齊允晶，王家林，欒國棟，談曉明，呂雪峰

?

藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的發(fā)展與展望

齊允晶1,2，王家林1，欒國棟2，談曉明2，呂雪峰2

1 青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島 266042 2 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所中國科學(xué)院生物燃料重點實驗室，山東青島 266101

齊允晶, 王家林, 欒國棟, 等. 藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的發(fā)展與展望. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(6): 891–909.Qi YJ, Wang JL, Luan GD, et al. Cyanobacteria cell factories for ethanol photosynthetic production: development and prospect. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 891–909.

生物乙醇是極具應(yīng)用潛力和代表性的生物能源產(chǎn)品之一。以藍細(xì)菌為光合平臺，利用二氧化碳和太陽能直接進行乙醇合成可以同時起到降低二氧化碳排放和提供可再生能源的效果，具有重要的研究與應(yīng)用價值。本文回顧了藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠相關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷程和現(xiàn)狀，從途徑優(yōu)化、底盤選擇和代謝工程策略等層面對其最新進展和所遇到的問題進行了總結(jié)介紹，并對該技術(shù)未來發(fā)展方向進行了展望。

藍細(xì)菌，生物乙醇，代謝工程，細(xì)胞工廠，乙醇耐受性

全球性的環(huán)境污染問題和潛在的能源危機正推動著用于合成新一代綠色生物燃料的可持續(xù)性技術(shù)路線和生產(chǎn)模式的發(fā)展，以期能夠有效補充和替代正在被大量消耗的石化燃料[1-2]。作為最早實現(xiàn)商業(yè)化推廣和應(yīng)用的生物燃料產(chǎn)品，乙醇已經(jīng)被廣泛接受和應(yīng)用為燃油添加劑甚至替代品[3-5]。目前絕大部分的生物乙醇來源于生物煉制過程，其生產(chǎn)技術(shù)可以根據(jù)原料和底物來源劃分為3代。最初的生物乙醇合成以含糖量豐富的農(nóng)作物生物質(zhì)為原料，其中以“玉米乙醇”最具代表性，但是其“與糧爭地、與人爭糧”以及原料供應(yīng)不足的問題引發(fā)了極大的社會爭議，進而直接限制了該技術(shù)的實際可推廣性[6-7]。第二代生物乙醇以非糧生物質(zhì)為主要原料，通過對以木質(zhì)纖維素為代表的農(nóng)業(yè)廢棄物、林業(yè)廢棄物等的收集、處理和發(fā)酵進行乙醇合成，該技術(shù)體系緩解了“糧食乙醇”在原料供應(yīng)上的天然不足，但是纖維素原料預(yù)處理過程中對能量、水和纖維素酶等的需求極大地提高了二代生物乙醇的生產(chǎn)成本，束縛了該技術(shù)的應(yīng)用潛力[8]。以真核和原核藻類等易于培養(yǎng)、生長迅速的光合自養(yǎng)生物的生物質(zhì)提供底物進行生物煉制，可以極大地降低原材料預(yù)處理的難度和耗費進而節(jié)省生產(chǎn)成本，被稱之為第三代生物燃料技術(shù)，表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景[9-11]。

代謝工程與合成生物學(xué)相關(guān)理論和技術(shù)的發(fā)展，使得通過基因工程改造，利用光合生物平臺將太陽能和二氧化碳直接轉(zhuǎn)化為生物燃料產(chǎn)品的技術(shù)逐漸成熟。與傳統(tǒng)的生物煉制過程相比，該路線減少了原材料預(yù)處理、底物提煉過程的損耗，降低了對培養(yǎng)體系中各種營養(yǎng)成分的需求，也大大節(jié)省了化學(xué)品合成全過程中對淡水和用地的需求，這些優(yōu)勢使其逐漸成為科研與產(chǎn)業(yè)界關(guān)注的焦點[12-14]。藍細(xì)菌 (Cyanobacteria)，又稱藍藻 (Blue-green algae)，是一類能夠進行光合作用的原核、自養(yǎng)微生物。與真核微藻相比，藍細(xì)菌具有結(jié)構(gòu)簡單、生長迅速、遺傳操作便捷等優(yōu)勢，因此成為極具潛力的生物基化學(xué)品光合平臺[13,15]。在涵蓋集胞藻、聚球藻、魚腥藻等不同種屬的模式藍細(xì)菌藻株中，都已經(jīng)發(fā)展起了成熟的遺傳操作體系；而轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝物組學(xué)等各種系統(tǒng)生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用則促進了對藍細(xì)菌在不同環(huán)境、不同培養(yǎng)條件下，生理、生化和代謝層面各種響應(yīng)機制的理解與認(rèn)識。上述研究和技術(shù)基礎(chǔ)成為助推藍細(xì)菌光合平臺基礎(chǔ)上各種生物基化學(xué)品和生物燃料產(chǎn)品合成路線成功開發(fā)的強大動力。

現(xiàn)階段通過外源基因引入和天然代謝網(wǎng)絡(luò)的修飾，已經(jīng)成功在藍細(xì)菌中實現(xiàn)了氫[16]、醇[17-18]、酮[19]、酸[20-21]、醛[22]、烴[23-24]、糖[25-26]等數(shù)十種天然和非天然代謝產(chǎn)物的光合合成。乙醇是最早報道的也是現(xiàn)階段最具代表性的藍細(xì)菌光合生物燃料產(chǎn)品，開發(fā)高效的藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠，既可以促進新的乙醇合成技術(shù)體系的發(fā)展，又對其他化學(xué)品光合平臺的構(gòu)建具有充分的示范意義。本文將對藍細(xì)菌光合生物乙醇相關(guān)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀進行回顧和總結(jié)，并對其前景和方向進行展望。

