)物，依次通過10 kD、 3 kD分子截流量進(jìn)行超濾，使其按分子質(zhì)量大小分為U-Ⅰ、U-Ⅱ、U-Ⅲ，并通過濾紙片-瓊脂擴(kuò)散法測定各組分的抗菌活性。通過抑菌圈大小看出U-Ⅲ對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有抗菌活性，其抑菌圈直徑分別為（1.17±0.03）cm和（0.76±0.03）cm，而另外兩個(gè)組分U-Ⅰ、U-Ⅱ?qū)煞N菌均未發(fā)現(xiàn)抑制活性（表1）。因此，選擇抗菌活性最強(qiáng)的組分U-Ⅲ作為進(jìn)一步分離純化的樣品。

2.3 AEC分析

使用AEC對(duì)U-Ⅲ進(jìn)一步分離純化，根據(jù)出峰情況收集得到3 個(gè)洗脫峰：QF-Ⅰ、QF-Ⅱ、QF-Ⅲ，如圖1所示。

分離U-Ⅲ的洗脫圖譜Fig. 1 Elution profile of U-圖1 AECⅢ by AEC

表2 AEC分離U-Ⅲ所得組分抑菌圈直徑Table 2 Inhibitory zone diameters of fractions separated from U-Ⅲ by AEC

以抑菌圈直徑為指標(biāo)，檢測收集的洗脫峰的抗菌活性。由表2可知，QF-Ⅰ對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（0.70±0.05） cm，而對(duì)大腸桿菌沒有抑制能力；QF-Ⅱ?qū)Υ竽c桿菌及金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抗菌能力，其抑菌圈直徑分別為（1.25±0.06） cm和（1.10±0.04） cm，顯著高于QF-Ⅰ和QF-Ⅲ（P＜0.05）。因此，選擇QF-Ⅱ進(jìn)行抗菌肽的進(jìn)一步分離純化。

2.4 semi-P-HPLC分析

使用semi-P-HPLC技術(shù)對(duì)AEC所得的抗菌活性最強(qiáng)的組分QF-Ⅱ進(jìn)行分離純化，得到4 個(gè)主要肽峰PF-Ⅰ、PF-Ⅱ、PF-Ⅲ及PF-Ⅳ（圖2）。

圖2 semi-P-HPLC分離純化QF-Ⅱ圖譜Fig. 2 Semi-preparative HPLC profile of QF-Ⅱ

表3 semi-P-HPLC分離QF-Ⅱ所得組分抑菌圈直徑Table 3 Inhibitory zone diameters of four fractions separated from QF-Ⅱ by semi-preparative HPLC

由表3可知，抗菌活性測定結(jié)果表明PF-Ⅲ的抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（1.13±0.07） cm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為（1.14±0.05） cm。PF-Ⅳ對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為（0.97±0.08） cm，而對(duì)金黃色葡萄球菌未見抑制活性。

2.5 抗菌肽純度分析

采用HPLC對(duì)抗菌活性肽PF-Ⅲ純度進(jìn)行檢測結(jié)果如圖3所示，其純度（峰面積）在95%以上，可對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列分析。

圖3 棉籽抗菌肽PF-Ⅲ的HPLC圖譜Fig. 3 HPLC chromatogram of PF-Ⅲ

2.6 抗菌肽的氨基酸序列結(jié)果

圖4 PF-Ⅲ的ESI-MS/MS圖Fig. 4 ESI-MS/MS spectrum of PF-III

在ESI-MS/MS儀中，利用能量場對(duì)帶電多肽離子進(jìn)行轟擊使其氨基酸序列斷裂形成多肽片段離子，得到PF-Ⅲ二級(jí)質(zhì)譜圖（圖4），根據(jù)碎片離子的斷裂位置，片段離子可以分成6 種，即N端的a、b、c離子和C端的x、y、z離子，通常以b、y離子讀出氨基酸序列，片段離子匹配容差為20 mmu。通過氨基酸序列分析圖譜（圖5）分析得到，該棉籽抗菌活性肽PF-Ⅲ的氨基酸序列為ISGLIyEETR（Ile-Ser-Gly-Leu-Ile-Tyr-Glu-Glu-Thr-Arg）。

