樊帆，馬建崗，盧曉云，牛騰，吳志民

?

PhaP介導(dǎo)EGFR靶向多肽修飾的腫瘤靶向PHBHHx納米藥物遞送載體的構(gòu)建

樊帆，馬建崗，盧曉云，牛騰，吳志民

西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710049

樊帆, 馬建崗, 盧曉云, 等. PhaP介導(dǎo)EGFR靶向多肽修飾的腫瘤靶向PHBHHx納米藥物遞送載體的構(gòu)建. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(6): 1028–1036.Fan F, Ma JG, Lu XY, et al. Development of tumor targeting PHBHHx nanoparticles by PhaP mediated immobilization of EGFR-targeting peptide. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 1028–1036.

聚羥基脂肪酸 (PHA) 顆粒表面結(jié)合蛋白PhaP具有與疏水性高分子材料表面緊密結(jié)合的能力，本研究將EGFR靶向多肽 (ETP) 與PhaP進(jìn)行融合表達(dá)，構(gòu)建了ETP-PhaP融合蛋白表達(dá)的重組工程菌BL21(DE3)(pPI-ETP-P)。經(jīng)對(duì)工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及ETP-PhaP融合蛋白的純化后，通過(guò)PhaP蛋白介導(dǎo)能夠有效地將ETP-PhaP融合蛋白修飾于3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯 (PHBHHx) 納米微球表面，構(gòu)建成為具有EGFR靶向作用的藥物遞送載體。分別檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞系SiHa(EGFR高表達(dá)) 和CaSKi(EGFR低表達(dá)) 對(duì)ETP-PhaP修飾的PHBHHx納米藥物載體和未經(jīng)修飾的納米藥物載體的吞噬情況。結(jié)果顯示，純化的ETP-PhaP融合蛋白能夠很好地吸附于PHBHHx顆粒的表面，經(jīng)ETP-PhaP融合蛋白修飾的PHBHHx納米藥物載體對(duì)EGFR高表達(dá)的宮頸癌SiHa細(xì)胞的靶向效果強(qiáng)于EGFR低表達(dá)的CaSKi細(xì)胞系。這一結(jié)果表明了PhaP介導(dǎo)的PHBHHx納米微球表面EGFR靶向多肽修飾具有簡(jiǎn)便、高效的優(yōu)勢(shì)，為疏水性納米藥物載體表面功能多肽修飾提供了一種新策略。

PHA顆粒表面結(jié)合蛋白，3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯，表皮生長(zhǎng)因子受體，腫瘤靶向，藥物遞送載體

納米技術(shù)的快速發(fā)展及其在抗腫瘤藥物遞送領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)顯示出其在延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間、增加療效、降低毒副作用、緩控釋給藥等方面的優(yōu)勢(shì)[1-3]。通過(guò)在納米藥物載體表面修飾特定的腫瘤靶向分子，可以進(jìn)一步提高納米藥物在腫瘤局部的聚集，并可以通過(guò)配體受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋藥，減少腫瘤藥物耐藥性的產(chǎn)生等[4-5]。生物可降解高分子材料腫瘤靶向納米藥物開(kāi)發(fā)中常用的載體材料，因其良好的生物相容性、控釋能力以及生物可降解性而被廣泛用于納米藥物[6-8]，但其表面功能性靶向分子的修飾方法仍然較為局限。