1 藍細(xì)菌乙醇光合合成的核心途徑

在對藍細(xì)菌野生型藻株的研究中發(fā)現(xiàn)，其中少數(shù)藻株具有極為微弱的乙醇合成能力。1991年，Heyer等對隨機挑選的37株野生型藍細(xì)菌藻株進行發(fā)酵培養(yǎng)并分析了其代謝產(chǎn)物，結(jié)果在其中 16株野生型藍細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到了乙醇，最高產(chǎn)量達到0.46 mg/L[27]；2010年Carrieri等發(fā)現(xiàn)鹽脅迫可以使螺旋藻發(fā)酵產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量提高120倍，達到0.75 mmol/g干重[28]。但總的來說，天然藍細(xì)菌藻株的乙醇合成能力弱而且合成條件苛刻，只能在發(fā)酵條件下產(chǎn)生，而且代謝途徑不清楚，缺乏實際改造和應(yīng)用潛力。真正具備改造和應(yīng)用潛力的藍細(xì)菌乙醇光合合成技術(shù)是隨著代謝工程和合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展而逐步成熟的，通過將異源的、高效的乙醇合成途徑通過遺傳操作導(dǎo)入藍細(xì)菌底盤細(xì)胞，并輔之以對天然代謝背景的改造，真正實現(xiàn)了藍細(xì)菌胞內(nèi)代謝流重構(gòu)，將其光合作用中固定的二氧化碳導(dǎo)向乙醇合成。

現(xiàn)階段，所有的藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的開發(fā)都是通過丙酮酸脫羧酶-Ⅱ型乙醇脫氫酶 (Pyruvate decarboxylase-alcohol dehydrogenase Ⅱ，Pdc-AdhII) 途徑的引入、重構(gòu)和調(diào)控而實現(xiàn)的(如圖1所示)。最初的藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠采用的是來自運動發(fā)酵單胞菌中的PdcZM-AdhIIZM途徑[17]，該途徑也普遍應(yīng)用于其他微生物乙醇細(xì)胞工廠的構(gòu)建中[29-31]。

圖1 藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的設(shè)計和代謝工程改造策略

1.1 丙酮酸脫羧酶

丙酮酸脫羧酶 (Pyruvate decarboxylase) 是一種焦磷酸硫胺素 (Thiamine pyrophosphate，TPP) 依賴型的羧化酶，其全酶狀態(tài)由輔酶TPP、金屬離子Mg2+(或Mn2+) 以及蛋白自身構(gòu)成，作用于α-酮酸，經(jīng)脫羧反應(yīng)形成二氧化碳和相應(yīng)的醛分子。丙酮酸在脫羧過程中羰基碳原子上會產(chǎn)生電負(fù)性，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，而輔因子TPP的存在可以與其結(jié)合，避免此種情況。丙酮酸脫羧酶廣泛存在于豆質(zhì)植物、麻黃等植物 (大豆、麻黃等)、真菌 (釀酒酵母、曲霉等) 以及細(xì)菌 (運動發(fā)酵單胞菌、醋桿菌等) 中，在動物細(xì)胞中不存在該酶，不同來源的丙酮酸脫羧酶性質(zhì)略有不同。

丙酮酸脫羧酶一直被認(rèn)為是同型乙醇發(fā)酵中的關(guān)鍵酶，其表達與活性極大地影響著乙醇合成的效率?，F(xiàn)階段，藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠中普遍采用的基因來自于運動發(fā)酵單胞菌。2002年Raj等從棕櫚發(fā)酵細(xì)菌中克隆、鑒定了一種更高效的丙酮酸脫羧酶PdcZP，相比較于來自運動發(fā)酵單胞菌的PdcZM，該酶在pH 6.0和7.0兩種條件下都具有更低的m、更高的比活[32]。2012年Algenol公司使用該基因pdc替換pdc，使工程藻株的乙醇產(chǎn)量提高了10%–20%[33-34]。在未來，通過對微生物資源和酶資源的充分挖掘或者通過對現(xiàn)有丙酮酸脫羧酶基因進行定向進化改造[35]以獲得活性、穩(wěn)定性更高的丙酮酸脫羧酶基因，將有希望進一步提高乙醇合成效率。

1.2 Ⅱ型乙醇脫氫酶

醇脫氫酶大量存在于植物、動物和微生物細(xì)胞中[36]，Ⅱ型醇脫氫酶是一種含鋅酶類，以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH) 為輔酶，其全酶形態(tài)為含4個亞基的四聚體，每個亞基結(jié)合 1個NADH/NADPH和1個Zn2+，催化伯醇和相應(yīng)醛之間的可逆反應(yīng)。最初，用于改造藍細(xì)菌進行乙醇合成的Ⅱ型醇脫氫酶基因同樣來自運動發(fā)酵單胞菌[17,37]。為了提高藍細(xì)菌乙醇合成效率，對乙醇脫氫酶進行的探索和研究則更為廣泛和深入。Algenol公司的研究人員對來自運動發(fā)酵單胞菌的adhI和adhII、來自集胞藻sp. PCC6803 (以下簡稱為集胞藻PCC6803) 的，以及來自大腸桿菌K12和嗜熱型藍細(xì)菌BP-1的兩種雙功能醛/醇脫氫酶分別與pdc串聯(lián)后由銅離子誘導(dǎo)型啟動子控制，在集胞藻PCC6803中表達并測定乙醇合成情況。結(jié)果證明來自PCC6803自身的基因藻株最適合用于乙醇合成，相應(yīng)工程藻株獲得了最高的乙醇產(chǎn)量[33]。

本實驗室此前的研究中獲得了類似的結(jié)果，通過將對來自集胞藻、魚腥藻 (sp. PCC7120，以下簡稱為魚腥藻PCC7120)、聚球藻 (s sp. PCC7942，以下簡稱為聚球藻PCC7942) 的9種醇脫氫酶基因 (集胞藻PCC6803的、和，魚腥藻PCC7120的、、、和，聚球藻PCC7942的) 以及adhII基因分別和pdc串聯(lián)后在.中表達后，通過工程菌株生長和產(chǎn)醇能力進行初篩，發(fā)現(xiàn)pdc-slr1192的組合實現(xiàn)了最高的乙醇合成速率，在集胞藻PCC6803工程藻株中將運動發(fā)酵單胞菌來源的adhII替換為，經(jīng)過20 d培養(yǎng)后的乙醇產(chǎn)量從0.4 g/L提高至0.6 g/L，約為50%的提高幅度[38]。

