譚 杰，杜苑琪，肖小華，李攻科

(中山大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

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食品中霉菌毒素樣品前處理及分析方法研究進(jìn)展

譚 杰，杜苑琪，肖小華*，李攻科*

(中山大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

霉菌毒素廣泛存在于食物和動(dòng)物飼料中，可經(jīng)食物鏈傳遞危及動(dòng)物與人體健康，帶來嚴(yán)重的食品安全問題。食品基體復(fù)雜，霉菌毒素結(jié)構(gòu)多樣、含量極低，其分離分析需要高效的前處理技術(shù)及快速靈敏的分析方法。該文綜述了基于分子印跡聚合物、量子點(diǎn)材料、石墨烯類碳材料、生物材料等新型分離介質(zhì)的固相(微)萃取、液相(微)萃取、免疫親和層析、磁分離等樣品前處理技術(shù)及液相色譜-質(zhì)譜、免疫分析法、生物傳感器等分析方法在食品霉菌毒素分析中的應(yīng)用，并展望了其發(fā)展趨勢。

食品；霉菌毒素；樣品前處理；分析方法；綜述

霉菌毒素是霉菌的次生代謝產(chǎn)物，不僅可使血管發(fā)生擴(kuò)張、收縮或?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重傷害，而且有些毒素(如黃曲霉毒素)還具有嚴(yán)重的致癌、致畸、致突變性[1]。霉菌毒素根據(jù)其繁殖環(huán)境可分為田間霉菌毒素和倉儲(chǔ)霉菌毒素，其中田間霉菌毒素是農(nóng)作物在田間生長過程中受霉菌污染而分泌，主要包括萎蔫酸、煙曲霉毒素、念珠菌毒素、單端孢霉烯毒素、嘔吐毒素、蛇形菌素等；倉儲(chǔ)霉菌毒素是谷物在儲(chǔ)藏過程中受霉菌污染而產(chǎn)生，主要包括黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)、青霉菌毒素等。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，霉菌毒素可分為剛性共面苯環(huán)結(jié)構(gòu)(如黃曲霉毒素)、部分共面結(jié)構(gòu)(如玉米赤霉烯酮(也稱F-2毒素)和赫曲霉毒素(OTA))以及非共面倍半萜烯結(jié)構(gòu)(如嘔吐毒素和T-2毒素)3大類，常見的毒素結(jié)構(gòu)如圖1所示。

霉菌毒素廣泛存在于花生、蠶豆、豌豆、玉米、小麥等食物中，尤其是易被霉菌污染的谷物、堅(jiān)果、果脯、咖啡、可可粉、香料、油籽、干豌豆、黃豆等。這些食物在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過程中的任一環(huán)節(jié)均可能受到霉菌的污染，而霉菌毒素普遍耐高溫、化學(xué)性質(zhì)極其穩(wěn)定，因此常規(guī)的食物加工條件無法將它們破壞或除去[2]；食用含有這些霉菌毒素的食物可導(dǎo)致人體一系列疾病[3]，從而引發(fā)嚴(yán)重的食品安全事件。因此，對(duì)食品中霉菌毒素進(jìn)行快速準(zhǔn)確分析檢測具有重要意義。但是，這些毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異大、含量跨度范圍廣且樣品基體復(fù)雜多變，其快速高效的樣品前處理方法和靈敏準(zhǔn)確的分析方法研究成為近年來的熱點(diǎn)。目前，基于分子印跡聚合物(MIPs)、量子點(diǎn)材料(QDs)、石墨烯類碳材料、生物材料等新型分離介質(zhì)的高效樣品前處理技術(shù)[4]如固相萃取(SPE)、QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)、液相微萃取、磁分離、免疫親和層析等，以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[5]和生物傳感器等高靈敏分析方法在霉菌毒素分析中的應(yīng)用越來越多。本文綜述了近年來食品中霉菌毒素的樣品前處理技術(shù)和分析方法研究進(jìn)展，并展望了其發(fā)展趨勢。

圖1 常見霉菌毒素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of typical mycotoxins

1 霉菌毒素樣品前處理方法研究進(jìn)展

常用的霉菌毒素樣品前處理方法有固相萃取法、QuEChERS法、液相微萃取法、免疫親和層析法與磁分離技術(shù)等，表1總結(jié)了常用的霉菌毒素樣品前處理方法的適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 常用的霉菌毒素樣品前處理方法的適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)

1.1 固相萃取法

固相萃取法(Solid-phase extraction，SPE)是目前食品中霉菌毒素分析的主要前處理方法。需要根據(jù)霉菌毒素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)選擇合適的吸附劑，傳統(tǒng)的吸附劑包括硅藻土、人造絲、藍(lán)棉、C18、聚合物吸附劑[14]等。近年來，一些新的分離介質(zhì)如石墨烯類碳材料、分子印跡材料、金屬有機(jī)骨架(MOFs)材料等逐步得到應(yīng)用。Wang等[15]比較了C18，PSA，HLB，MCX，Silica，NH26種不同吸附劑對(duì)鏈格孢毒素、赭曲霉毒素A(OTA)、棒曲霉素和桔青素等8種霉菌毒素的吸附效果，發(fā)現(xiàn)MCX和NH2的吸附效果較好。

碳納米管、石墨烯等碳材料具有較大的比表面積和良好吸附性能，常用于SPE等前處理方法中。將多壁納米管涂覆到十八烷基硅膠修飾的磁性納米粒子上后[16]，這類磁性納米粒子對(duì)霉菌毒素具有很好的吸附效果，可用于玉米中痕量玉米赤霉烯酮(ZEN)及其次級(jí)代謝產(chǎn)物(包括β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇和玉米赤霉酮)的富集和凈化。將含羧基的氧化石墨烯與含氨基的二氧化硅微球偶聯(lián)制得的二氧化硅-氧化石墨烯復(fù)合材料作為固相萃取材料，利用氧化石墨烯的良好吸附能力，用于植物油中黃曲霉毒素 B1(AFB1)和B2(AFB2)的高效富集[17]，經(jīng)HPLC分析后的檢出限分別為0.17，0.05 μg/L。