聚羥基脂肪酸酯 (Polyhydroxyalkanoate，PHA) 是一類(lèi)由多種微生物胞內(nèi)合成的生物可降解聚酯材料[9]，基于其脂肪族生物聚酯的化學(xué)性質(zhì)，其在作為疏水性藥物的包封及緩釋載體方面具有很好的優(yōu)勢(shì)[10-13]。3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯 (PHBHHx) 是PHA家族中可加工性能較好的一種。PHBHHx具有良好的生物可降解性和生物相容性[14]。天然PHA顆粒表面結(jié)合的PHA顆粒表面結(jié)合蛋白 (PhaP) 是一種低分子量的兩親性蛋白[15]，除了可與PHA材料結(jié)合之外，還可以在菌體中結(jié)合在胞內(nèi)形成的三酰甘油包涵體上[16]，或通過(guò)疏水作用與疏水性高分子如聚乳酸或聚苯乙烯等材料表面很好地結(jié)合[17]。PhaP蛋白能夠與其他蛋白或多肽分子融合表達(dá)，從而通過(guò)PhaP介導(dǎo)將功能多肽或蛋白質(zhì)固定化呈遞于疏水材料表面[18-19]。有學(xué)者先后將麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP)、β-半乳糖苷酶 (LacZ)、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶 (CAT)[18]、小鼠白細(xì)胞介素-2 (IL-2)、髓磷脂寡樹(shù)突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白 (MOG)[19]等多種蛋白通過(guò)此方法與PhaP融合表達(dá)后合成了表面負(fù)載相關(guān)蛋白的PHA微球。Yao等還通過(guò)將人類(lèi)酸性糖蛋白 (hAGP) 及人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子 (hEGF) 與PhaP融合表達(dá)，構(gòu)建了hAGP-PhaP和hEGF-PhaP修飾的PHA納米顆粒，分別實(shí)現(xiàn)了其對(duì)肝癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的靶向聚集作用[20]。本課題組前期也通過(guò)將人類(lèi)免疫共刺激分子B7-2與PhaP蛋白融合表達(dá)后呈遞于PHBHHx納米顆粒表面，使功能化的納米微球具有活化淋巴細(xì)胞的生物活性作用[21]。本研究中，我們將表皮生長(zhǎng)因子受體靶向多肽 (ETP) 與PhaP蛋白融合表達(dá)，經(jīng)過(guò)重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)和ETP-PhaP融合蛋白的分離純化后，通過(guò)PhaP蛋白與PHBHHx納米微球表面的相互作用，構(gòu)建了具有EGFR靶向性的PHBHHx納米藥物遞送載體。采用ETP多肽而非天然的EGF對(duì)PHBHHx納米微球表面進(jìn)行修飾，在實(shí)現(xiàn)微球?qū)GFR的靶向作用的同時(shí)，能夠減少采用天然EGF靶向EGFR時(shí)可能造成的對(duì)受體功能的激活作用及由于受體激活引起的下游的細(xì)胞效應(yīng)。研究中通過(guò)體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了ETP-PhaP修飾的PHBHHx納米微球靶向腫瘤細(xì)胞表面EGFR的有效性，使得PhaP介導(dǎo)的納米微球表面多肽修飾技術(shù)為包括PHA在內(nèi)的多種疏水性高分子微球表面的功能化修飾提供了簡(jiǎn)便高效的策略。

1 材料與方法

1.1 ETP-PhaP融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

編碼ETP-PhaP融合蛋白的DNA序列片段由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成，在ETP-PhaP融合蛋白編碼序列3′端設(shè)計(jì)合成有一個(gè)組氨酸標(biāo)簽，且DNA片段5′和3′端分別合成有Ⅰ和HⅠ的酶切位點(diǎn)序列。合成的DNA片段經(jīng)雙酶切后亞克隆至表達(dá)載體pTwin2中，獲得的ETP-PhaP融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pPI-ETP-P轉(zhuǎn)化入.BL21(DE3)菌株中構(gòu)建得到用于該融合蛋白表達(dá)的重組.BL21(DE3)(pPI-ETP-P) 工程菌。采用添加100 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基進(jìn)行重組大腸桿菌BL21(DE3)(pPI-ETP-P) 菌株的培養(yǎng)，在200 r/min、37 ℃下培養(yǎng)至600達(dá)到0.6–0.7時(shí)，添加0.5 mmol/L的IPTG并在23 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)6 h進(jìn)行ETP-PhaP融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2 ETP-PhaP融合蛋白的分離純化

培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體，超聲裂解后于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清中的ETP-PhaP融合蛋白進(jìn)一步通過(guò)鎳親和柱(GE Healthcare, USA) 進(jìn)行純化，洗脫的純化蛋白進(jìn)行脫鹽處理后進(jìn)行12%的SDS-PAGE分離，并通過(guò)抗組氨酸標(biāo)簽抗體為一抗，HRP偶聯(lián)的小鼠IgG抗體為二抗進(jìn)行ETP-PhaP融合蛋白的免疫印跡鑒定。