相比較于異源的adhII，的優(yōu)勢可能來自于兩方面：首先，作為催化可逆反應(yīng)的酶，在乙醛和乙醇兩種底物之間親和性的差異要大于運動發(fā)酵單胞菌中的AdhIZM和AdhIIZM[33, 38]，后者的可逆性導(dǎo)致了光照培養(yǎng)后期一部分積累的乙醇被重新轉(zhuǎn)化為乙醛進而降低了乙醇產(chǎn)量，而使用的工程藻株則無此現(xiàn)象。另外，更傾向于以NADPH而非NADH為輔酶[39]，而集胞藻PCC6803中NADPH的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過NADH[40]。上述因素意味著，使用為AdhII的集胞藻PCC6803工程藻株在乙醇光合合成過程中可以獲得更穩(wěn)定的底物和輔因子供應(yīng)，因而具有更好的產(chǎn)醇潛力。

1.3 Pdc-AdhII途徑的系統(tǒng)分析

Pdc-AdhII途徑在藍細(xì)菌中將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛進而轉(zhuǎn)化為乙醇，在此過程中既存在兩種酶之間的承接協(xié)作又存在外源途徑與底盤細(xì)胞之間的適配互作。長遠(yuǎn)角度看，解析、優(yōu)化Pdc-AdhII途徑，明確其與底盤細(xì)胞之間的適配關(guān)系對進一步提高乙醇光合效率有重要意義。2015年，本實驗室采用體外重構(gòu)動態(tài)分析的策略，對pdc-slr1192途徑進行了系統(tǒng)分析。Luan等首先脫離復(fù)雜的胞內(nèi)環(huán)境在胞外重新構(gòu)建該途徑，以純化后的酶 (PdcZM/slr1192)、底物 (丙酮酸，pyruvate)、輔因子 (NADPH/ NADH/TPP)、金屬離子 (Mg2+) 以及中間產(chǎn)物 (乙醛，acetaldehyde) 對整個途徑的催化效率影響分別進行定量的滴定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PdcZM的K為0.326 μmol/L，而最大反應(yīng)速率V是 2.074 μmol/(L·s)，相應(yīng)數(shù)值分別為 0.109 μmol/L和1.722 μmol/(L·s)，表明影響乙醇合成的限制因素是PdcZM而非；而在總蛋白濃度設(shè)置恒定的分析中，PdcZM-slr1192的濃度比為4∶6時全途徑具有最大的乙醇合成催化活性。我們進而在集胞藻PCC6803中構(gòu)建了PdcZM-slr1192濃度配比不同的工程菌株，通過代謝工程結(jié)合酶活與蛋白含量分析實驗，證明pdc而非的表達量和活性是現(xiàn)階段藍細(xì)菌工程藻株乙醇合成的限制性因素，而提高PdcZM活性和表達強度應(yīng)該是進一步代謝工程改造的方向。此外，在體外重構(gòu)分析中，NADPH、丙酮酸、TPP、Mg2+和乙醛等組分的m值分別為0.136、6.496、0.011、0.104和0.393 mmol/L，結(jié)合藍細(xì)菌胞內(nèi)NADPH和丙酮酸等成分的實際含量分析，提高NADPH和丙酮酸的供應(yīng)量應(yīng)該是提高乙醇合成效率的重要選擇[41]。

2 藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的底盤細(xì)胞選擇

藍細(xì)菌是最古老的生命體之一，其種類繁多、分布廣泛，在海洋、淡水以及陸域等多種生態(tài)系統(tǒng)中都有分布；而不同藻屬中有單細(xì)胞、絲狀體或絲狀不分化等多種細(xì)胞形式；不同藻株在光合固碳速率、碳匯途徑、固氮能力等生理代謝特性上也有差異[42]。系統(tǒng)考慮代謝改造潛力和未來工程化應(yīng)用的需要而合理地選擇底盤細(xì)胞，對構(gòu)建高效的乙醇光合細(xì)胞工廠有著重要意義。表1對不同底盤細(xì)胞基礎(chǔ)上構(gòu)建的一系列藍細(xì)菌乙醇光合工程藻株進行了總結(jié)。

表1 代表性的藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠

2.1 聚球藻sp. PCC7942和集胞藻PCC6803

利用藍細(xì)菌進行乙醇光合合成最初是在聚球藻PCC7942實現(xiàn)的。1999年，Deng等將pdc-adhII途徑克隆在穿梭載體pCB4上導(dǎo)入集胞藻PCC7942，采用啟動子 (編碼藍細(xì)菌自身核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶基因的啟動子) 控制表達，在培養(yǎng)4周后工程藻株的乙醇產(chǎn)量達到0.23 g/L，這也是最早的通過代謝工程手段實現(xiàn)的藍細(xì)菌化學(xué)品光合合成的報道[17]。雖然聚球藻PCC7942后來廣泛應(yīng)用于異丁醛、異丁醇[22]、正丁醇[18]、2,3-丁二醇[43]、蔗糖[25]、異丙醇[44]、1,3-丙二醇[45]和丙酮[46]等多種化學(xué)品的光合合成，但藍細(xì)菌光合合成乙醇的研究卻主要集中于另一種模式藻株集胞藻PCC6803中。