采用分子印跡材料作為吸附劑，可改善SPE的選擇性并提高分析方法的靈敏度[18-20]，其與固相萃取、固相微萃取等聯(lián)用技術(shù)可進(jìn)一步解決樣品中的基質(zhì)干擾問題。如以商品化的印跡萃取柱AFFINIMIP富集啤酒、紅酒、葡萄汁中赭曲霉毒素時(shí)[21]，單支萃取柱可循環(huán)使用10次以上。將OTA印跡材料通過大孔膜密封在微固相萃取柱中，富集后將萃取柱取出并超聲解吸[22]，結(jié)合HPLC方法可高靈敏地分析咖啡、葡萄汁和尿液中的赭曲霉毒素，其檢出限低至0.06 ng/g和0.02 ng/mL。Abou-Hany等[23]采用4種結(jié)構(gòu)類似交鏈孢霉素的模板制備分子印跡聚合物微粒，實(shí)現(xiàn)了西紅柿等樣品中交鏈孢霉素的選擇性富集測定。由于霉曲毒素標(biāo)準(zhǔn)品量少價(jià)高，直接采用目標(biāo)毒素作為模板分子的成本較高。因此，采用便宜易得、具有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物作為替代模板分子開展印跡聚合物研制受到了廣泛關(guān)注，如以2-萘甲酸作為桔霉素的替代模板、2,4-二羥基苯甲酸環(huán)十二酯作為ZEN的替代模板[24]；以吡啶甲酸為鐮孢菌酸的模板分子[25]；或以N-(4-氯-1-羥基-2-萘甲?；被?-L-苯丙氨酸作為OTA的替代模板[26]等。此外，以摻雜 Al3+的硅溶膠為功能單體，赭曲霉毒素為模板分子時(shí)，Al3+的原子軌道與赭曲霉毒素的羥基產(chǎn)生強(qiáng)配位并取代硅烷水解后的羥基氫，從而提高分子印跡聚合物膜的穩(wěn)定性和特異性識(shí)別能力[27]，這種配位印跡電化學(xué)傳感器對(duì)赭曲霉毒素有良好的選擇性和靈敏度。

SPE方法簡單、富集效率高且易于與液相色譜在線聯(lián)用，可減少樣品損耗并提高方法靈敏度[28-30]，Campone等[31]建立了牛奶和奶制品中AFM1的在線SPE-UPLC/MS分析方法。采用鹽析液液微萃取去除樣品中的蛋白質(zhì)并萃取分析物后，將萃取液固相萃取富集、凈化并在線分析，整個(gè)在線分析時(shí)間不足20 min，方法的定量下限可低至0.5～0.6 ng/kg，低于歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)25倍以上。

1.2 QuEChERS法

QuEChERS的原理與高效液相色譜(HPLC)和固相萃取(SPE)相似，利用吸附劑填料與基質(zhì)中雜質(zhì)相互作用而達(dá)到除雜凈化的目的。因其可分析對(duì)象的范圍廣、分析速度快、溶劑使用量少，近年來已逐漸成為霉菌毒素分析的常用前處理手段。Liu等[32]將芝麻醬樣品用乙腈水溶液提取、硫酸鎂和氯化鈉鹽析后，用正己烷和C18凈化，并結(jié)合UHPLC-MS/MS分析了黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等26種霉菌毒素，其檢出限低于歐盟允許的最大殘留量。采用QuEChERS/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)測定爆米花中的多種毒素(嘔吐毒素、雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、鐮刀菌酮-X、玉米赤霉烯酮)時(shí)[33]，其檢出限和定量下限分別小于65，196 μg/kg。此外，QuEChERS法也成功地用于葛根[34]、香菇[35]和雞蛋[36]等食品中數(shù)十種霉菌毒素的同時(shí)分離富集分析。

Frenich 等[37]采用 QuEChERS/UHPLC-MS/MS 法測定了蛋制品中的 10 種毒素(白僵菌素、環(huán)肽 A、環(huán)肽 A1、環(huán)肽 B1、桔霉素、AFB2、AFG1、AFB1、AFG2和 OTA),檢出限為 1.0～5.0 μg/kg。Zhou等[38]結(jié)合分散固相萃取法和QuEChERS法對(duì)樣品預(yù)處理后，用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀在負(fù)離子MRM模式下進(jìn)行測定，建立了面粉中10種霉菌毒素的UHPLC-MS/MS分析方法。Sun等[39]將谷類樣品用0.1%甲酸乙腈溶液提取后，采用QuEChERS法凈化，建立了谷物中25種霉菌毒素的UHPLC-MS/MS分析方法，檢出限為 0.03～15 μg/kg。QuEChERS法與LC-MS/MS進(jìn)行聯(lián)用后，不僅可實(shí)現(xiàn)多種類別物質(zhì)的分析，同時(shí)大大提高了分析通量，擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。Dzuman等[40]建立了389種多類別食品有機(jī)污染物(323種農(nóng)藥殘留，55種霉菌毒素和11種吡咯烷類生物堿)的QuEChERS/HPLC-HRMS/MS分析方法，該方法在小麥、韭菜和茶葉中得到成功應(yīng)用。