1.3 載熒光素PHBHHx納米微球的制備

稱(chēng)取20 mg PHBHHx材料 (用于制備游離PHBHHx納米顆粒) 或20 mg PHBHHx材料和 2 mg羅丹明B (用于制備PHBHHx納米熒光顆粒)溶于1 mL氯仿中。將溶解有熒光素和材料的氯仿溶液用注射器緩慢加入5 mL的1% PVA (/) 溶液中并超聲分散10 min形成乳液。將乳化液轉(zhuǎn)移至磁力攪拌器上，充分?jǐn)嚢? h使PHBHHx納米顆粒固化，室溫下減壓蒸餾除去體系中殘留的氯仿。制備的納米顆粒懸液在12 000 r/min離心20 min，用雙蒸水清洗沉淀部分后將其重懸于5 mL的PBS緩沖液中，采用顆粒粒度分析儀 (馬爾文公司，英國(guó)) 測(cè)定PHBHHx納米顆粒粒徑及分布。通過(guò)氣相色譜法測(cè)定得到的PHBHHx納米微球的質(zhì)量，分別計(jì)算制備游離PHBHHx納米微球和載羅丹明B的PHBHHx納米微球的產(chǎn)率。

1.4 PHBHHx納米顆粒表面ETP-PhaP蛋白的修飾及表征

將200 μL濃度為250 μg/mL的ETP-PhaP融合蛋白與1 mL的PHBHHx納米顆粒懸液 (1 mg/mL) 混合后在4 ℃條件下孵育3 h。進(jìn)一步在4 ℃、14 000 r/min條件下離心30 min收集修飾后的PHBHHx納米顆粒。收集獲得的修飾后顆粒經(jīng)PBS緩沖液洗滌2次后，其表面結(jié)合的蛋白組分用200 mL的1×Laemmli SDS-PAGE緩沖液(Tris-HCl 63 mmol/L，甘油10%，SDS 2%，溴酚藍(lán)0.002 5%，pH 6.8) 變性洗脫，用10%的SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜進(jìn)行Western blotting鑒定 (一抗：組氨酸標(biāo)簽抗體，CW0286；二抗：抗小鼠IgG抗體，CW0102，Beijing CoWin Bioscience Co. Ltd.)。上清組分通過(guò)BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，并與顆粒表面洗脫的蛋白一起進(jìn)行SDS-PAGE及Western blotting檢測(cè)。

1.5 人宮頸癌SiHa和CaSki細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其EGFR表達(dá)水平鑒定

采用添加100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)人宮頸癌SiHa和CaSki細(xì)胞。Western blotting檢測(cè)兩種細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平。EGFR特異性抗體 (#d38b1，Cell Signaling Technology) 為一抗 (1∶1 000)，辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體 (北京中杉金橋生物公司) 為二抗 (1∶5 000)，DAP化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自Thermo Scientific (34079)。

1.6 ETP-PhaP修飾的PHBHHx納米顆粒的吞噬檢測(cè)

為檢測(cè)ETP-PhaP修飾的PHBHHx納米顆粒對(duì)EGFR高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的體外靶向效果， 0.5 mg/mL的ETP-PhaP修飾及未經(jīng)修飾的PHBHHx熒光納米顆粒分別與SiHa和CaSki細(xì)胞共同孵育1 h。孵育結(jié)束后，用PBS將細(xì)胞清洗3次，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，并用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)至少3個(gè)平行樣品，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；應(yīng)用軟件SPSS 13.0進(jìn)行檢驗(yàn)，<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 ETP-PhaP融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)宿主的驗(yàn)證

ETP-PhaP融合蛋白的編碼序列經(jīng)Ⅰ和HⅠ酶切后插入表達(dá)載體pTwin2質(zhì)粒中，獲得ETP-PhaP融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pPI-ETP-P (圖1A)，將其轉(zhuǎn)化入.BL21(DE3) 并再次進(jìn)行質(zhì)粒酶切驗(yàn)證(圖1B)，獲得重組ETP-PhaP融合蛋白表達(dá)宿主菌.BL21(DE3)(pPI-ETP-P)。

2.2 ETP-PhaP融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

重組.BL21 (DE3) (pPI-ETP-P)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)ETP-PhaP融合蛋白，培養(yǎng)結(jié)束后裂解菌體，以鎳親和柱純化ETP-PhaP融合蛋白，純化過(guò)程各組分的SDS-PAGE圖如圖2A所示，圖中在重組菌全菌裂解液 (泳道2) 及純化出的目標(biāo)蛋白樣品 (泳道4) 中在ETP-PhaP融合蛋白15.5 kDa理論分子量大小的位置上均有一條明顯的蛋白條帶。Western blotting結(jié)果顯示 (圖2B)，這兩條蛋白條帶均可被抗組氨酸標(biāo)簽抗體特異識(shí)別，判斷為誘導(dǎo)表達(dá)出的ETP-PhaP融合蛋白。

