李小琴，袁 芳，曹根霞，王光麗

(江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122)

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基于碳量子點光活性模擬酶性能靈敏檢測焦磷酸根離子

李小琴，袁 芳，曹根霞，王光麗*

(江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122)

利用簡單的水熱法合成了具有良好水溶性、優(yōu)良光活性模擬酶性質的碳量子點(CDs)，該量子點在可見光照(λ≥400 nm)下可以催化氧化辣根過氧化物酶(HRP)的特征底物 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯(TMB)，生成與HRP催化氧化相同的產物。銅離子可與CDs發(fā)生配位作用，使CDs聚集光誘導模擬酶的活性降低；焦磷酸根(ppi)存在時，銅離子與ppi配位生成Cu2+-ppi復合物，從而使CDs分散模擬酶活性恢復。利用這一現(xiàn)象建立了一種比色檢測ppi的方法，在最佳條件下，檢測信號與ppi的濃度之間存在良好的線性關系，其線性范圍為1.0×10-6～5.0×10-3mol/L，檢出限為2.5×10-7mol/L。將該方法應用于健康人血漿中ppi的檢測，ppi的回收率為97.4%～104.8%，研究表明該比色傳感器可用于人血漿中ppi的檢測。

碳量子點；模擬酶；比色法；焦磷酸根離子

焦磷酸根(ppi)在許多生命活動過程如細胞新陳代謝、DNA聚合和一些酶促反應中扮演關鍵角色[1]。研究表明，ppi在關節(jié)炎的病理過程中起著很重要的作用，可以作為一個潛在的生物標記物用于關節(jié)炎疾病的臨床診斷和治療[2]。此外，ppi還用于食品添加劑中[3]。因此，建立快速、簡便、選擇性好的ppi測定方法具有十分重要的意義。目前，檢測ppi的方法有熒光光度法[4]、電化學方法[5]、比色法[6]等。其中電化學方法準確度高、選擇性好,但重現(xiàn)性較差；而熒光光度法需使用較復雜的儀器。與其他方法相比,比色分析法因簡單易行、重復性好而在化學分析中得到廣泛應用[6]。但當前的比色法存在靈敏度低以及干擾嚴重等現(xiàn)象。所以，發(fā)展簡便、靈敏地檢測ppi的方法仍具有重要意義。

天然酶具有底物特異性好、催化活性高等顯著優(yōu)點，但其提取成本較高，易變性失活，價格昂貴，這些因素極大地限制了其應用。因此，以納米材料為模擬酶的研究引起了越來越多的關注。與天然酶相比，基于納米結構的模擬酶成本低、催化活性高且耐受更苛刻的環(huán)境，具有很好的應用前景[7]。但是大部分基于納米材料的過氧化物模擬酶均需使用大量具有破壞性的過氧化氫(H2O2)，這使其在生物分析領域受到較大限制。本課題組研究發(fā)現(xiàn)通過光照可使納米材料表現(xiàn)模擬酶活性，從而為模擬酶的應用提供了一種新的方法[8-9]。

碳量子點(CDs)是一種新型的納米材料，具有較高的光穩(wěn)定性、低毒性、良好的生物相容性，在生物成像、傳感器及等方面具有潛在的應用前景[10-11]。本文采用簡單的水熱法合成了粒徑為2～3 nm的CDs，發(fā)現(xiàn)其在可見光(λ≥400 nm)下有較強的模擬酶活性，可以催化氧化典型底物 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯(TMB)顯色；銅離子與CDs發(fā)生配位作用[12]使其光催化模擬酶活性減弱；在ppi存在下，銅離子與ppi發(fā)生配位作用形成Cu2+-ppi復合物[13-14]使得CDs的模擬酶活性恢復?；诖耍⒘艘环Nppi的檢測方法。該方法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、檢測快速、成本低等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(美國瓦里安有限公司)，TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，JEOL JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，D8型X射線衍射儀(德國布魯克AXS有限公司)，F(xiàn)TLA 2000-104型紅外光譜儀(加拿大ABB Bomem有限公司)，CEL-S5001350氙燈光源(北京中教金源科技有限公司)，CHI 800C型電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)。

3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯(TMB)、碘化鉀、乙二胺四乙酸(EDTA)、 抗壞血酸(AA)、異丙醇(IPA)、叔丁醇(TBA)、乙醇、色氨酸(L-Try)、半胱氨酸(L-Cys)、醋酸鈉、醋酸、焦磷酸鈉(Na4P2O7·10H2O)、硫酸銅、二氯甲烷、溴化鈉、氟化鈉、硫酸鈉、亞硫酸鈉等均購于國藥化學試劑有限公司。人血漿(江南大學醫(yī)務室)。超氧化物歧化酶(SOD)、辣根過氧化物酶(HRP)購自Aladdin公司。氧化銦錫(ITO)導電玻璃購自深圳南玻顯示器件有限公司。所有試劑均為分析純。實驗所用緩沖液為0.2 mol/L的醋酸緩沖溶液，實驗用水為超純水。