QuEChERS法作為一種廣譜性的殘留前處理技術(shù)，已被廣泛用于各類初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品、水產(chǎn)品、乳制品、深加工食品、生態(tài)環(huán)境和紡織品等基質(zhì)中農(nóng)藥、獸藥、毒素和其它污染物的分析。食品中霉菌毒素廣泛且種類繁多，QuEChERS在食品檢測領(lǐng)域中是較為常用的前處理方法，可對(duì)不同類別的物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)分析檢測，節(jié)約了大量的溶劑和分析時(shí)間，Pizzutti等[41]采用QuEChERS法提取和凈化，建立了葡萄酒中36種霉菌毒素的UHPLC-MS/MS分析方法。采用類似方法分析谷物中22種殺蟲劑和17種霉菌毒素時(shí)[42]，方法的檢出限可低至0.20～29.7 μg/kg。Romero-González等[43]分析了小麥、黃瓜和紅酒中約90種食品有機(jī)污染物(農(nóng)藥、生物農(nóng)藥和霉菌毒素)，霉菌毒素有黃曲霉毒素(AFB1，AFB2，AFG1，AFG2)，赭曲霉毒素A，T2毒素，HT-2毒素，發(fā)現(xiàn)QuEChERS結(jié)合HPLC-MS可成功應(yīng)用于實(shí)際樣品中目標(biāo)物的測定。總體而言，QuEChERS法的應(yīng)用對(duì)象不受限制，液態(tài)、固態(tài)和粘稠態(tài)等狀態(tài)的物質(zhì)均能應(yīng)用，通過與LC-MS分析方法相結(jié)合，可分析的對(duì)象多，分析速度快，準(zhǔn)確度高，在食品領(lǐng)域中發(fā)揮著十分重要的作用。

1.3 液相微萃取

圖2 通過pH 值調(diào)節(jié)的分散液液微萃取的基本原理[46]Fig.2 Schematic illustration of pH-controlled dispersive liquid-liquid microextraction[46]

液相微萃取(Liquid-phase microextraction,LPME)法集萃取、濃縮于一體，因具有消耗溶劑少、富集效率高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)而得到快速發(fā)展和應(yīng)用。正庚醇、正辛醇、甲苯等中低極性溶劑是常用的萃取劑。如Rempelaki等[44]以甲苯為萃取劑，建立了啤酒中玉米赤霉烯酮的LPME-LC/MS分析方法，檢出限為0.44 μg/kg。分散液液微萃取(Dipersive liquid-liquid microextraction,DLLME)是近年來一種新的液相微萃取形式，它通過微量注射器將萃取劑注入樣液中，在分散劑-水相內(nèi)形成萃取劑微珠，擴(kuò)展了萃取劑與水樣的接觸面積，從而可加快萃取平衡，提高萃取效率和富集倍數(shù)。采用氯仿和乙腈分別作為萃取劑和分散劑時(shí)，啤酒中玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)的富集因子為43.3，萃取液經(jīng)HPLC分析后，其檢出限為0.12 pg/μL[45]。最近，Campone等[46]建立了一種基于pH值控制的DLLME方法，通過不同pH值下的2個(gè)連續(xù)DLLME過程來實(shí)現(xiàn)。谷物樣品先用甲醇萃取，萃取液中的疏水性雜質(zhì)在pH 8.0的條件下用氯仿去除(一級(jí)DLLME)，然后將上清液調(diào)至pH 2.0，OTA用二溴乙烷濃縮(二級(jí)DLLME)，然后采用HPLC分析，OTA的檢出限和定量下限分別為0.019，0.062 μg/kg，其基本原理如圖2所示。該方法不僅可改善分散液液微萃取的選擇性，還可拓展其在可電離化合物分離富集中的應(yīng)用。

離子液體是一種結(jié)構(gòu)可調(diào)、化學(xué)物理性能獨(dú)特的新型綠色溶劑，Bozkurt等[47]以1-丁基-3-甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺離子液體為分散液富集玉米赤霉烯酮，建立了啤酒和谷物食品中玉米赤霉烯酮的DLLME/HPLC分析方法，檢出限為0.25 μg/L。而以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體為渦旋輔助分散液液微萃取的萃取劑時(shí)[48]，玉米類食品中玉米赤霉烯酮的HPLC方法檢出限為0.3 μg/kg，這些應(yīng)用均表明離子液體在霉菌毒素分離富集中具有良好的應(yīng)用潛力。

1.4 免疫親和層析

免疫親和層析(Immunoaffinity chromatography，IAC)是利用生物體內(nèi)抗原、抗體之間高度特異性的親和力進(jìn)行分離，其選擇性好、富集效率高。目前，黃曲霉毒素(AFs)、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮(ZEN)、雜色曲霉素[49]等霉菌毒素的免疫親和柱均已商品化。Xie等[50]將活化的瓊脂糖珠與AFB1單克隆抗體蛋白偶聯(lián)制得AFB1免疫親和柱，建立了大豆、玉米、小麥等13種食品中AFB1的免疫親和柱/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(IAC /UPLC-MS)分析方法，檢出限低至0.01～0.05 μg/kg。而將冰激凌樣品的磷酸鹽(PBS)提取液經(jīng)免疫親和柱凈化后采用UPLC-MS/MS分析，AFM1的檢出限低至0.4～3.0 ng/kg[51]。為進(jìn)一步將高效的IAC富集和快速的光分析法結(jié)合，Duan等[52]通過微乳化技術(shù)封裝CdSe/ZnS制備出量子點(diǎn)微珠，并將量子點(diǎn)置于免疫層析裝置中測定玉米赤霉烯酮(ZEN)，方法的檢出限為3.6 μg/kg，其交叉反應(yīng)表明其他霉菌毒素對(duì)ZEN無干擾，可用于實(shí)際樣品中ZEN的快速篩查。