相比較于PCC7942，集胞藻PCC6803細(xì)胞內(nèi)染色體高拷貝的特性[47]意味著相同的表達元件在PCC6803中可能會有更高強度、更穩(wěn)定的表達，而現(xiàn)在普遍應(yīng)用的編碼AdhII的基因也來自于集胞藻PCC6803，其催化反應(yīng)與宿主的適配性可能也優(yōu)于聚球藻PCC7942。2009年，Dexter等將pdc-adhII途徑整合至PCC6803基因組上，使用光誘導(dǎo)型強啟動子控制表達，經(jīng)過6 d培養(yǎng)后乙醇產(chǎn)量即達到0.46 g/L，約為此前聚球藻PCC7942工程藻株產(chǎn)量的2倍，而平均合成速率提高8倍，表明PCC6803可能比PCC7942更適于作為乙醇光合工程藻株構(gòu)建的底盤細(xì)胞[37]。同年，Algenol公司采用集胞藻PCC6803內(nèi)源的基因代替adhII，采用銅離子誘導(dǎo)型的啟動子控制整條途徑表達，工程藻株培養(yǎng)37 d后乙醇產(chǎn)量達到3.6 g/L[33]。2014年Dienst等采用高拷貝質(zhì)粒將同樣的PpetJ-pdc-slr1192途徑導(dǎo)入集胞藻PCC6803，模擬光暗12 h交替的培養(yǎng)條件，工程藻株產(chǎn)率達到至287 mg/(L·d)，經(jīng)過18 d培養(yǎng)后積累了4.7 g/L的乙醇[48]。Algenol公司以集胞藻PCC6803為底盤細(xì)胞還嘗試了大量不同啟動子對pdc-slr1192途徑的表達效果及對乙醇合成能力的影響，其中采用銅離子誘導(dǎo)型時，工程藻株經(jīng)過30 d培養(yǎng)產(chǎn)量達到 7.1 g/L[33]，實現(xiàn)了長時間內(nèi)穩(wěn)定的乙醇光合合成。本實驗室在2012年的研究中發(fā)現(xiàn)，通過在集胞藻PCC6803基因組上將啟動子控制的pdc-途徑增加一個拷貝(Prbc-pdc-)，可以使乙醇產(chǎn)量大幅提高，在26 d培養(yǎng)后從2 g/L的水平提高至5.5 g/L，產(chǎn)率達到212 mg/(L·d)[38]；在后續(xù)的工作中我們發(fā)現(xiàn)通過在基因組上引入第3個-pdc-拷貝，乙醇產(chǎn)量可以進一步提高至8.8 g/L (未發(fā)表 數(shù)據(jù))。

2.2 聚球藻PCC7002

聚球藻PCC7942和集胞藻PCC6803的生理和代謝背景相對清晰，遺傳操作工具發(fā)展成熟，但是這兩種藻株存在共同的問題是其對溫度、高光、高鹽、酸堿變化等環(huán)境脅迫的耐受性較差，生長速度也較慢，上述因素限制了已有的藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用的前景。相比較而言，聚球藻s sp. PCC7002 (以下簡稱為聚球藻PCC7002) 可能是一種更好的選擇[49]，該藻株最適生長溫度為38 ℃ (PCC6803為30 ℃)，可以耐受500 μmol photons/(m2·s) 的光照強度(PCC6803和PCC7942最適光強為300 μmol photons/(m2·s))；在38 ℃、500 μmol photons/(m2·s)的光照強度下，該藻株細(xì)胞復(fù)制代時為4.1 h，而PCC7942為8.5 h[50]；而且PCC7002是海洋藍細(xì)菌，其耐鹽性更好，進行規(guī)?；a(chǎn)時可以直接使用海水進行培養(yǎng)，因此在工程化應(yīng)用和推廣上具有顯著的優(yōu)勢；此外，聚球藻PCC7002細(xì)胞中攜帶有拷貝數(shù)很高的內(nèi)源性質(zhì)粒，以內(nèi)源性質(zhì)粒序列為整合靶點可以有效地提高整合途徑的拷貝數(shù)，提高表達強度[51-52]，而這一點對現(xiàn)階段提高化學(xué)品光合合成通量來說具有重要意義。2012年，Algenol公司的研究人員在PCC7002中以啟動子 (鈷離子誘導(dǎo)型) 和啟動子分別控制pdc和表達，培養(yǎng)20 d后，乙醇產(chǎn)量可達到4.7 g/L；同年，美國Joule公司申請專利介紹的研究策略中，通過向PCC7002中引入1個pdc和2個不同來源的基因，同時敲除PCC7002自身的硫辛酸合成途徑 (，)，以限制工程藻株生物量積累而最大化乙醇合成強度，經(jīng)過329 h培養(yǎng)即可生產(chǎn)5.62 g/L的乙醇，為PCC7002底盤細(xì)胞的最高乙醇產(chǎn)量，同時也實現(xiàn)了已知的最高乙醇光合生產(chǎn)強度[53-54]。

2.3 非模式藻株

傳統(tǒng)的模式藻株雖然在遺傳操作工具的開發(fā)、生理和代謝特性的解析上有著更豐富的積累，但其在環(huán)境脅迫適應(yīng)性、生長速度等與規(guī)模擴大化培養(yǎng)密切相關(guān)的性質(zhì)上往往難以令人滿意，因此充分挖掘藍細(xì)菌種質(zhì)資源多樣性與豐富性，探索更適合乙醇光合合成、更具有應(yīng)用潛力的非模式藻株，對于藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的未來發(fā)展有著重要意義。Algenol公司已經(jīng)報道了一種新的藍細(xì)菌藻株，命名為ABICyanol，相比于已知的對各種環(huán)境脅迫因素耐受性較強的模式藻株聚球藻PCC7002，該藻株在乙醇耐受性、高溫耐受性和過氧化耐受性等方面又有了明顯的提高，對該藻株遺傳改造結(jié)果表明，選用其自身的啟動子控制pdc表達而啟動子控制基因表達，在光照培養(yǎng)初期乙醇的單天生產(chǎn)強度可以達到0.552 g/(L·d)，但這種高強度乙醇合成維持時間較短，在培養(yǎng)超過7 d后產(chǎn)醇強度逐漸降低[55]。上述研究表明通過對非模式藻株資源的充分挖掘可以為藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的發(fā)展注入新的活力，而后續(xù)對ABICyanol等藻株的生理和代謝特性有更深入的理解后，有望實現(xiàn)高強度、更具穩(wěn)定性和持續(xù)性的乙醇光合合成，從而真正提高此技術(shù)的應(yīng)用化潛力。

最近報道的一種聚球藻藻株UTEX 2973是又一種值得嘗試的底盤細(xì)胞。盡管UTEX2973藻株在基因組上與聚球藻PCC7942具有高達98%的相似性 (包括55個SNP和1個188.6 kb大片段的位置翻轉(zhuǎn))，該菌卻表現(xiàn)出了顯著提高的環(huán)境脅迫適應(yīng)性和更快的生長速度，在高光強 (500 μmo photons/(m2·s))和高溫 (41 ℃) 培養(yǎng)條件下其代增時間只有2.1 h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過此前報道過的各種模式藻株[50]。而本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)通過向該藻株中導(dǎo)入蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因，就可以改造成高效的蔗糖光合平臺，且可以經(jīng)過多次重懸培養(yǎng)而相對穩(wěn)定地進行蔗糖合成與分泌[56]，意味著該藻株具有改造成為高效光合平臺并用于乙醇合成的潛力。

