謝敏玉，王亞龍，李心花，熊 麗，文 慧，胡海燕，張靜夏*

(1.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣州市賽普特醫(yī)藥科技股份有限公司，廣東 廣州 510663)

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神經(jīng)保護(hù)劑3β，5α，6β-雄甾三醇原料藥中3種非對映異構(gòu)體的分離與含量測定

謝敏玉1，2，王亞龍1，李心花1，熊 麗2，文 慧2，胡海燕1，張靜夏1*

(1.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣州市賽普特醫(yī)藥科技股份有限公司，廣東 廣州 510663)

建立了分離與測定3β，5α，6β-雄甾三醇(YC-6)原料藥中3種非對映異構(gòu)體的氣相色譜方法。進(jìn)行了分離條件的優(yōu)化及方法學(xué)驗證。研究結(jié)果表明：該方法可對YC-6與各非對映異構(gòu)體進(jìn)行分離，專屬性良好(分離度≥1.5)，精密度高(RSD≤2.0%)；YC-6在6.0～30.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。測定了非對映異構(gòu)體的響應(yīng)因子(1.59，1.32 和1.41)，并采用加校正因子的主成分自身對照內(nèi)標(biāo)法以峰面積計算各非對映異構(gòu)體的含量。該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于YC-6原料中各非對映異構(gòu)體的分離及含量測定。

3β，5α，6β-雄甾三醇；非對映異構(gòu)體；含量測定；氣相色譜(GC)

腦卒中是嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疾病，神經(jīng)保護(hù)劑是腦卒中防治的重要研究領(lǐng)域，神經(jīng)甾體類活性化合物有望成為一類新的神經(jīng)元保護(hù)劑[1-5]。3β，5α，6β-雄甾三醇(YC-6)及類似物在多種動物和細(xì)胞水平的神經(jīng)損傷模型上表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)元保護(hù)效果[6-7]，是非常有應(yīng)用前景的神經(jīng)元保護(hù)劑，目前正在進(jìn)行臨床Ⅰ期試驗。YC-6是以去氫表雄酮為原料，通過17-位羰基的黃鳴龍反應(yīng)、甲酸/H2O2體系氧化和堿解反應(yīng)獲得[7]；該合成過程中，5，6位的2個手性碳由潛手性的5，6位雙鍵轉(zhuǎn)化所得，理論上會得到4個手性光學(xué)異構(gòu)體；由于目標(biāo)產(chǎn)物含有8個手性碳，其中6個手性碳和起始原料去氫表雄酮的構(gòu)型一致，理論上，YC-6和3個光學(xué)異構(gòu)體之間的關(guān)系為非對映異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 YC-6及3個非對映異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)

YC-6作為國內(nèi)自主研發(fā)的1.1類抗腦卒中新藥，尚無文獻(xiàn)報道該化合物中非對映異構(gòu)體的檢測方法。在新藥研發(fā)過程的質(zhì)量控制研究中，光學(xué)異構(gòu)體的分離檢測是藥物研發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)問題，雖然已有許多文獻(xiàn)報道一些藥物的光學(xué)異構(gòu)體的檢測方法[8-15]，但由于每類化合物的結(jié)構(gòu)特殊性，導(dǎo)致獲得簡便而高效的光學(xué)異構(gòu)體的分析方法仍是藥物研發(fā)過程中亟需解決的瓶頸問題。本研究擬采用氣相色譜法實現(xiàn)YC-6與非對映異構(gòu)體的分離與含量測定，以期為YC-6原料藥中非對映異構(gòu)體的雜質(zhì)檢查提供一個簡便而有效的實驗方法，相關(guān)研究對其進(jìn)一步臨床試驗及生產(chǎn)中非對應(yīng)異構(gòu)體含量的控制具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890A GC System氣相色譜儀(美國Agilent公司)，含F(xiàn)ID 檢測器；色譜柱：Agilent DB-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)，XS205 型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，SK5200H 超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司) 。

3β，5α，6β-雄甾三醇原料藥(簡稱YC-6，批號：101030，110214，110225，110228，110620，110622，110629)，3β，5α，6β-雄甾三醇對照品(批號：100913，純度為99.60%，1H NMR(DMSO)，δ：4.40，4，16，3.80，3.65，3.30，1.86-1.03，0.88，0.67)。