部分商品化的免疫親和柱也可用于多種霉菌毒素的同時(shí)富集，如蜂花粉中的黃曲霉毒素(AFB1,AFB2,AFG1,AFG2)和赭曲霉毒素(OTA)[53]；豬肉、魚肉、豬肝等動(dòng)物源食品中的6種黃曲霉毒素(AFB1,AFB2,AFG1,AFG2,AFM1和AFM2)和6種玉米赤霉醇類真菌毒素[54]以及小麥、玉米及其制品中的黃曲霉毒素(AFB1,AFB2,AFG1,AFG2)、赭曲霉毒素、伏馬菌素(B1,B2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、嘔吐毒素、雪腐鐮刀菌烯醇、T-2以及HT-2等[55]。結(jié)合HPLC-MS/MS方法，毒素的檢出限一般可低至0.05 μg/kg數(shù)量級(jí)，遠(yuǎn)低于歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)。為了進(jìn)一步提高免疫親和柱的同時(shí)分析能力，研制新型多毒素免疫親和柱得到了較多關(guān)注。Zhang等[56]先制備AFs，OTA，ZEN和T-2毒素的單克隆抗體，將4種抗體與瓊脂糖-4B結(jié)合制備得到多抗體的免疫親和柱(mIAC)，結(jié)合HPLC-MS/MS分析了農(nóng)產(chǎn)品中的7種霉菌毒素，方法的檢出限為0.04～0.4 μg/kg。Hu等[57]采用自制的多毒素免疫親和柱同時(shí)富集黃曲霉毒素(AFB1,AFB2,AFG1,AFG2)，ZEN，OTA，雜色曲霉素和T-2毒素，使用HPLC方法分析的檢出限為0.006～0.12 ng/mL，該方法已成功用于80多種飼料中霉菌毒素的分析，具有快速、靈敏度高且耐用等優(yōu)點(diǎn)，符合中國和歐盟國家的分析標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 磁分離(Magnetic separation)

磁分離技術(shù)是將物質(zhì)進(jìn)行磁場處理的一種技術(shù)，材料與目標(biāo)物在外加磁場的作用下發(fā)生相互作用而實(shí)現(xiàn)強(qiáng)化分離。Turan等[58]制備了分子印跡磁性微球，建立了葡萄汁中赭曲霉毒素的印跡微球萃取/紫外光譜分析方法。材料的飽和吸附量為34.5 mg/g，印跡因子為3.9，方法檢出限為0.374 μg/mL。Xu等[59]通過磁性靜電紡絲控制磁性，建立了一種黃曲霉毒素B1的高靈敏免標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光分析方法。它通過靜電紡絲良好的導(dǎo)電性能和生物相容性、較大的比表面積，以及可放大魯米諾電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的特性，將黃曲霉毒素B1(AFB1)與特異性抗體相結(jié)合，經(jīng)過電化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大后,AFB1的檢出限為0.02 ng/mL。該方法已成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測，且穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。Taherimaslak等[60]以乙二醇雙巰基乙酸酯修飾的磁性Fe3O4納米微球富集AFM1，采用β-環(huán)糊精作為熒光增敏試劑，建立了牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的分析方法。高表面積和磁性特性使該方法比傳統(tǒng)的固相萃取法更快速，其富集因子更高(約57)，檢出限更低。Mashhadizadeh等[61]采用同樣的材料富集谷物中的赭曲霉毒素，建立了谷類食物中赭曲霉毒素的SPE/HPLC分析方法，該方法對(duì)大米、小麥和玉米樣品中赭曲霉毒素的檢出限分別為0.06，0.03，0.05 ng/mL。

另一方面，采用高分散磁性四氧化三鐵微球吸附抗體后，大大降低了ELISA方法中AFB1的檢出限[62]，可檢出實(shí)際樣品提取液中低至2 pg/mL的AFB1。Urusov等[63]通過磁性四氧化三鐵微球固定抗體后，大大減少了樣品基體的影響，加快了樣品處理速度并降低了ELISA方法的檢出限，提高了方法靈敏度。大麥和玉米萃取液中黃曲霉毒素B1的檢出限低至20 pg/mL，而總分析時(shí)間僅需20 min，大大優(yōu)于常規(guī)的ELISA方法。經(jīng)抗體修飾的磁珠可用作免疫磁珠探針，如Wang等[64]將黃曲霉毒素B1抗體用金納米粒子標(biāo)識(shí)后，用黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶聯(lián)物修飾磁珠并以其作為探針，將探針與金納米粒子標(biāo)記的抗體相結(jié)合，磁分離后未結(jié)合的溶液則直接通過紫外光譜分析。該方法的檢出限為12 ng/L，赭曲霉毒素、T2毒素等不干擾黃曲霉毒素B1的檢測。霉菌毒素經(jīng)免疫磁珠分離后，通過色譜等方法進(jìn)行分析，可進(jìn)一步提高分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。邢言言等[65]通過將N-羥基丁二酰亞胺偶聯(lián)磁珠與抗黃曲霉毒素抗體偶聯(lián)得到免疫磁珠，建立了陳皮中 4 種黃曲霉毒素的免疫磁珠分離/超高效液相色譜(UHPLC)分析方法，檢出限為0.013～0.038 μg/kg。

經(jīng)抗體修飾的免疫磁珠可與IAC結(jié)合使用，用于霉菌毒素的快速檢測。黃艷梅等[66]以噴涂了檢測抗原黃曲霉毒素M1-BSA 和驢抗鼠二抗形成檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維膜制備免疫層析試紙條，采用乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽-N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)法制備偶聯(lián)了AFM1單克隆抗體的免疫磁珠。將免疫磁珠與待檢樣本混合，經(jīng)捕獲、磁分離后，濃縮重懸液直接采用免疫層析試紙條檢測，建立了集濃縮樣本與免疫層析于一體的AFM1快速檢測法。方法用于原料乳中AFM1的檢測，檢出限為0.1 μg/L，低于我國制定的AFM1限量標(biāo)準(zhǔn)(0.5 μg/L)，與其它真菌毒素和原料乳中常檢的違法添加物無交叉反應(yīng)，分析結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)結(jié)果吻合，有很好的應(yīng)用前景。