圖1 pPI-ETP-P質(zhì)粒 (A) 及其酶切驗(yàn)證圖 (B)

2.3 PHBHHx熒光納米微球的制備及表征

采用乳化/溶劑揮發(fā)方法制備得到了空白及包裹熒光素羅丹明B的PHBHHx納米顆粒?？瞻譖HBHHx納米顆粒的平均粒徑 ((155.7±17.2) nm) 略小于載熒光素的PHBHHx納米顆粒 ((187.6±11.1) nm)，但兩者的粒徑分布都較為均一，多分散系數(shù) (PDI) 分別為0.153與0.037。兩種顆粒表面Zeta電位均為–30 mV左右，其中空白PHBHHx納米顆粒為(–29.2±1.5) mV，載熒光素的PHBHHx納米顆粒為(–30.1±1.3) mV。包裹熒光素羅丹明B的PHBHHx納米顆粒的產(chǎn)率 (45.9%±3.1%) 略低于空白PHBHHx納米顆粒的產(chǎn)率 (61.7%±2.3%)。

2.4 ETP-PhaP融合蛋白在PHBHHx納米微球表面的修飾

將500 μL濃度為1 mg/mL的ETP-PhaP融合蛋白 (500 μg) 與2 mL的PHBHHx納米顆粒懸液(0.5 mg/mL) 在4 ℃條件下混合孵育3 h后，離心分別收集顆粒及上清，顆粒經(jīng)緩沖液洗滌后，其表面結(jié)合蛋白經(jīng)100 μL的1×Laemmli SDS-PAGE緩沖液洗脫。BCA法對(duì)孵育結(jié)束后上清中的蛋白定量檢測(cè)結(jié)果顯示，上清中殘留蛋白濃度為 (138.8±4.6) μg/mL，計(jì)算可知PHBHHx納米顆粒表面對(duì)ETP-PhaP融合蛋白的吸附量約為 (153±11.5) μg/mg。分別將上清和顆粒表面洗脫的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。上清及顆粒表面ETP-PhaP融合蛋白比值的計(jì)算值與Western blotting結(jié)果灰度比值分析相符。

2.5 ETP-PhaP蛋白修飾的PHBHHx熒光納米微球體對(duì)宮頸癌細(xì)胞的體外靶向能力

研究中首先驗(yàn)證了人宮頸癌SiHa細(xì)胞和CaSki細(xì)胞 (圖4A) 的EGFR表達(dá)水平，其Western blotting檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4B。

在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開(kāi)展了ETP-PhaP融合蛋白修飾的PHBHHx熒光納米顆粒體外靶向EGFR的效果研究。體外培養(yǎng)的細(xì)胞分別用熒光強(qiáng)度相等的羅丹明B溶液、未經(jīng)修飾PHBHHx熒光納米顆粒和ETP-PhaP修飾的PHBHHx熒光納米顆粒處理1 h后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖5A所示，各樣品經(jīng)蛋白定量均一化后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖5B。

圖2 重組工程菌表達(dá)ETP-PhaP融合蛋白的SDS-PAGE圖 (A)及免疫印跡檢測(cè)結(jié)果 (B)

圖3 PHBHHx顆粒表面及孵育上清中ETP-PhaP融合蛋白的SDS-PAGE圖 (A) 及免疫印跡檢測(cè)結(jié)果(B)

圖4 SiHa及CaSKi細(xì)胞光鏡照片 (A) 及其EGFR表達(dá)水平的Western blotting鑒定圖 (B)

圖5 SiHa及CaSKi細(xì)胞對(duì)游離羅丹明B、未經(jīng)修飾和經(jīng)ETP-PhaP修飾的PHBHHx熒光納米顆粒的吞噬

由圖中可以看出，用羅丹明B和未經(jīng)ETP-PhaP融合蛋白修飾的載羅丹明B的納米顆粒處理細(xì)胞后，SiHa和CaSKi細(xì)胞在顯微鏡下均呈現(xiàn)微弱的橙紅色熒光著色。而用ETP-PhaP修飾的熒光納米顆粒處理兩種細(xì)胞后，表面EGFR低表達(dá)的CaSKi細(xì)胞著色未見(jiàn)增強(qiáng)，而在SiHa細(xì)胞內(nèi)可以明顯觀察到橙紅色熒光信號(hào)增強(qiáng)，熒光定量檢測(cè)結(jié)果也顯示ETP-PhaP修飾的熒光納米顆粒處理的SiHa細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加約2.3倍，說(shuō)明ETP-PhaP修飾的熒光納米顆粒可以經(jīng)由SiHa細(xì)胞表面的EGFR與ETP多肽的識(shí)別，更好地被EGFR高表達(dá)的SiHa細(xì)胞攝取內(nèi)吞入胞。