非對映異構(gòu)體-Ⅰ對照品 (簡稱異構(gòu)體-Ⅰ，化學(xué)名為3β，5β，6β-雄甾三醇，1H NMR(DMSO)，δ：5.03，4.79，4.04，3.96-3.89，3.34，1.89-0.99，0.98-0.88，0.67)。

非對映異構(gòu)體-Ⅱ?qū)φ掌?簡稱異構(gòu)體-Ⅱ，化學(xué)名為3β，5β，6α-雄甾三醇，1H NMR(DMSO)，δ：5.16，4.65，4.04，4.00，3.55-3.46，1.79-0.86，0.81，0.65)。

非對映異構(gòu)體-Ⅲ對照品(簡稱異構(gòu)體-Ⅲ，3β，5α，6α-雄甾三醇，1H NMR(DMSO)，δ：5.33，5.08，4.39，4.06，2.16-2.17，1.75-1.20，1.10，0.69)。

以上樣品均由本實驗室自制，內(nèi)標(biāo)物黃體酮購自中國藥品生物制品檢定所，批號：027-8004。

1.2 溶液的配制

1.2.1 對照品溶液 分別取適量YC-6、異構(gòu)體-Ⅰ、異構(gòu)體-Ⅱ及異構(gòu)體-Ⅲ，用乙腈溶解并稀釋成每1 mL中約含10 μg樣品的對照溶液。

1.2.2 校正因子測定溶液 分別取適量異構(gòu)體-Ⅰ、異構(gòu)體-Ⅱ及異構(gòu)體-Ⅲ，各加入適量YC-6，用乙腈溶解并稀釋成每1 mL中約含10 μg異構(gòu)體及YC-6的對照溶液。

1.2.3 系統(tǒng)適用性溶液 適量YC-6對照品、異構(gòu)體-Ⅰ、異構(gòu)體-Ⅱ、異構(gòu)體-Ⅲ及黃體酮(內(nèi)標(biāo))，用乙腈溶解并稀釋成每 1 mL含YC-6對照品 2 mg，異構(gòu)體-Ⅰ、異構(gòu)體-Ⅱ、異構(gòu)體-Ⅲ及黃體酮各約10 μg的混合溶液。

1.2.4 供試品溶液與0.5%對照溶液 取YC-6原料藥的粉末適量，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液(100 mg/L)，加入乙腈使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成每1 mL含YC-6約2 mg和黃體酮約10 μg的供試品溶液；取對照品溶液適量，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液(100 mg/L)，用乙腈稀釋成每1 mL中約含10 μg YC-6和10 μg 黃體酮的溶液作為0.5%對照溶液。

1.3 分析方法

以5%苯基-95%聚二甲基硅氧烷為固定液的毛細(xì)管柱為色譜柱(DB-5MS：30 m×250 μm×0.25 μm毛細(xì)管柱適用)；程序升溫：起始溫度為220 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃保持24 min；檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID)，檢測器溫度為280 ℃；進(jìn)樣口溫度為280 ℃，分流進(jìn)樣，分流比為10∶1；載氣為氮?dú)?，流速?.5 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的優(yōu)化 分別考察了HP-5,DB-1701,DB-5MS 3種型號毛細(xì)管柱對主峰與各非對映異構(gòu)體分離度的影響，起始溫度220 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃保持10 min，氮?dú)饬魉倬鶠? mL/min。

研究結(jié)果顯示，HP-5，DB-1701與DB-5MS柱上，主成分與相鄰的非對映異構(gòu)體之間的分離度分別為1.51，1.25和1.95。HP-5與DB-5MS兩種色譜柱上，YC-6與各非對映異構(gòu)體的分離度均符合要求。但DB-5MS的色譜分離中，主峰與其之前的峰具有更好的分離度，因此選擇DB-5MS色譜柱考察條件下各峰的分離度為12.43，2.93和1.47。

2.1.2 進(jìn)樣口溫度的優(yōu)化 GC法能否作為YC-6中各異構(gòu)體的檢查方法的首要條件是，進(jìn)樣時YC-6及其異構(gòu)體能否氣化、氣化是否完全以及各物質(zhì)是否發(fā)生分解。取“1.2.3”配制的系統(tǒng)適用性溶液，采用“1.3”方法，考察其在不同進(jìn)樣口溫度(220，260，280 ℃)下樣品的檢出情況(面積歸一化法計算各峰的百分含量)。