1.6 超聲波輔助萃取法(UAE)

在食品等復(fù)雜樣品中痕量霉菌毒素的分離分析中，霉菌毒素的分離主要分為2個(gè)過程：毒素從樣品中轉(zhuǎn)移到萃取溶劑，以及毒素從溶劑中被分離富集。其中第一個(gè)過程相對(duì)較慢，決定了萃取速度；第二個(gè)過程相對(duì)較快，決定富集效率。近年來，采用熱、聲、電、磁、力及微波場等外場輔助萃取技術(shù)通過外場強(qiáng)化樣品處理過程中的傳熱和傳質(zhì)過程，加快了樣品處理速度，提高了樣品處理效率。其中，UAE可通過超聲波的空化作用增加溶劑進(jìn)入樣品的滲透性，加強(qiáng)其傳質(zhì)過程，提高樣品中目標(biāo)組分的萃取率，近年來在食品、環(huán)境、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，在霉菌毒素的分離分析中應(yīng)用越來越多。如采用UAE方法可增加谷物產(chǎn)品中赭曲霉毒素的提取效率[67]。在實(shí)際應(yīng)用中，一般將UAE與其他富集方法(如分散固相萃取、分散液液微萃取、QuEChERS等方法)結(jié)合使用，在提高樣品處理速度的同時(shí)提高霉菌毒素的富集效果，結(jié)合高靈敏分析方法實(shí)現(xiàn)霉菌毒素的高效高靈敏分析。如采用超聲輔助-分散固相萃取結(jié)合HPLC分析奶粉中的AFM1[68]、超聲波輔助-分散液液微萃取/HPLC分析水果中OTA和橘霉素[69]、超聲波輔助-微QuEChERS萃取/UPLC分析谷類食物中的玉米赤霉烯酮(ZEN)[70]等，均能大幅減少溶劑消耗和樣品損失，并使霉菌毒素的檢出限低至μg/kg以下水平。Kong等[71]將肉豆蔻樣品用UAE萃取后，采用商品化的免疫親和柱凈化富集，用HPLC-光電衍生-FLD分析，建立了一種超聲輔助-固液萃取/免疫親和柱/柱后光電衍生-高效液相色譜法分析多種毒素(AFB1,AFB2,AFG1,AFG2，OTA)的方法，檢出限和定量下限分別為0.02～0.25 μg/kg和0.06～0.8 μg/kg，并成功用于13種市售肉豆蔻中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的高靈敏分析檢測。

2 霉菌毒素分析方法研究進(jìn)展

霉菌毒素經(jīng)過不同前處理方法處理后，一般采用液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、免疫分析法、熒光分析法等方法進(jìn)行分析。以O(shè)TA分析為例，表2列出了不同樣品中OTA的分析方法及其結(jié)果對(duì)比情況。

表2 不同樣品中OTA的分析方法及其結(jié)果對(duì)比

從表2可以看出，霉菌毒素存在于各類食品中，QuEChERS法可對(duì)各類樣品進(jìn)行前處理，能滿足高通量的分析需求，結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)甚至對(duì)不同類別的物質(zhì)也能同時(shí)分析，是霉菌毒素分析的主要前處理方法；LC-MS/MS分析方法與前處理技術(shù)的聯(lián)用則能達(dá)到更高的靈敏度，同時(shí)液相色譜應(yīng)用面廣，成為霉菌毒素分析的主要方法。

2.1 液相色譜及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

高效液相色譜(HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)方法簡單、快速、靈敏和高通量，是目前霉菌毒素分析通行的標(biāo)準(zhǔn)方法。采用LC-MS分析飼料中多種霉菌毒素及其代謝物[72]，其檢出限為0.11～0.60 μg/L。結(jié)合SPE和QuEChERS等高效樣品前處理技術(shù)可進(jìn)一步提高分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確度，如采用微固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)對(duì)飲料和罐裝咖啡等食物中的黃曲霉毒素進(jìn)行分析[73]。在LC-MS中采用多反應(yīng)監(jiān)測模式下的正離子和負(fù)離子同時(shí)檢測，可實(shí)現(xiàn)數(shù)十種霉菌毒素的同時(shí)分析檢測。如Liu等[74]以ZEN作為內(nèi)標(biāo)物，建立了檳榔中11種霉菌毒素的UHPLC-ESI-MS/MS分析方法，定量下限低于50 μg/kg，檢出限為0.1～20 μg/kg。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)

由于霉菌毒素的揮發(fā)性較低、熱穩(wěn)定性高，因此與HPLC-MS法相比，GC-MS法在霉菌毒素的實(shí)際檢測中存在一定的局限性，目前主要用于鐮刀霉菌毒素及棒曲霉素等的分析檢測。如Yelko等[75]建立了谷物中單端孢霉烯族毒素、棒曲霉素和ZEN毒素的QuEChERS/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，定量限低于10 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于9%。Pereira等[76]采用類似方法同時(shí)檢測了嬰兒食品中12種棒曲霉素，方法的檢出限和定量下限分別為0.37～19.19 μg/kg和1.24～63.33 μg/kg，該方法已成功用于9種市售嬰兒食品中棒曲霉素的檢測。通過樣品衍生化方法可拓展GC-MS方法在霉菌毒素分析中的應(yīng)用，如Qian等[77]將食用植物油中的玉米赤霉烯酮及其5種衍生物毒素用含0.1%三甲基氯硅烷的N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺硅烷衍生化后采用GC-MS分析，方法的定量下限為0.03～0.2 μg/kg，回收率為80.3%～96.5%，可滿足分析要求。

