武軍元++黃忠武++康強(qiáng)++姚禮文

摘要：為了從分子水平上掌握新疆油雞H9N2亞型禽流感病毒PA基因的遺傳進(jìn)化情況，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)新疆油雞分離株Xj14的PA基因進(jìn)行克隆、測(cè)序及分子進(jìn)化分析，將PA基因的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與 GenBank 中已經(jīng)公布的參考序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明，新疆油雞分離株的PA基因由2 151個(gè)堿基組成，編碼716個(gè)氨基酸，與AIV A/Duck/HongKong/Y439/97的PA基因處于同一分支，其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次為899%和96.9%，在系統(tǒng)進(jìn)化上屬于歐亞分支中的Y439譜系。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒；油雞；PA基因；克?。恍蛄蟹治?/p>

中圖分類號(hào)： S852.65+7文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0020-03

禽流感（avian influenza，AI）是由A型流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的病毒性傳染病。自Homme等1966年從威斯康辛州患有溫和呼吸道疾病的火雞中分離到第1株H9N2亞型禽流感病毒之后，該亞型病毒在世界范圍內(nèi)呈廣泛流行的趨勢(shì)[1-4]。我國(guó)1994年首次從廣東省的發(fā)病雞群中分離到H9N2亞型禽流感病毒[5-6]，1998年首先報(bào)道H9N2亞型AIV可以感染人[7]，1999年我國(guó)香港地區(qū)發(fā)生了人感染H9N2的病例[8]。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，1997年我國(guó)香港地區(qū)感染人的H5N1病毒的內(nèi)部蛋白基因片段來源于H9N2亞型AIV[9]；2013年發(fā)生于我國(guó)上海等地的重配病毒H7N9中6個(gè)內(nèi)部基因均來自H9N2亞型AIV[10]；劉金華等近期發(fā)表在PNAS上的研究結(jié)果揭示，單一基因型H9N2流感病毒在我國(guó)雞群中的優(yōu)勢(shì)流行為H7N9流感病毒的重排提供了充分條件[11]。A型流感病毒基因組由8個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成，它們編碼11個(gè)已知的病毒蛋白質(zhì)，RNA聚合酶是由流感病毒基因組3個(gè)最大的片段PB1、PB2和PA編碼的異源三聚體復(fù)合物。其中，PB1是病毒RNA聚合酶的催化亞基，負(fù)責(zé)病毒RNA的復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄、PB2以一種稱為“Snatch”的方式參與宿主mRNA帽狀結(jié)構(gòu)的切割而完成病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄[12]。近年來的研究結(jié)果表明，PA亞基不但參與病毒復(fù)制過程，而且參與病毒RNA轉(zhuǎn)錄、決定內(nèi)切核酸酶和蛋白酶的活性，以及參與病毒粒子組裝等多種生命活動(dòng)過程，基于篩選慢性肝炎和艾滋病藥物的啟示[13]，PA蛋白因可以抑制病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄、有效發(fā)揮抗病毒作用而成為新型抗流感藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。

由此可見，加強(qiáng)對(duì)不同物種H9N2亞型AIV的檢測(cè)，密切關(guān)注其重配情況，進(jìn)一步對(duì)其生物學(xué)特性以及分子流行病學(xué)進(jìn)行研究，對(duì)于預(yù)測(cè)和防控流感大流行的發(fā)生具有不可忽視的作用。本研究對(duì)從新疆油雞當(dāng)中分離到的1株H9N2亞型禽流感病毒進(jìn)行PA基因克隆測(cè)序，并進(jìn)行分子進(jìn)化分析，以了解新疆油雞H9N2亞型AIV PA基因遺傳進(jìn)化的情況。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒H9N2亞型禽流感病毒新疆油雞分離株A/Chicken/XinjiangBaicheng/1/2014（H9N2）（簡(jiǎn)稱Xj14）于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2主要試劑及儀器設(shè)備High Pure Viral RNA Kit（Cat. No. 11858882001）購(gòu)自Roche公司；PrimeScriptTM Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Kit（Cat. No.6210A）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；HiPure Gel Pure DNA Kits購(gòu)自Magen公司；pGEM-T Easy Vector購(gòu)自Promega公司；Trans 2K DNA Markers、TransTaq-T DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TIANprep Mini Plasmid Kit購(gòu)自天根生化科技有限公司。梯度PCR儀、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)、高速離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)參照已知的AIV序列設(shè)計(jì)了1條反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni 12，用于AIV各片段的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，序列為Uni 12：5′-AGCAAAAGCAGG-3′。

參考NCBI公布的H9N2亞型AIV的PA基因序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)基因特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列為Bm-PA-1：5′-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAC-3′；Bm-PA-2：5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT-3′。