3 藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的代謝工程改造策略

3.1 提高乙醇合成途徑的表達強度

在已有的藍細(xì)菌光合細(xì)胞工廠開發(fā)過程中普遍發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率往往受制于核心代謝途徑的催化效率，強化關(guān)鍵代謝途徑表達強度通常是改變碳流、優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物合成速率的首要選擇[57-58]。這一策略在藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠開發(fā)中也得到了證實和應(yīng)用 (如圖1中綠色空框箭頭所示)。如前所述，本實驗室在對集胞藻PCC6803的改造中，通過逐步提高Prbc-pdc-slr1192途徑在染色體上進行整合的拷貝數(shù)，極大地提高了乙醇的產(chǎn)量和合成速率[38]。而在聚球藻PCC7002的改造中，該藻株自身攜帶有數(shù)個拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于染色體數(shù)目的內(nèi)源性質(zhì)粒，選擇此類高拷貝內(nèi)源質(zhì)粒作為整合靶點以提高關(guān)鍵途徑的拷貝數(shù)，將會成為對聚球藻PCC7002乙醇光合細(xì)胞工廠進一步改造的重要策略。

3.2 競爭性途徑敲除

通過敲除碳源競爭性途徑來提高乙醇合成性能的成功報道較少，只有Algenol公司在導(dǎo)入了pdc-adhⅡ途徑的集胞藻PCC6803的同時，敲除乙酸激酶 () 基因和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶 () 基因，使工程藻株12 d培養(yǎng)過程中的乙醇產(chǎn)量從0.47 g/L成功加倍達到0.95 g/L[33](如圖1中紅色X所示)。

而集胞藻PCC6803中兩種主要的碳匯途徑糖原和PHB的敲除對乙醇合成則沒有正面的影響。2012年本實驗室發(fā)現(xiàn)向集胞藻PCC6803中導(dǎo)入1拷貝的-pdc-同時敲除PHB合成途徑 (--) 并不能有效提高乙醇產(chǎn)量；類似結(jié)果在對集胞藻PCC6803乳酸合成工程藻株的改造中也得到證實[59]，意味著PHB途徑的敲除并不能有效影響或促進工程藻株乙醇的產(chǎn)量。本實驗室對乙醇高產(chǎn)藻株Syn-HZ24中的糖原合成途徑 (，) 進行了敲除，結(jié)果在無脅迫培養(yǎng)條件下乙醇產(chǎn)量沒有任何提高；雖然對工程藻株進行缺氮處理時，糖原合成缺失的藻株中乙醇合成的碳源分配會得到加強，但其產(chǎn)量仍低于在無脅迫培養(yǎng)條件下的水平，意味著這種非正常培養(yǎng)狀態(tài)下提升并無法真正實現(xiàn)乙醇光合產(chǎn)量的有效提高 (未發(fā)表數(shù)據(jù))。作為藍細(xì)菌中最重要的碳匯機制，糖原代謝所扮演的角色并不是簡單的碳流競爭途徑，而是起到了全局性緩沖與“穩(wěn)壓器”的作用。糖原的敲除往往給細(xì)胞造成生理、代謝層面的負(fù)面影響，降低細(xì)胞對環(huán)境脅迫的適切性[60-61]，進而造成化學(xué)品光合合成整體效能的降低，這一現(xiàn)象在其他藍細(xì)菌化學(xué)品光合平臺的改造中也得到了證實[59,62]。

3.3 輔因子工程

以集胞藻PCC6803為例，促進藍細(xì)菌乙醇光合性能提升的一個重要進展是通過將NADH偏好性的AdhIIZM替換為NADPH偏好性的slr1192，極大地改善了代謝途徑與宿主背景代謝之間的適配性，也證明了在輔因子供給層面途徑對乙醇光合細(xì)胞工廠進行優(yōu)化的重要性。如前所述，本實驗室在此前對PdcZM-slr1192途徑的體外重構(gòu)和動態(tài)分析時發(fā)現(xiàn)，NADPH對該途徑催化乙醇合成的m值為0.136 mmol/L，而飽和值超過0.5 mmol/L，而實際上集胞藻PCC6803中實際NADPH濃度在0.05–0.10 mmol/L左右[40-41]，因此增加NADPH的供應(yīng)可能成為提高乙醇產(chǎn)量的有效策略。2016年，Choi等在集胞藻PCC6803野生型過量表達其內(nèi)源的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (基因編碼)，有效提高了胞內(nèi)NADPH含量，可以使PCC6803在自養(yǎng)和混養(yǎng)體系中的生物量均有增加；而進一步實驗中，在引入了乙醇合成途徑 (pdc-yqhD，為來源于大腸桿菌的乙醇脫氫酶編碼基因，以NADPH為輔酶) 的工程藻株中過量表達時，培養(yǎng)14 d后乙醇產(chǎn)量增加33%，由0.44 g/L提高到0.59 g/L[63]。通過輔因子工程來提高藍細(xì)菌乙醇光合性能，另一種潛在策略是改善乙醇脫氫酶輔因子的偏好性。Meng等采用理性設(shè)計策略成功優(yōu)化了來自德式乳桿菌的D-乳酸脫氫酶的輔因子偏好性，使之可以同樣利用NADH和NADPH作為催化輔因子，而且采用兩種輔因子的時候催化活性均有所提高[64]。如果類似策略能夠成功應(yīng)用于AdhII (slr1192) 的改造則等同于增加了該酶在藍細(xì)菌胞內(nèi)的輔因子供應(yīng)量 (從NADPH到NADPH+NADH)，從而進一步提高乙醇合成的穩(wěn)定性與效率。