2.3 免疫分析法

免疫分析法也是食品中霉菌毒素較常使用的分析方法。其中，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)因特異性強(qiáng)、靈敏度高、使用簡單而應(yīng)用較多。目前，商品化的ELISA檢測試劑盒已推向市場，主要包括黃曲霉毒素、OTA、ZEN等。但ELISA一般只能檢測一種物質(zhì)且受基體影響，易導(dǎo)致“假陽性”，常用于實(shí)際樣品中霉菌毒素的快速初篩。曹冬梅等[78]基于G8-AP建立了檢測AFB1的一步 ELISA 法，檢出限為2.6 ng/mL。王呂等[79]以驢抗鼠二抗包被微孔板，以捕獲方式包被抗OTA單克隆抗體，利用噬菌體隨機(jī)七肽庫篩選 OTA 模擬抗原表位，并以其替代檢測抗原，建立了基于噬菌體展示技術(shù)的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測OTA的方法，OTA 的檢出限為0.03 ng/mL。以合成OTA-牛血清白蛋白偶聯(lián)物作為抗原免疫 Balb/c小鼠產(chǎn)生高親和性抗OTA單克隆抗體，建立了靈敏的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法，該方法對(duì)OTA的檢出限為1.4 μg/kg[80]。用黃綠青霉素-牛血清蛋白(CIT-BSA)免疫 Balb/c小鼠得到CIT單克隆抗體，建立了靈敏的CIT間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定方法[81]；采用類似方法可建立AFB1的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法[82]。此外，Li等[83]制備了一種高度特異性、高靈敏度的抗T-2毒素單克隆抗體，該抗體僅與T-2毒素結(jié)合，能排除大多數(shù)毒素的干擾(包括HT-2毒素)，其檢測結(jié)果與UHPLC-MS/MS方法吻合。

在多種霉菌毒素同時(shí)檢測方面，Du等[84]建立一種分析多類霉菌毒素的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫法(dot-ELISA)，該方法能對(duì)多類霉菌毒素進(jìn)行半定量分析。Venkataramana等[85]制備了一種高度特異性的OTA單克隆抗體，并建立了一種夾心斑點(diǎn)ELISA(s-dot ELISA)法，該方法對(duì)OTA的檢出限為5.0 ng/mL。ELISA能與金、硅等納米粒子產(chǎn)生共振現(xiàn)象，形成電漿ELISA。與傳統(tǒng)的ELISA方法相比，將納米復(fù)合材料-SiO2@PAA @CAT@OTA1∶1作為競爭性抗原，可提高電漿ELISA 法的靈敏度[86]，該方法對(duì)OTA的檢出限為5 × 10-20g/mL，如圖3所示。

圖3 基于過氧化氫酶催化長大的金納米粒子的定量免疫測定法示意圖[86]Fig.3 Schematic diagram of the proposed quantitative immunoassay based on CAT-catalyzed growth of AuNPs [86]

膠體金免疫層析技術(shù)是在酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、單克隆抗體技術(shù)、膠體金技術(shù)、乳膠凝集試驗(yàn)、免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種快速、靈敏的免疫檢測方法[87]。鄭百芹等[88]采用檸檬酸三鈉還原法制備直徑 40 nm 的膠體金溶液，然后利用膠體金標(biāo)記抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)單克隆抗體制備膠體金免疫復(fù)合物，建立了DON的免疫膠體金快速檢測方法。該方法在15 min內(nèi)即可完成檢測，特異性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性均較好，有望成為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇樣本的快速篩選手段。Kolosova等[89]建立了同時(shí)快速檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮毒素的側(cè)流免疫膠體金方法。10 min內(nèi)即可快速可視化定性，可用于食品中霉菌毒素的現(xiàn)場篩選。采用包裹AFB1抗體蛋白的金膠體作為識(shí)別探針，將植物油的油相與水混合，之后在免疫試條上對(duì)AFB1進(jìn)行可視化檢測，其檢出限為1.5 mg/kg，分析時(shí)間僅需5 min，該方法可實(shí)際應(yīng)用于家用植物油中AFB1毒素的檢測[90]。

2.4 生物傳感器

生物材料的進(jìn)一步發(fā)展主要體現(xiàn)在生物傳感器[91]、膠體金、適配體芯片等技術(shù)的應(yīng)用[92-93]。杜祎等[94]將AFs氧化酶固定化后與過氧化氫電極構(gòu)成電流型酶電極，構(gòu)建了用于測定AFB1的生物傳感器，并成功用于花生樣品的測定，其測定結(jié)果與薄層色譜法、ELISA法有較好的一致性。基于固定乙酰膽堿酯酶構(gòu)建的電導(dǎo)型生物傳感器可用于不同霉菌毒素的分析測定[95]，但更適合AFB1或總毒素含量的測定。而基于巰基乙胺自組裝膜構(gòu)建的電化學(xué)傳感器[96]對(duì)串珠鐮刀菌毒素的檢出限為8.3× 10-10mol/L，且其結(jié)果與HPLC無顯著性差異。此外，Kong等[97]以研制的多免疫層析(IAC)試紙條對(duì)20種霉菌毒素進(jìn)行半定量和定量檢測，其半定量檢測結(jié)果只需20 min即可通過肉眼觀察到，可用于現(xiàn)場檢測和谷物樣品中霉菌毒素的快速篩選。Pacheco等[98]在玻碳電極上先后修飾多壁碳納米管和分子印跡涂層，構(gòu)建了一種OTA的電化學(xué)傳感器，其對(duì)OTA的檢出限為1.7 μg/L，定量下限為5.7 μg/L，已成功用于啤酒和白酒等實(shí)際樣品中OTA的分析檢測。將羧酸化的多壁碳納米管沉積到ITO表面，然后修飾AFB1單克隆抗體用于構(gòu)建電化學(xué)傳感器[99]，可高靈敏、選擇性地分析AFB1，其檢出限低至0.08 ng/mL。周琳婷等[100]依次電沉積氧化石墨烯、2,5-二(2-噻吩)-1-對(duì)苯甲酸吡咯和氯金酸于金電極表面，以EDC/NHS為活化劑，將AFB1抗體共價(jià)連接在導(dǎo)電高分子膜上，最后滴涂1,3-二丁基咪唑六氟磷酸鹽離子液體于該修飾電極表面，制得AFB1免疫傳感器，該傳感器對(duì)AFB1的檢出限為1.1× 10-15mol/L，可用于花生等樣品中痕量AFB1的測定。