1.2.2病毒RNA提取及PA基因RT-PCR擴(kuò)增取 200 μL 尿囊液，按照Roche公司的High Pure Viral RNA Kit（Cat. No. 11858882001）說明書提取病毒RNA，用流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni-12，按照PrimeScriptTM Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Kit（Cat. No.6210A）說明書反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。用所設(shè)計(jì)的PA基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用 50 μL 的反應(yīng)體系，組成如下：10×PCR緩沖液5 μL，10 mmol dNTPs 4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U）0.5 μL，上下游引物各 1 μL（10 μmol），cDNA模板1 μL，無RNA酶的水37.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 2.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.3PA基因克隆與序列測(cè)定參照HiPure Gel Pure DNA Kits說明書將RT-PCR產(chǎn)物純化回收，回收產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy Vector上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，選擇PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送北京擎科武漢測(cè)序部進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4PA基因生物學(xué)分析應(yīng)用序列分析軟件DNAStar對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接處理，將所得序列與GenBank中公布的H9N2亞型流感病毒典型代表株（表1）的PA基因序列進(jìn)行同源性比較，用MEGA6軟件的neighbour-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹，分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1PA基因的RT-PCR擴(kuò)增

利用設(shè)計(jì)的針對(duì)PA基因的特異性引物Bm-PA-1/Bm-

2.2PA基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分析

測(cè)序結(jié)果表明，本研究擴(kuò)增的PA基因開放閱讀框由 2 151 個(gè)堿基組成，編碼716個(gè)氨基酸，將擴(kuò)增的核酸序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GenBank登錄號(hào)KX575647。將本研究分離毒株與GenBank公布的其他毒株進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究分離毒株的核苷酸和氨基酸序列均與A/Duck/HongKong/Y439/97具有較高的同源性，其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次為89.9%和96.9%（表2）。

2.3PA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將本研究分離毒株與國(guó)內(nèi)流行毒株的PA基因進(jìn)行多序列比對(duì)并繪制PA基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2），分析結(jié)果表明，新疆油雞分離毒株Xj14的PA基因與2013年世界衛(wèi)生組織推薦的疫苗株A/HongKong/33982/2009親緣關(guān)系最近，與國(guó)內(nèi)參考毒株A/Duck/HongKong/Y439/97同處于一個(gè)分支。

3討論

禽流感病毒是目前危害世界及我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的烈性病毒之一。禽流感病毒的血清亞型眾多，遺傳變異程度極其頻繁，目前，H5和H7亞型禽流感病毒對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成的直接危害較

大，因此，該亞型是基層生產(chǎn)防控的重點(diǎn)。H9N2禽流感是中國(guó)大陸主要的流行亞型，感染雞群具有發(fā)病率高、免疫抑制和產(chǎn)蛋下降的特點(diǎn)，而且一旦感染很難清除，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)以及公共衛(wèi)生造成了極大的危害。近期，Pu等研究發(fā)現(xiàn)，單一基因型H9N2流感病毒在我國(guó)雞群中的優(yōu)勢(shì)流行為H7N9流感病毒的重排提供了充分條件[11]，由此可見，H9N2流感病毒可以通過基因重組或重配產(chǎn)生新的對(duì)哺乳動(dòng)物甚至人類高致病力的病毒株。

禽流感病毒依據(jù)HA和NA基因的分子進(jìn)化特征可以分為北美和歐亞兩大譜系，歐亞譜系又進(jìn)一步分為A/CK/BJ/94、G1/97和Y439/97 3個(gè)亞分支[14]，AIV的HA、NA、NP、M、PB1、PB2和PA進(jìn)化情況相似。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果顯示，新疆油雞分離株Xj14的HA和NA基因均屬于國(guó)內(nèi)穩(wěn)定存在的BJ/94亞分支，且從分子水平上證實(shí)Xj14為低致病力的毒株，只是HA在關(guān)鍵位點(diǎn)出現(xiàn)Q234L的突變，NA基因在3個(gè)紅細(xì)胞吸附區(qū)域發(fā)生多處突變，HA、NA基因的糖基化位點(diǎn)均有所增加，這種受體結(jié)合位點(diǎn)的改變和潛在糖基化位點(diǎn)的增加可能使之在進(jìn)化過程中獲得跨種傳播的能力[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，新疆油雞分離毒株Xj14的PA基因與2013年世界衛(wèi)生組織推薦的疫苗株A/HongKong/33982/2009親緣關(guān)系最近，與歐亞譜系國(guó)內(nèi)參考毒株A/Duck/HongKong/Y439/97處于一個(gè)分支。因此，新疆油雞分離株Xj14很有可能是歐亞譜系不同亞分支重排的新毒株，其中，疫苗株A/HongKong/33982/2009參與病毒的重排組成。

綜上所述，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)邊疆新疆地區(qū)H9N2亞型AIV監(jiān)控的力度，為流感大數(shù)據(jù)的建立提供理論依據(jù)。

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