研究結(jié)果顯示，不同進(jìn)樣口溫度對YC-6的峰面積及百分峰面積的檢出基本一致，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.9%和0.3%，均小于2.0%；但對于3個非對映異構(gòu)體，其峰面積及百分峰面積的檢出，RSD值均大于5.0%；初步判斷當(dāng)進(jìn)樣口溫度為220 ℃時，樣品未完全氣化。從YC-6及各異構(gòu)體的峰面積、百分峰面積、峰形、分離度方面進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在進(jìn)樣口溫度280 ℃下，YC-6及各異構(gòu)體的氣化完全且穩(wěn)定，故選擇進(jìn)樣口溫度為280 ℃。

2.1.3 柱溫的優(yōu)化 在氣相色譜法中，不同的柱溫影響待測物質(zhì)的分離。取“1.2.3”配制的系統(tǒng)適用性溶液，采用“1.3”分析方法，考察了不同柱溫條件下YC-6與各異構(gòu)體的分離效果，實驗結(jié)果見表1。研究顯示，3種程序升溫方式中，YC-6與異構(gòu)體-Ⅲ之間的分離度均符合要求。綜合考慮，選擇條件1的色譜條件進(jìn)行考察，即起始溫度為220 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃，保持24 min。

表1 不同柱溫下樣品中各色譜峰之間的分離度(R)

2.1.4 供試品濃度的篩選 非對映異構(gòu)體能否被檢出，除了色譜條件外，供試品溶液的濃度能否達(dá)到其檢測靈敏度也很重要。考察了供試品溶液質(zhì)量濃度(0.5，1.0，2.0 mg/mL)的影響，結(jié)果顯示，進(jìn)樣2 mg/mL的供試品溶液，能檢出0.05%以下的雜質(zhì)，故選擇供試品溶液的質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 專屬性 分別取4個對照品溶液和系統(tǒng)適用性溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，按照“1.3”方法測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，YC-6與異構(gòu)體-Ⅰ、異構(gòu)體-Ⅱ、異構(gòu)體-Ⅲ及黃體酮(內(nèi)標(biāo))均能有效分離，YC-6與峰前異構(gòu)體-Ⅲ的分離度大于1.5，符合分離要求。表明本方法專屬性良好，適用于YC-6及其非對映異構(gòu)體的測定，色譜分離結(jié)果見圖2。

圖2 專屬性色譜圖Fig.2 Chromatogram of method specificity 1.3β，5β，6β-androstriol，2.3β，5α，6α-androstriol，3.3β，5α，6α-androstriol，4.YC-6，5.progesterone

2.2.2 檢出限 取 YC-6 對照品溶液及異構(gòu)體-Ⅰ、異構(gòu)體-Ⅱ、異構(gòu)體-Ⅲ對照品溶液用乙腈分別逐步稀釋，取稀釋溶液按照“1.3”方法測定。以 3倍信噪比(S/N=3)計算，得YC-6、異構(gòu)體-Ⅰ、異構(gòu)體-Ⅱ和異構(gòu)體-Ⅲ的檢出限分別為1.0，2.5，2.0，2.0 mg/L。

2.2.3 定量下限 取 YC-6 對照品溶液及異構(gòu)體-Ⅰ、異構(gòu)體-Ⅱ和異構(gòu)體-Ⅲ對照品溶液，用乙腈分別逐步稀釋，取稀釋溶液進(jìn)樣分析。以10倍信噪比(S/N=10)計算，得到Y(jié)C-6、異構(gòu)體-Ⅰ、異構(gòu)體-Ⅱ及異構(gòu)體-Ⅲ的定量下限分別為5.07,6.96,6.44,6.00 mg/L。

2.2.4 相對校正因子 取“1.2.2”的校正因子測定溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，按照“1.3”方法測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。經(jīng)計算，異構(gòu)體-Ⅰ、異構(gòu)體-Ⅱ、異構(gòu)體-Ⅲ對YC-6的相對校正因子分別為1.59，1.32，1.41。結(jié)果表明，各異構(gòu)體對主成分的相對校正因子均在0.9～1.1范圍之外，不適宜直接采用主成分的自身對照法計算異構(gòu)體含量，本文采用加校正因子的主成分自身對照內(nèi)標(biāo)法以峰面積計算異構(gòu)體的含量。