石墨烯的比表面積大且富含π電子，具有良好的熱穩(wěn)定性及化學(xué)穩(wěn)定性[101]，已作為性能優(yōu)良的吸附材料廣泛應(yīng)用于樣品前處理研究[102]。石墨烯經(jīng)過適當(dāng)處理可得到表面有羧基、羥基等活性基團(tuán)的氧化石墨烯，進(jìn)一步修飾得到的功能化石墨烯可用于食品、藥物、環(huán)境污染物、生物分子中痕量分析物的分離富集[103-104]。當(dāng)使用氧化石墨烯納米片作為赭曲霉毒素適體(OTA-apt)的電化學(xué)探針時(shí)[105]，由于OTA-apt通過π-π 共軛作用力與氧化石墨烯選擇性結(jié)合，使得該探針具有較高的選擇性和抗干擾性。結(jié)合石墨烯材料良好的吸附能力和免疫分析的高靈敏檢測，構(gòu)建了霉菌毒素高靈敏免疫傳感器。如在導(dǎo)電高分子膜的內(nèi)外分別引入導(dǎo)電性好和比表面積大的石墨烯和納米金，可提高修飾層的電子轉(zhuǎn)移速率，制得的免疫傳感器對(duì)AFB1的檢出限低至 1.1×10-15mol/L[100]。將氧化石墨烯還原并與聚吡咯和吡咯丙酸復(fù)合，通過石墨烯增強(qiáng)穩(wěn)定性和導(dǎo)電性，以吡咯丙酸充當(dāng)共價(jià)連接體，制成免疫傳感器[106]，該傳感器對(duì)AFB1也具有高度選擇性和高靈敏度。此外，將磁性的Fe3O4-氧化石墨烯復(fù)合物作為吸附材料，抗體標(biāo)記的CdTe量子點(diǎn)作為探針檢測AFM1[107]，檢出限為0.3 pg/mL；與商品化的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒方法相比，該方法具有更高的靈敏度，更快的分析速度。

采用一步電沉積法將金納米粒子和殼聚糖沉積到金基微電極上，并進(jìn)一步固載AFB1抗體構(gòu)建無標(biāo)記免疫傳感器[108]，將其用于玉米中AFB1的分析檢測，檢出限為0.19 ng/mL。采用端粒酶和EXO Ⅲ兩級(jí)放大策略構(gòu)建電化學(xué)適體傳感器[109]，其對(duì)AFB1的檢出限可低至0.6×10-16mol/L。

與抗體相比，適配體的特異性更強(qiáng)，對(duì)目標(biāo)靶分子具有更強(qiáng)的親和力，而且它們可根據(jù)需要在體外大量快速地制備合成，因此被廣泛用于霉菌毒素等化學(xué)物質(zhì)的分析檢測[110-111]。Guo等[112]采用單壁碳納米管作為熒光猝滅劑，構(gòu)建了羧基熒光素(FAM)-適配體傳感器，與傳統(tǒng)的傳感器相比，該方法對(duì)OTA的檢出限為24.1 nmol/L。張勇等[113]開發(fā)了一種便攜式適配體生物傳感器，結(jié)合血糖儀用于嬰幼兒米粉和羊草中OTA的定量檢測，檢出限為 6.7×10-9mol/L，回收率為84%～122%。文獻(xiàn)[114]基于氧化石墨烯(GO)阻止核酸酶切割破壞適配體，并調(diào)節(jié)GO尺寸得到AFB1的不同線性響應(yīng)范圍，從而構(gòu)建了一種基于納米氧化石墨烯(GO)和適配體修飾的AFB1的熒光傳感器，其檢出限可低至0.35 ng/mL。Dai等[115]將OTA適配體結(jié)合的近紅外上轉(zhuǎn)換納米顆粒(apt-UCNPs)和寡核酸苷修飾的磁性納米粒子混合得到復(fù)合材料，構(gòu)建近紅外適配體傳感器并用于啤酒樣品中OTA的檢測，其檢出限為0.005 ng/mL。

2.5 熒光分析法(XRF)