圖5 PF-Ⅲ氨基酸序列分析圖Fig. 5 Amino acid sequence analysis

3 討 論

通過分子截流量為10 kD和3 kD的UF膜對(duì)棉籽分離蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)得到U-Ⅰ（MW≥10 kD）、U-Ⅱ（10 kD≥MW≥3 kD）及U-Ⅲ（3 kD≥MW）3 個(gè)組分，所得組分的抗菌活性檢測結(jié)果顯示分子質(zhì)量最小的UF組分（U-Ⅲ）抗菌活性最強(qiáng)，這與研究報(bào)道的抗菌活性肽分子質(zhì)量較小相一致[13]。進(jìn)一步采用AEC對(duì)U-Ⅲ進(jìn)行分離得到3 個(gè)洗脫峰QF-Ⅰ、QF-Ⅱ及QF-Ⅲ，其中QF-Ⅱ的抗菌能力最強(qiáng)。采用semi-P-HPLC從QF-Ⅱ中分離純化得到4 個(gè)洗脫峰，抗菌活性檢測結(jié)果顯示PF-Ⅲ的抗性最強(qiáng)，進(jìn)一步使用分析型HPLC對(duì)其純度進(jìn)行分析，為單一峰，ESI-MS/MS分析得到其氨基酸序列為ISGLIyEETR。

盡管對(duì)抗菌活性肽做了大量研究[25-26]，但其確切的作用機(jī)制尚不明確，可能是促使細(xì)胞形成跨膜孔[27]，抑制細(xì)胞壁或核酸的合成[28]，或者激活宿主細(xì)胞內(nèi)的自溶酶系統(tǒng)從而抑制細(xì)菌的生長繁殖[29-30]，因此可根據(jù)該抗菌活性肽的氨基酸序列進(jìn)行化學(xué)合成，并對(duì)其抗菌機(jī)制展開研究。

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Purification and Identification of Antibacterial Peptides from Cottonseed Protein Isolate Hydrolysates

HAN Xiaoyan1, BAO Yuming1, XIN Fengjiao1, HUANG Ying1, Christophe BLECKER2, DAI Xiaofeng1,*
(1. Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. Department of Food Science, University of Liège, Liège 999013, Belgium)

Cottonseed protein isolate (CPI) was digested in vitro to prepare hydrolysates with antibacterial activity. Ultrafiltration (UF), anion exchange chromatography (AEC), and semi preparative high performance liquid chromatography (semi-P-HPLC) were used to isolate and purify antibacterial peptides from CPI hydrolysates, and the purified peptides were sequenced by electrospray ionization-tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS). During the purification process, CPI hydrolysates were separated into three fractions: U-Ⅰ, U-Ⅲ and U-III by UF and the obtained U-Ⅲ, with higher antibacterial ability, was further separated into QF-Ⅰ, QF-Ⅱ and QF-Ⅲ by AEC. After filtration, QF-Ⅱ, which showed higher antibacterial ability, was further fractionated using semi-P-HPLC into four subfractions: PF-Ⅰ, PF-Ⅱ, PF-Ⅲ and PF-Ⅳ, among which, PF-Ⅲ was determined to have the highest antibacterial activity. The purity of PF-Ⅲ showed a single peak in HPLC. Finally, by ESI-MS/MS, and the amino acid sequence of the peptide was identified as ISGLIYEETR (Ile-Ser-Gly-Leu-Ile-Tyr-Glu-Glu-Thr-Arg).

cottonseed protein isolate hydrolysates; peptide with antibacterial activity; isolation and purification; amino acid sequence

10.7506/spkx1002-6630-201711020

TS201.3

A

1002-6630（2017）11-0122-06

韓曉燕, 包郁明, 辛鳳姣, 等. 棉籽抗菌活性肽的分離純化及鑒定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(11): 122-127. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201711020. http://www.spkx.net.cn

HAN Xiaoyan, BAO Yuming, XIN Fengjiao, et al. Purification and identification of antibacterial peptides from cottonseed protein isolate hydrolysates[J]. Food Science, 2017, 38(11): 122-127. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201711020. http://www.spkx.net.cn

2016-05-18

科技部國際科技合作項(xiàng)目（2016-X31）

韓曉燕（1989—），女，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：hanxiaoyan131@126.com

*通信作者：戴小楓（1962—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)榧庸び泻ι锓揽?。E-mail：daixiaofeng@caas.cn