3.4 基于代謝網(wǎng)絡(luò)模型的改造靶點預(yù)測

雖然基于對局部代謝途徑的分析和傳統(tǒng)異養(yǎng)微生物代謝工程改造經(jīng)驗的指導(dǎo)，已經(jīng)在藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠和其他化學(xué)品光合平臺的開發(fā)中進行了大量遺傳操作來實現(xiàn)碳流的重新分配，但此類直觀、簡單的基因敲除缺乏對整個藍細(xì)菌代謝網(wǎng)絡(luò)全局調(diào)控和表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的充分理解，尤其缺乏對藍細(xì)菌特有的光合固碳系統(tǒng)本身特性以及其與中心代謝互作關(guān)系的考量。藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的深度優(yōu)化需要更具針對性的代謝工程改造靶點預(yù)測和改造策略設(shè)計。基于系統(tǒng)生物學(xué)海量數(shù)據(jù)的積累和挖掘，在基因組測序基礎(chǔ)上的各種基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的發(fā)展，已成為指導(dǎo)代謝工程改造不可或缺的有力工具，并廣泛應(yīng)用于預(yù)測改造靶點，提高代謝通量。利用代謝網(wǎng)絡(luò)模型進行敲除靶點和敲除策略的設(shè)計以優(yōu)化碳流、提高藍細(xì)菌乙醇光合合成效率的研究已經(jīng)有了初步進展 (圖1)。

2013年，Sengupta等以集胞藻PCC6803基因組規(guī)模代謝模型為基礎(chǔ)，結(jié)合通量平衡分析 (Flux balance analysis，F(xiàn)BA)、最小化代謝調(diào)整 (Minimization of metabolic adjustment，MOMA) 以及調(diào)控開關(guān)最小化 (Regulatory on/off minimization，ROOM) 等多種代謝建模技術(shù)進行基因敲除效果分析。結(jié)果顯示，集胞藻PCC6803代謝網(wǎng)絡(luò)中通過敲除腺苷酸激酶基因 (Adenylate kinase，，)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(Phosphotransacetylase，，) 和乙酸激酶基因 (Acetate kinase，，) 可以顯著提高乙醇合成通量[65]。而前文中已經(jīng)提到的，Algenol公司在代謝工程改造實驗中已經(jīng)證實同時敲除集胞藻PCC6803中和基因確實提高了工程藻株中乙醇的產(chǎn)量，充分證明采用代謝網(wǎng)絡(luò)模型輔助預(yù)測敲除靶點的策略是有效的，有望提高藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的改造效率和效果。

2014年，Erdrich等基于集胞藻PCC6803的基因組規(guī)模的化學(xué)計量模型，結(jié)合CASOP (Computational approach for strain optimization aiming at high productivity，應(yīng)對高生產(chǎn)率變化的優(yōu)化計算方法) 和cMCS (Minimal cut set，最小切集) 系統(tǒng)分析并設(shè)計了集胞藻中乙醇合成工程藻株的改造和優(yōu)化方案，對大量基因敲除模擬的分析結(jié)果顯示，降低胞內(nèi)ATP和NADPH的比率可以促進乙醇的合成，而二者比率的改變可以通過以下方式實現(xiàn)：1) 降低ATP合成；2) 提高ATP消耗；3) 提高NADPH合成；4) 降低NADPH消耗；具體到實際的代謝工程改造，包括阻斷環(huán)式電子傳遞流、引入ATP代謝空循環(huán)機制等策略[66]。而上述研究結(jié)果在2015年Knoop等的后續(xù)研究中得到進一步證實[67]。通過代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)，研究人員分析了集胞藻PCC6803中代謝產(chǎn)物合成過程中的化學(xué)計量特性和平衡關(guān)系，監(jiān)測了細(xì)胞生長模式到產(chǎn)物合成模式中代謝系統(tǒng)特性的轉(zhuǎn)變，結(jié)果顯示PCC6803的線性電子傳遞鏈中ATP/NADPH比率 (1.28∶1) 與細(xì)胞生長和乙醇合成的適配關(guān)系不同，對生物量積累而言最優(yōu)的ATP/NADPH比率為1.51，而乙醇合成最適比率則為1.17。這一結(jié)果與Endrich等研究工作中對ATP/NADPH比率調(diào)整需求的預(yù)測是相符的。

2016年，Yoshikawa團隊開發(fā)了鈍頂節(jié)旋藻NIES-39的基因組規(guī)模代謝模型 (包含746組代謝反應(yīng)、673種代謝產(chǎn)物)，并結(jié)合FBA方法對藻株代謝改造進行模擬和預(yù)測。鈍頂節(jié)旋藻本身就可以進行乙醇合 成[28,68]，而基因和途徑敲除模擬分析發(fā)現(xiàn)，銨鹽比硝酸鹽更適合作為鈍頂節(jié)旋藻產(chǎn)醇的氮源；敲除NAD(P)H脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶等呼吸鏈功能相關(guān)基因以促進NADPH供應(yīng)可能有助于促進乙醇合成，將藻株固定的碳源向乙醇的分配比提高到43%；而通過敲除磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇酶或磷酸甘油酸變位酶等基因以阻斷酵解途徑可以將乙醇合成占碳源的分配比率提高至50%以上[69]。

雖然現(xiàn)階段代謝模型基礎(chǔ)上所進行的敲除靶點預(yù)測、敲除策略設(shè)計等還普遍缺乏實驗驗證，但是相比于傳統(tǒng)的直觀層面上單純對競爭旁路的敲除策略相比，此種技術(shù)體系下所提出的針對藍細(xì)菌固有生理功能和光合特性的改造策略，無疑會在未來成為提高乙醇光合合成效率的首要選擇。

3.5 藍細(xì)菌新型基因組編輯技術(shù)的發(fā)展

一直以來，藍細(xì)菌的遺傳操作主要是通過同源重組將外源DNA向基因組上特點位點進行整合，以實現(xiàn)外源基因的表達或內(nèi)源基因的敲除。外源DNA可以通過直接吸收 (集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7932以及聚球藻PCC7002等) 或接合轉(zhuǎn)移 (魚腥藻PCC7120和聚球藻UTEX2973等) 的方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞，其與基因組的整合則依靠抗性篩選和PCR-測序來進行鑒定。而藍細(xì)菌細(xì)胞的染色體往往具有多倍性 (即單個細(xì)胞中含有多條相同染色體)[70-71]，在通過抗性篩選和PCR初篩，獲得基因組上攜帶有正確整合元件的轉(zhuǎn)化子后，通常還需要進行一系列的傳代，以提高整合程度，獲得基因型純合的突變藻株。上述過程效率低、耗時長，難以滿足藍細(xì)菌高效遺傳操作，特別是基因組多靶點改造的需要。