量子點(diǎn)是一種新型的半導(dǎo)體熒光探針，具有獨(dú)特的量子效應(yīng)、高的量子產(chǎn)率和光化學(xué)穩(wěn)定性，其激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布，已被廣泛用于生命化學(xué)、環(huán)境分析等領(lǐng)域[116]。采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)將OTA與量子點(diǎn)偶聯(lián)制備的熒光探針[117]，可高靈敏、快速檢測玉米中 OTA ，其單個(gè)樣品檢測時(shí)間為10 min。通過水包油反相微乳化作用將CdSe/CdS/ZnS核殼型量子點(diǎn)包裹于二氧化硅納米粒子中，然后進(jìn)行氨基、羧基和環(huán)氧基修飾并用聚乙二醇片段穩(wěn)定后，可得到穩(wěn)定的熒光標(biāo)記探針，該熒光標(biāo)記探針與抗體共軛結(jié)合后可對(duì)嘔吐毒素進(jìn)行快速、高靈敏度的現(xiàn)場測定[118]。量子點(diǎn)熒光探針在黃曲霉毒素分析中得到較多應(yīng)用，如Speranskaya等[119]將CuInS2/ZnS量子點(diǎn)封裝于聚乙二醇中得到水溶性量子點(diǎn)，然后與AFB1-蛋白衍生物結(jié)合作為熒光探針對(duì)AFB1進(jìn)行熒光測定。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法相比，該方法具有更高的靈敏度。采用CdTe量子點(diǎn)與AFB1單克隆抗體結(jié)合形成共軛配合物建立直接競爭熒光免疫吸附法，檢出限低至0.016 ng/mL[120]。此外，基于量子點(diǎn)與AFB1的結(jié)合，設(shè)計(jì)了基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的熒光探針，其結(jié)果與商品化AFB1的酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果無顯著性差異[121]。

圖4 基于LMOF-241材料分析黃曲霉毒素[123]Fig.4 Analysis of aflatoxin based on the LMOF-241 materials [123]

環(huán)糊精的“內(nèi)疏水外親水”空腔結(jié)構(gòu)使其能與許多有機(jī)物和無機(jī)離子相結(jié)合，它們與黃曲霉毒素結(jié)合產(chǎn)生不同的光學(xué)現(xiàn)象。將β-CD-Hg 作為熒光增強(qiáng)劑替代國標(biāo)方法的傳統(tǒng)衍生試劑，建立了高靈敏、快速測定AFB1的熒光分析法[122]，檢出限為0.08 μg/L，結(jié)果與國標(biāo)方法及速測方法均無顯著性差異。Hu等[123]設(shè)計(jì)合成的新型發(fā)光金屬有機(jī)骨架材料LMOF-241(圖4)可通過熒光猝滅法實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素和OTA的靈敏檢測。

2.6 其他分析方法

近年來，熒光免疫法、近紅外光譜法也在霉菌毒素檢測分析中得到應(yīng)用。將異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記 AFB1抗體制得 FITC-AFB1熒光標(biāo)記抗體[124]，建立了AFB1的直接競爭熒光免疫分析方法并用于中藥材中 AFB1的快速檢測，回收率為 90.4% ～106.6%。Hernandez-Hierro等[125]采用近紅外光譜儀分析了霉菌毒素，AFB1，OTA和總黃曲霉毒素的最小二乘法相關(guān)系數(shù)和預(yù)測修正的標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.955和0.2 μg/kg、0.853和2.3 μg/kg、0.938 和0.3 μg/kg。與色譜法相比，近紅外光譜法采用光纖探頭，成本更低、分析速度更快，且不需粉碎、浸提、層析等繁瑣的樣品前處理過程，建立的霉菌毒素檢測軟件與校正模型能夠快速準(zhǔn)確檢測霉菌毒素的含量，從而為實(shí)際樣品的快速篩選提供了依據(jù)。Arduini等[126]研制了一種同時(shí)采用比色法檢測AFB1和采用熒光法檢測OTA的便攜式光纖檢測儀，AFB1和OTA的檢出限分別為10，0.1 μg/L，可用于食品等樣品中AFB1和OTA的現(xiàn)場快速篩查。

3 展 望

霉菌毒素因存在范圍廣，對(duì)家禽、哺乳動(dòng)物和人類健康具有嚴(yán)重危害而受到了社會(huì)的廣泛關(guān)注，世界各國紛紛制定了食品、飼料中各類霉菌毒素嚴(yán)格的檢測和限量標(biāo)準(zhǔn)。雖然色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、各種免疫分析和生物傳感器方法快速靈敏，一些針對(duì)食品中黃曲霉毒素等快速檢測的儀器也紛紛問世。但是，受色譜法冗長的前處理過程、免疫分析法的低通量和“假陽性”等的限制，發(fā)展高選擇性、高效、高通量的前處理技術(shù)，新的高靈敏分析方法，以及簡捷靈敏的前處理-分析檢測聯(lián)用技術(shù)如樣品前處理-色譜/光譜聯(lián)用技術(shù)將具有廣泛的發(fā)展空間和應(yīng)用潛力。

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Progress on Pretreatment and Analytical Methods for Mycotoxins in Food Samples

TAN Jie,DU Yuan-qi,XIAO Xiao-hua*,LI Gong-ke*

(School of Chemistry,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China)

Mycotoxins are widely present in food and animal feed.They are harmful to animal and human health through the food chain,and will reduce the nutritional value of feed and cause serious food safety problem.It is very necessary to develop efficient sample pretreatments and sensitive analytical methods for rapid analysis of these targets in complex matrix.In this paper,some pretreatment methods including solid-phase microextraction,liquid-phase microextraction,magnetic separation,immuno affinity chromatography etc. are introduced.Meanwhile,the applications and developments of analytical methods for mycotoxins,such as liquid chromatography-mass spectrometry,enzyme-linked immune-sorbent assay and biosensors etc.,are also reviewed.

food samples;mycotoxins;sample pretreatment;analytical method;review

2017-01-22；

2017-02-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21375155,21475153，21675179，21675178)；國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2011YQ0301240901)；廣東省自然科學(xué)基金(2015A030311020)；廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)(2015A030401036)；廣州市民生科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(201604020165)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.022

O657.63；S852.44

A

1004-4957(2017)06-0829-12

*通訊作者：肖小華，博士，副教授，研究方向：色譜、食品分析，Tel：020-84111664，E-mail：xiaoxhua@mail.sysu.edu.cn 李攻科，博士，教授，研究方向：色譜與光譜分析、復(fù)雜體系分離分析， Tel：020-84110922，E-mail：cesgkl@mail.sysu.edu.cn