3 討論

PHA是一種天然的生物可降解聚酯材料，在體內(nèi)具有良好的生物相容性和生物可降解性，其降解產(chǎn)物3-羥基丁酸是人體內(nèi)正常代謝的中間產(chǎn)物酮體的一種，對(duì)細(xì)胞安全無(wú)毒。PHA在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用已得到廣泛的研究[22-23]，大量實(shí)驗(yàn)證明PHA材料對(duì)細(xì)胞的生物相容性?xún)?yōu)于其他生物降解高分子材料 (如PLA、PLGA、殼聚糖等)。近年來(lái)，其作為藥物遞送載體的研究也嶄露頭角[10-13]。PHA納米顆粒避免了很多納米微球 (如脂質(zhì)體等) 在大劑量使用時(shí)的毒性問(wèn)題[24]，其在體內(nèi)可完全降解并被徹底代謝掉，不存在體內(nèi)蓄積的潛在隱患?；赑HA材料的聚酯特性、良好的生物相容性和生物安全性，其在疏水性藥物的控釋方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[25]。PHA作為藥物載體的另一優(yōu)勢(shì)在于其表面可通過(guò)疏水作用吸附大量PHA顆粒結(jié)合蛋白 (PhaP)。而PhaP易與其他蛋白或多肽分子融合表達(dá)，從而可以方便地將多種靶向多肽分子通過(guò)與PhaP蛋白融合表達(dá)而高效地結(jié)合在PHA顆粒表面。

本研究中，我們將具有EGFR靶向作用的短肽ETP融合于PHA顆粒結(jié)合蛋白PhaP的氨基端，獲得的ETP-PhaP融合蛋白經(jīng)純化后由PhaP介導(dǎo)吸附于制備好的PHBHHx納米顆粒表面。經(jīng)測(cè)定及計(jì)算可以得到，PHBHHx納米顆粒表面對(duì)ETP-PhaP融合蛋白的吸附量約為 (153±11.5) μg/mg，即每毫克PHBHHx納米顆粒約吸附10 nmol的融合蛋白?？紤]PHBHHx的密度約為1.25 g/cm3，則每毫克材料制備的顆粒數(shù)約為4.0×1011個(gè)，由此可粗略計(jì)算出平均每個(gè)PHBHHx納米微球上能夠結(jié)合1.5×104個(gè)融合蛋白分子。這一估算值提示PHBHHx納米顆粒表面結(jié)合的ETP-PhaP融合蛋白較為豐富，進(jìn)一步可以通過(guò)定量質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)顆粒表面的蛋白結(jié)合量進(jìn)行更為精確的測(cè)定。

在進(jìn)行PHBHHx顆粒表面蛋白修飾的研究中，為了保證ETP-PhaP融合蛋白能夠充分與顆粒結(jié)合，本實(shí)驗(yàn)中設(shè)定了孵育時(shí)間為3 h，且使用了過(guò)量的ETP-PhaP融合蛋白。而在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們也發(fā)現(xiàn)，PhaP介導(dǎo)的PHBHHx顆粒表面融合蛋白的修飾在孵育1 h左右即可達(dá)到飽和。對(duì)于包封有藥物的高分子納米載體而言，在藥物裝載后進(jìn)行的修飾、分離等后續(xù)處理步驟都有可能造成包封藥物的泄露或損失，因此，后續(xù)加工步驟越少，工藝越簡(jiǎn)單，造成的藥物損失越少。經(jīng)PhaP介導(dǎo)的PHBHHx顆粒表面多肽修飾的過(guò)程非常簡(jiǎn)單，不需添加任何額外的反應(yīng)物或催化劑，只需將制備好的顆粒與融合蛋白溶液共混。通過(guò)控制投放的PHBHHx顆粒量與融合蛋白的量，能夠?qū)崿F(xiàn)全部融合蛋白均被吸附至顆粒表面。與采用化學(xué)交聯(lián)法對(duì)高分子納米顆粒表面修飾的工藝相比，通過(guò)PhaP介導(dǎo)進(jìn)行PHBHHx微球表面多肽的修飾極大地降低了顆粒修飾后繁瑣的反應(yīng)、分離及純化等步驟，也不存在反應(yīng)物或催化劑殘留等潛在問(wèn)題，是一種非常方便高效的方法。