1.2 碳點的制備

參照文獻[15]采用水熱法合成CDs,在100 mL燒杯中，加入25 mL水、1.1 g AA以及25 mL乙醇，在不斷攪拌下形成均勻溶液。取25 mL混合物加至反應釜中，在180 ℃下加熱4 h，自然冷卻至室溫，得深褐色溶液，用二氯甲烷(CH2Cl2)萃取后，透析袋透析2 d，得到黃色水溶性的CDs。

1.3 光誘導CDs模擬酶性質研究及其比色法檢測ppi離子

可見光誘導CDs 模擬酶活性的研究：在離心管中加入200 μL pH 3.0 的HAc-NaAc緩沖、50 μL CDs，然后加入100 μL 0.5 mmol/L TMB溶液，并加水稀釋至 1.0 mL，溶液混合均勻后置于氙燈(λ≥400 nm)下照射15 min，在紫外可見分光光度計上測定 652 nm處的吸光度。

可見光誘導CDs模擬酶動力學的研究：在離心管內加入 200 μL的HAc-NaAc緩沖(pH 3.0)、50 μL CDs和不同濃度的TMB(20～500 μmol/L)，加水稀釋至 1.0 mL。溶液混合均勻后置于氙燈(λ≥400 nm)下照射，于 652 nm 處每隔 1 min 測定反應體系的吸光度值。通過米氏方程計算反應動力學參數(shù)。

ppi的檢測：在離心管中加入200 μL的HAc-NaAc(pH 3.0)緩沖溶液，50 μL CDs，1.0×10-5mol/L的銅離子,反應10 min后加入不同濃度的ppi以及100 μL 0.5 mmol/L 的TMB，并加水稀釋至1.0 mL，在40 ℃下氙燈(λ≥400 nm)照射15 min后，于紫外可見分光光度計上測定 652 nm 處的吸光度。

2 結果與討論

2.1 CDs的表征

圖2 不同溶液的紫外可見吸收圖Fig.2 UV-Vis spectra of different solutionsa.CDs+TMB+visible light,b.TMB+visible light,c.CDs+TMB;inset image is the corresponding color of the above solutions

2.2 光誘導CDs的模擬酶活性

為了探究 CDs的模擬酶活性，選擇TMB 為顯色底物，這種底物通常作為研究模擬酶活性的特征底物。為了避免紫外光直接光氧化TMB，選擇可見光研究CDs的催化活性。如圖2曲線b所示，單獨可見光(λ≥400 nm)的光照不會引起TMB 的氧化，而在無光照的條件下，CDs也不會催化氧化TMB(如圖2曲線c)，但在光照條件下，CDs氧化TMB 的效果大大提升(圖2曲線a)。CDs加入TMB 溶液，用可見光光照 15 min后溶液變?yōu)樗{色，氧化的TMB在652 nm處和370 nm處有特征吸收峰出現(xiàn)。證明了CDs具有類似天然辣根過氧化物酶(HRP)的活性。HRP可以催化 H2O2氧化TMB的反應。光誘導CDs模擬酶不需要 H2O2，表明光誘導CDs比天然酶和其他納米材料模擬酶更加環(huán)保和更具生物兼容性。

圖3 pH值(A)和溫度(B)對CDs 光活性模擬酶的影響Fig.3 Relative catalytic activity of CDs under visible light irradiation with pH value(A) and temperature(B)

2.3 實驗條件的優(yōu)化

與天然酶HRP類似，光誘導 CDs的模擬酶催化活性受溶液 pH值和溫度的影響。因此，本實驗分別在溫度 10～90 ℃和 pH 2.0～12.0范圍內測量其相對催化活性。由圖3可看出，CDs在較寬的溫度和pH值范圍內均具有較高的催化活性，其中以在pH 3.0、溫度為 40 ℃時的催化活性效果最佳。此最優(yōu)條件和其它納米材料和天然酶催化的最優(yōu)條件類似[8]。而CDs模擬酶在低pH值和高溫度時的活性較好，也表明該CDs的模擬酶性質比較穩(wěn)定。

2.4 光誘導CDs模擬酶活性的動力學研究

為進一步了解CDs光催化模擬酶的活性，探究了CDs模擬酶的動力學參數(shù)。米氏動力學常數(shù)(Km)表示酶對于底物的親和能力，Km值越小，說明酶和底物的結合能力越強。Km可以通過 Lineweaver-Burk 曲線：1/υ=Km/υmax×1/[S]+1/υmax獲得，其中，υ，υmax，[S]和Km分別代表反應速率、最大反應速率、底物濃度和米氏常數(shù)。以TMB為底物，研究了CDs對其的親和能力。通過CDs在不同濃度TMB下的吸光度變化得到 Michaelis-Menten曲線。在最優(yōu)條件下，得到CDs對底物TMB的υmax=137.7 nmol/L·s-1,Km=76.1 μmol/L。與天然酶HRP相比，CDs的Km值比HRP(Km=434 μmol/L)[19]的低很多，表明光誘導CDs與TMB的親和力比HRP強。CDs 的υmax值較 HRP(10 nmol/L·s-1)的值更大，說明 CDs 的催化反應速度比天然酶更快，催化所需的時間更短、效率更高，CDs模擬酶在反應速度及親和性上比天然酶有更大的優(yōu)勢。