以CRISPR-CAS9為代表的新型基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)為藍細(xì)菌代謝工程領(lǐng)域提供了新的精確、高效的遺傳操作工具[72]。現(xiàn)在基于CRISPR系統(tǒng)的藍細(xì)菌基因組編輯技術(shù)主要可以分為基因沉默和基因敲除兩類。2016年Yao等[73]證明應(yīng)用核酸酶活性缺失的Ⅱ型CRISPR- CAS9系統(tǒng) (來源于釀膿鏈球菌) 可以在聚球藻PCC7942中對目標(biāo)基因的表達進行抑制，并成功實現(xiàn)了對4個醛還原酶和醛脫氫酶基因表達的同時沉默 (抑制效率50%?95%)。Gordon等利用相同系統(tǒng)和類似策略在聚球藻PCC7002中也實現(xiàn)了目標(biāo)基因的表達調(diào)控，并應(yīng)用于代謝工程改造[74]。華盛頓大學(xué)Pakrasi教授的研究團隊開展了利用CRISPR系統(tǒng)直接進行基因敲除的研究，在聚球藻UTEX2973中通過CAS9蛋白的瞬時表達和另一種核酸酶Cpf1基因的穩(wěn)定表達分別實現(xiàn)了目標(biāo)基因的無痕敲除和外源基因的整合[75-76]，其中Cpf1系統(tǒng)在集胞藻PCC6803和魚腥藻PCC7120中也證實有效。而針對聚球藻PCC7942，Li等證明CRISPR-CAS9系統(tǒng)可以在基因組的靶點上引發(fā)雙鏈斷裂，進而通過雙鏈斷裂修復(fù)機制極大地提高了外源DNA同源重組的效率、并降低了對同源臂長度的要求[77]?，F(xiàn)階段，基于CRSIPR技術(shù)的各種藍細(xì)菌基因組編輯和代謝調(diào)控工具正在不斷涌現(xiàn)，對代謝背景中多個靶點的同時改造也成為可能，結(jié)合3.4部分中所述的改造靶點預(yù)測技術(shù)，無疑將在未來為藍細(xì)菌乙醇光合合成能力的提升提供新的動力。

4 藍細(xì)菌底盤細(xì)胞對乙醇脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)機制解析

對大多數(shù)藍細(xì)菌，尤其是應(yīng)用于代謝工程改造的幾種模式藻株而言，乙醇并不是其主要的天然代謝產(chǎn)物，乙醇在胞內(nèi)檢測不到存在或者含量極低，因此其對細(xì)胞生理和代謝的平衡與穩(wěn)定影響非常微弱。而引入了Pdc-AdhII途徑的工程藻株中，碳流、能量以及還原力的分配會發(fā)生顯著變化，乙醇甚至成為主要代謝產(chǎn)物，乙醇合成可以占到工程藻株固碳量的50%以 上[34,38]，這就意味著工程藻株從光合作用到細(xì)胞生長的各種生理和代謝活動都可能受到顯著影響；另一方面，當(dāng)乙醇合成能力進一步加強，乙醇含量在培養(yǎng)體系中達到1%甚至1.5%時，細(xì)胞生理和代謝活動會受到脅迫，從細(xì)胞結(jié)構(gòu)到蛋白功能等各個層面都會受到擾動和抑制[78-79]，進而影響工程藻株生長和生產(chǎn)的性能。而現(xiàn)階段，藍細(xì)菌乙醇光合工程藻株的最高產(chǎn)量可達到 8 g/L左右，接近于乙醇1%的脅迫臨界濃度。因此，理解藍細(xì)菌對乙醇脅迫、乙醇合成的響應(yīng)與適應(yīng)機制，挖掘乙醇耐受性改造靶點，對于藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠的繼續(xù)發(fā)展和優(yōu)化有著重要意義。

4.1 藍細(xì)菌對外源添加乙醇脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)機制

天津大學(xué)合成微生物學(xué)實驗室以集胞藻PCC6803為對象，以藍細(xì)菌對外源添加的高濃度乙醇的響應(yīng)和適應(yīng)機制為切入點，在轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等各個層面上進行了較為系統(tǒng)的解析。2012年，研究人員以1.25%、1.5%和2%三種濃度的乙醇對集胞藻PCC6803細(xì)胞進行脅迫處理，進而通過iTRAQ LC-MS/MS技術(shù)分析到了細(xì)胞中1 509個蛋白表達情況的變化，其中乙醇脅迫處理24 h后有135個蛋白的表達有了顯著變化 (以1.5倍差異為閾值)，而48 h后則達到293個。進一步的分析顯示，面臨高濃度外源乙醇時集胞藻PCC6803采取了啟動壓力應(yīng)激系統(tǒng) (General stress response)、調(diào)整細(xì)胞被膜組分與結(jié)構(gòu)、加強轉(zhuǎn)運蛋白合成等多種策略來應(yīng)對脅迫；此外，乙醇脅迫還誘導(dǎo)了PCC6803中與光合作用相關(guān)的多種蛋白的上調(diào)表達，同時胞內(nèi)葉綠素a含量也有所提高[80]，意味著細(xì)胞可能需要通過加強光合作用為脅迫應(yīng)激提供更多的物質(zhì)和能量。上述蛋白質(zhì)組分析的結(jié)果在后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組分析中得到了進一步的驗證；此外，轉(zhuǎn)錄組分析還進一步發(fā)現(xiàn)，PCC6803會通過強化PHB合成和乙二醛途徑來緩解乙醇毒性[81]。