與未經(jīng)ETP-PhaP修飾的納米顆粒相比，ETP-PhaP修飾后的PHBHHx熒光納米顆粒能夠更好地被EGFR高表達(dá)的SiHa細(xì)胞所攝取。而對(duì)EGFR低表達(dá)的CaSKi細(xì)胞而言，修飾與否并未對(duì)PHBHHx納米顆粒的被動(dòng)攝取造成明顯影響。這一體外結(jié)果顯示ETP-PhaP修飾后的PHBHHx納米顆粒具有針對(duì)EGFR選擇性的腫瘤細(xì)胞靶向能力。

4 結(jié)論

通過(guò)PhaP介導(dǎo)進(jìn)行PHBHHx微球表面多肽修飾的技術(shù)化工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，能夠有效實(shí)現(xiàn)EGFR靶向多肽在PHBHHx納米藥物載體表面的功能化修飾，使其具有明顯的體外EGFR高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的靶向作用。這一方法未來(lái)可進(jìn)一步用于多種不同靶向分子修飾的抗腫瘤藥物遞送載體的構(gòu)建與開(kāi)發(fā)。

[1] Seigneuric R, Markey L, Nuyten DS, et al. From nanotechnology to nanomedicine: applications to cancer research. Cur Mol Med, 2010, 10(7): 640–652.

[2] Farokhzad OC, Langer R. Impact of nanotechnology on drug delivery. ACS Nano, 2009, 3(1): 16–20.

[3] Shi J, Votruba AR, Farokhzad OC, et al. Nanotechnology in drug delivery and tissue engineering: from discovery to applications. Nano Lett, 2010, 10(9): 3223–3230.

[4] Jain RK, Stylianopoulos T. Delivering nanomedicine to solid tumors. Nat Rev Clin Oncol, 2010, 7(11): 653–664.

[5] Dong XW, Mumper RJ. Nanomedicinal strategies to treat multidrug-resistant tumors: current progress. Nanomedicine, 2010, 5(4): 597–615.

[6] Masood F. Polymeric nanoparticles for targeted drug delivery system for cancer therapy. Mater Sci Eng C, 2016, 60: 569–578.

[7] Kamaly N, Yameen B, Wu J, et al. Degradable controlled-release polymers and polymeric nanoparticles: Mechanisms of controlling drug release. Chem Rev, 2016, 116(4): 2602–2603.

[8] Mora-Huertas CE, Fessi H, Elaissari A. Polymer-based nanocapsules for drug delivery. Int J Pharm, 2010, 385(1): 113–142.

[9] Yin J, Chen XM, Chen GQ. Progress on polyhydroxyalkanoates (PHA). Chin J Biotech, 2016, 32(6): 726–737 (in Chinese).尹進(jìn), 車(chē)雪梅, 陳國(guó)強(qiáng). 聚羥基脂肪酸酯的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(6): 726–737.

[10] Lu XY, Ciraolo E, Stefenia R, et al. Sustained release of PI3K inhibitor from PHA nanoparticles andgrowth inhibition of cancer cell lines. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 89(5): 1423–1433.

[11] Xiong YC, Yao YC, Zhan XY, et al. Application of polyhydroxyalkanoates nanoparticles as intracellular sustained drug-release vectors. J Biom Sci Polymer Ed, 2010, 21(1): 127–140.

[12] Lu XY, Li MC, Zhu XL, et al. Microbial synthesized biodegradable PHBHHxPEG hybrid copolymer as an efficient intracellular delivery nanocarrier for kinase inhibitor. BMC Biotechnol, 2014, 14: 4.

[13] Shrivastav A, Kim HY, Kim YR. Advances in the applications of polyhydroxyalkanoate nanoparticles for novel drug delivery system. Biomed Rea Int, 2013, 2013: 581684.

[14] Chen GQ, Wu Q. The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials. Biomaterials, 2005, 26(33): 6565–6578.