2.5 光誘導CDs模擬酶的產生機理

2.6 比色法檢測焦磷酸根(ppi)

實驗發(fā)現(xiàn)，銅離子可以抑制CDs光催化模擬酶的活性，加入ppi后模擬酶的活性恢復如圖5A所示。因為銅離子與CDs發(fā)生配位作用，使得CDs聚集模擬酶的活性降低，ppi存在時，銅離子與ppi發(fā)生配位作用生成Cu2+-ppi復合物，CDs分散模擬酶的活性恢復。在最優(yōu)條件下，對不同濃度的ppi進行了測定。由圖5B可知，隨著ppi濃度的增加，吸光度增強。吸光度A0為加入銅離子后CDs光照射下催化氧化TMB的吸光度，吸光度A為加入ppi后CDs光催化模擬酶活性恢復后催化氧化TMB后的吸光度。吸光度差值與ppi濃度在1.0×10-6～5.0×10-3mol/L范圍內存在良好的線性關系，其檢出限(S/N=3)為 2.5×10-7mol/L。本文建立的比色方法簡便快捷，無需復雜儀器，耗時短，碳材料無毒，且具有良好的生物相容性，所需要的催化條件比HRP和其他過氧化物模擬酶更加溫和(即不需要破壞性的過氧化氫)[25]。由于目前檢測ppi 的方法中，電化學法重現(xiàn)性較差[5]，熒光光度法需復雜的儀器[4]，指示劑置換比色法的檢出限高[26]，拉曼光譜法需復雜儀器且檢出限高[27]。因此，本方法具有較好的優(yōu)勢。

2.7 方法的選擇性

表1 人血漿樣品中ppi的分析結果

2.8 人血漿中焦磷酸根離子的測定

采用本方法測定健康人血漿中ppi含量。通過離心(10 000 r/min,20 min)血漿樣品除去血漿中可能存在的蛋白質對焦磷酸根測定的影響。測定結果如表1所示，健康人血漿中的ppi濃度為1.33～5.01 μmol/L，ppi的回收率為97.4%～104.8%，檢測結果與文獻報道的血漿中ppi含量結果(1.4～4.7 μmol/L)一致[28]，表明方法具有可行性，可用于檢測人血漿中的ppi。

3 結 論

本文采用一種簡單的水熱法合成了在可見光照下具有模擬酶催化活性的CDs，利用銅離子與ppi的配位作用比銅離子與CDs的作用強，使得CDs的光催化模擬酶活性先抑制后恢復，實現(xiàn)了ppi的快速、靈敏、選擇性檢測。該比色法具有檢出限低、線性范圍寬、操作簡便、成本低等優(yōu)點。

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Sensitive Detection of Pyrophosphate Using a Novel Colorimetric Sensor Based on Carbon Quantum Dots Photocatalytic Mimic Enzyme Activity

LI Xiao-qin,YUAN Fang,CAO Gen-xia,WANG Guang-li*

(College of Chemistry and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122，China)

The highly solubile and photocatalytic carbon quantum dots(CDs) were prepared by a one-pot hydrothermal method.The CDs could oxidize the typical substrate of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(TMB) of the horseradish peroxidase(HRP) under visible light(λ≥400 nm) irradiation causing the color signal.In this assay,the interaction between copper ion and CDs will suppress the oxidase mimicking activity of CDs.Upon introduction of target pyrophosphate ions(ppi) into the detection system,the Cu2+-ppi complexes were forming on the basis of the coordination reaction between copper ion and inorganic pyrophosphate ions,thus the oxidase mimicking activity of released CDs was recovered.Based on this characteristic,a colorimetric sensor for the ppi detection was designed.Under the optimal conditions,the obtained colorimetric signal showed a linear response to ppi within a dynamic range of 1.0×10-6-5.0×10-3mol/L with a detection limit(LOD) of 2.5×10-7mol/L.The method was applied in the determination of ppi in human plasma samples,with recoveries of 97.4%-104.8%.The results showed that the colorimetric sensor could be used to detect ppi in human plasma samples.

carbon quantum dots;enzyme mimetics;colorimetry;pyrophosphate ion

2016-12-04；

2017-02-23

國家自然科學基金項目(21275065，21575052)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.016

O657.3;P578.92

A

1004-4957(2017)06-0794-06

*通訊作者：王光麗，博士，副教授，研究方向：納米分析化學，Tel:0510-85917090,E-mail：glwang@jiangnan.edu.cn