2.2.5 線性關(guān)系 取YC-6對照品適量，精密稱定，用乙腈溶解并稀釋成6.0，10.0，16.0，20.0，30.0 mg/L 的 YC-6 梯度對照品溶液(含10 mg/L的內(nèi)標(biāo))。精密量取上述溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀，按照“1.3”方法測定，記錄色譜圖。以YC-6的濃度(ρ，mg/L)對YC-6與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(A/A0)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A/A0=0.093 8ρ-0.033 8(r2=0.999 6)。結(jié)果表明，YC-6在6.0 ～30.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積比呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 進(jìn)樣精密度試驗 取“1.2.3”的0.5%對照溶液，精密量取1 μL注入氣相色譜儀，按照“1.3”方法測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以YC-6與黃體酮的濃度和峰面積計算校正因子，6次測定結(jié)果平均校正因子的RSD(n=6) 為0.7%，表明對照品溶液的進(jìn)樣精密度良好，符合測定要求。

2.2.7 重復(fù)性試驗 稱取YC-6樣品6份，精密稱定，分別精密加入內(nèi)標(biāo)溶液(100 mg/L)，加乙腈使之溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含YC-6約2 mg和含黃體酮約10 μg的供試品溶液。精密量取該供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，按照“1.3”方法測定，記錄色譜圖。采用主成分自身對照內(nèi)標(biāo)法計算含量，主峰YC-6的含量為99.16%，RSD為0.01%；各異構(gòu)體含量的RSD均小于2.0%。表明本法的重復(fù)性良好，各異構(gòu)體測定的精密度良好，符合測定要求。

2.2.8 溶液穩(wěn)定性試驗 取“1.2.4”的供試品溶液，分別于0，2，4，8，9，12 h 精密量取1 μL，注入氣相色譜儀，按“1.3”方法測定，記錄色譜圖，采用主成分自身對照內(nèi)標(biāo)法計算含量。結(jié)果顯示，主峰YC-6的RSD (n=6 )為0.2%，各異構(gòu)體峰的RSD (n=6 )均不大于2.0%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 樣品中異構(gòu)體的含量測定

精密量取0.5%對照溶液1 μL，注入氣相色譜儀；取供試品溶液1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時間的2倍。供試品溶液的色譜圖中如檢測出異構(gòu)體峰，按加校正因子的主成分自身對照內(nèi)標(biāo)法以峰面積計算異構(gòu)體的含量。利用該分析方法，對合成的6批YC-6樣品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，6批樣品中均未檢出異構(gòu)體-Ⅰ和異構(gòu)體-Ⅱ，而異構(gòu)體-Ⅲ的含量均低于0.10%。

3 結(jié) 論

本文建立了氣相色譜法分離和測定YC-6原料藥中非對映異構(gòu)體的方法。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、簡單方便、檢測成本低，能夠滿足臨床試驗及工業(yè)化生產(chǎn)中YC-6原料藥中非對映異構(gòu)體的分離及含量檢測要求。

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Separation and Determination of Three Diasteromers in Neuroprotectant 3β，5α，6β-Androstriol Bulk Drug

XIE Min-yu1，2，WANG Ya-long1，LI Xin-hua1，XIONG Li2，WEN Hui2，HU Hai-yan1，ZHANG Jing-xia1*

(1.School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China；2.Guangzhou Cellprotek Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，China)

A GC method for the separation and determination of three diasteromers in neuroprotectant 3β，5α，6β-androstriol(YC-6) bulk drug was developed.The separation conditions such as column type，injection port temperature，column temperature and sample concentrate were optimized，and method validation was developed.The results showed that the method had a good specificity(resolution(R) ≥1.5) and a good precision(RSD≤2.0%，n=6).The calibration curve showed a good linearity over the concentration range of 6.0-30.0 μg/mL for YC-6.The response factors of three diasteromers were 1.59，1.32 and 1.41，respectively，and their contents were detected by principal component self-comparison with calibration factor and internal standard method.The method was simple，sensitive and valid，and was successfully applied in the analysis of diasteromers in neuroprotectant 3β，5α，6β-androstriol bulk drug.

3β，5α，6β-androstriol; diasteromers; content determination; gas chromatography(GC)

2017-02-04；

2017-03-28

廣東省重大科技專項(2012A080201008)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.020

O657.71;TQ460.72

A

1004-4957(2017)06-0812-05

*通訊作者：張靜夏，博士，副教授，研究方向：新藥研究與開發(fā)，Tel：020-39943063，E-mail：jingxiaz@163.com