[15] Pieper-Fürst U, Madkour MH, Mayer F, et al. Identification of the region of a 14-kilodalton protein of Rhodococcus ruber that is responsible for the binding of this phasin to polyhydroxyalkanoic acid granules. J Bacteriol, 1995, 177(9): 2513–2523.

[16] H?nisch J, W?ltermann M, Robenek H, et al. TheH16 phasin PhaP1 is targeted to intracellular triacylglycerol inclusions inPD630 andmc2155, and provides an anchor to target other proteins. Microbiology, 2006, 152(11): 3271–3280.

[17] Wang ZH, Wu HN, Chen J, Zhang J, et al. A novel self-cleaving phasin tag for purification of recombinant proteins based on hydrophobic polyhydroxyalkanoate nanoparticles. Lab Chip, 2008, 8(11): 1957–1962.

[18] Banki MR, Gerngross TU, Wood DW. Novel and economical purification of recombinant proteins: intein-mediated protein purification usingpolyhydroxybutyrate (PHB) matrix association. Protein Sci, 2005, 14(6): 1387–1395.

[19] Backstrom BT, Brockelbank JA, Rehm BH. Recombinantproduces tailor-made biopolyester granules for applications in fluorescence activated cell sorting: functional display of the mouse interleukin-2 and myelin oligodendrocyte glycoprotein. BMC Biotechnol, 2007, 7: 3.

[20] Yao YC, Zhan XY, Zhang J, et al. A specific drug targeting system based on polyhydroxyalkanoate granule binding protein PhaP fused with targeted cell ligands. Biomaterials, 2008, 29(36): 4823–4830.

[21] Li MC, Liu QQ, Lu XY, et al. Heterologous expression of human costimulatory molecule B7-2 and construction of B7-2 immobilized polyhydroxyalkanoate nanoparticles for use as an immune activation agent. BMC Biotechnol, 2012, 12: 43.

[22] Li Z, Loh XJ. Water soluble polyhydroxyalkanoates: future materials for therapeutic applications. Chem Soc Rev, 2015, 44(10): 2865–2879.

[23] You M, Peng G, Li J, et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells on polyhydroxyalkanoate (PHA) scaffolds coated with PHA granule binding protein PhaP fused with RGD peptide. Biomaterials, 2011, 32(9): 2305–2313.

[24] Yah CS, Simate GS, Iyuke SE. Nanoparticles toxicity and their routes of exposures. Pak J Pharm Sci, 2012, 25(2): 477–491.

[25] Fan F, Lu XY, Ren K, et al. Entrapment and sustained release of hydrophobic drugs with different molecular weights from PHBHHx-PEG nanoparticles. Chin J Biomed Eng, 2014, 23(2): 66–73.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Development of tumor targeting PHBHHx nanoparticles by PhaP mediated immobilization of EGFR-targeting peptide

Fan Fan, Jiangang Ma, Xiaoyun Lu, Teng Niu, and Zhimin Wu

Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education, School of Life Science and Technology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049, Shaanxi, China

PHA granule binding protein phasin (PhaP) has a high affinity for hydrophobic materials and can bind to hydrophobic polymers via strong hydrophobic interaction. In this study, an EGFR-targeting peptide (ETP) was fused with PhaP and the fusion protein ETP-PhaP was produced in recombinantBL21 (DE3) (pPI-ETP-P) and then purified by Ni affinity purification. The tumor targeting PHBHHx nanoparticles were developed based on PhaP mediated ETP immobilization and the cellular uptake of the ETP-PhaP modified PHBHHx NPs and none modified PHBHHx NPs by cervical cancer cell lines SiHa (EGFR over expressed) and CaSKi (EGFR low expressed) were analyzed. The purified ETP-PhaP could be adsorbed onto the hydrophobic surface of PHBHHx NPs. The ETP-PhaP modified PHBHHx NPs could target to EGFR over expressed cervical cancer cells SiHa more efficiently than to the EGFR low expressed CaSKi cells. These results demonstrated the advantage in effectiveness and convenience of PhaP mediated ETP adsorption on PHBHHx nanoparticles, providing a novel strategy for hydrophobic nanocarrier surface modification.

PhaP, PHBHHx, EGFR, tumor targeting, drug delivery carrier

10.13345/j.cjb.160454

November 18, 2016; Accepted:February 6, 2017

Xiaoyun Lu. Tel/Fax: +86-29-82668463; E-mail: luxy05@mail.xjtu.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 81172170, 81371288).

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 81172170，81371288)資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-04-11

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170411.1704.002.html