針對全局性分析的結(jié)果，研究人員又結(jié)合基因敲除和回補策略，對其中轉(zhuǎn)運蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子系統(tǒng)的響應(yīng)進行針對性分析。2014年，Song等證實轉(zhuǎn)錄因子編碼基因直接與集胞藻PCC6803的乙醇耐受能力相關(guān)，該基因的缺陷型藻株在1.5%濃度的乙醇脅迫下，生長受到顯著抑制；而相應(yīng)的蛋白質(zhì)組分析顯示，該基因的缺失造成了54個蛋白表達的下調(diào)和87個基因的表達上調(diào)。該基因編碼蛋白可以直接與 1個16.6 kDa的小熱激蛋白 ()、1個鈉離子依賴型的碳酸氫根轉(zhuǎn)運蛋白 (，) 以及1個二氧化碳濃縮機制相關(guān)蛋白CcmK () 編碼基因的上游序列直接結(jié)合[82]。2015年，Zhu等對集胞藻PCC6803轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)對乙醇脅迫的響應(yīng)進行了更大范圍的研究，系統(tǒng)敲除了集胞藻PCC6803中34個假定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，在乙醇脅迫條件下比較其與野生型的生長差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)、和的3個基因的敲除突變株與野生型相比生長變差，而代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)上述3種轉(zhuǎn)錄因子的缺失在代謝物和代謝模塊層面引發(fā)的擾動存在顯著的重疊現(xiàn)象，意味著其調(diào)控機制存在一定的交互性[83]。2015年Zhang等對PCC6803中轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)與乙醇耐受性的相關(guān)性進行了系統(tǒng)研究，通過對58個轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的敲除和相應(yīng)的乙醇耐受性分析發(fā)現(xiàn)，基因的突變體對1.5%的乙醇脅迫敏感，生長受到明顯抑制。通過對缺失突變株代謝組學(xué)層面的分析發(fā)現(xiàn)，集胞藻PCC6803中色氨酸合成、不飽和脂肪酸合成以及次級代謝產(chǎn)物合成等代謝模塊，以及乙酰CoA、ADP-葡萄糖、ATP、ADP、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、核糖-5-磷酸等代謝物與細(xì)胞的乙醇耐受性密切相關(guān)[84]。上述研究針對集胞藻PCC6803對外源添加的乙醇脅迫的相應(yīng)機制，系統(tǒng)采用了基因敲除-表型分析、轉(zhuǎn)錄組、代謝組和蛋白質(zhì)組層面的分析手段，對乙醇的脅迫機制和細(xì)胞響應(yīng)策略獲得了全面的認(rèn)知，也為進一步采用代謝工程策略改造細(xì)胞本身的乙醇耐受性提供了豐富的 靶點。

4.2 藍細(xì)菌乙醇光合工程藻株對內(nèi)源性乙醇合成的響應(yīng)與適應(yīng)機制

德國弗萊堡大學(xué)的研究人員和荷蘭阿姆斯特丹大學(xué)的研究人員從另一種角度進行了研究，有針對性地解析藍細(xì)菌乙醇光合合成工程藻株對內(nèi)源性合成的乙醇的響應(yīng)機制。2014年Dienst等將PpetJ-pdc-slr1192途徑通過穿梭載體導(dǎo)入PCC6803，獲得了乙醇高產(chǎn)藻株，18 d內(nèi)可以合成4.7 g/L的乙醇，在整個培養(yǎng)過程中選取了4個時間點，對乙醇合成株和野生型藻株在生理和轉(zhuǎn)錄水平上的差異進行了分析。很有意思的是，在乙醇合成藻株中，在轉(zhuǎn)錄水平上藻藍蛋白β亞基編碼基因CpcB和兩組鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白的表達也都持續(xù)降低，而表型水平上整個過程中葉綠素和藻藍蛋白含量顯著降 低[48]，這一點與此前Qiao等[80]在外源乙醇脅迫處理時觀察到的葉綠素含量升高的現(xiàn)象恰恰相反。2015年Borirak等在集胞藻PCC6803中，采用PpsbA2-pdc-adhII構(gòu)建乙醇合成藻株，進而通過蛋白組學(xué)定量分析發(fā)現(xiàn)工程藻株中有77種蛋白上調(diào)，64種蛋白下調(diào)。功能聚類分析表明，乙醇合成工程藻株中與二氧化碳濃縮、固定相關(guān)的很多蛋白，如卡爾文循環(huán)關(guān)鍵蛋白核酮糖1,5-二磷酸脫羧酶和碳濃縮機制核心功能蛋白CcmK1等，其含量普遍上調(diào)，意味著乙醇合成導(dǎo)致的碳流分散促進了工程細(xì)胞加快碳的固定以維持生長和其他生理代謝所需 (工程藻株中碳源到乙醇的流向分配比高達65%)；與Dienst等結(jié)果類似的是發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成機器組分以及藻膽體組分 (CpcA、CpcB、CpcC1、CpcC2、CpcG2) 含量受到抑制和下調(diào)；此外乙醇的合成還在胞內(nèi)引發(fā)了氧化應(yīng)激反應(yīng)(GshB含量升高)。

值得注意的是，乙醇外源添加或內(nèi)源合成都會影響集胞藻PCC6803細(xì)胞中節(jié)律性蛋白的表達。在Borirak等構(gòu)建的工程藻中節(jié)律性蛋白 (Circadian clock protein，生物鐘蛋白，使藍細(xì)菌適應(yīng)晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)功能需要KaiA、KaiB和KaiC三種組分來完成) KaiA和KaiC顯著上調(diào)，而此前Qiao等的蛋白組分析中發(fā)現(xiàn)外源乙醇脅迫會引發(fā)KaiB的表達提高，Wang等的轉(zhuǎn)錄組分析則發(fā)現(xiàn)KaiC的上調(diào)。上述研究表明，無論是內(nèi)源產(chǎn)生的乙醇還是外源添加的乙醇，都會引發(fā)藍細(xì)菌Kai系統(tǒng)組分的表達變化。在現(xiàn)階段藍細(xì)菌乙醇光合工程藻株的實驗室培養(yǎng)中普遍采用了持續(xù)光照條件，而未來推向規(guī)?；囵B(yǎng)時在戶外晝夜交替條件下，該系統(tǒng)的擾動所造成的潛在影響則值得引起重視[85]。

上述的響應(yīng)機制在圖2中進行了具體展示和歸納。

圖2 集胞藻PCC6803對乙醇的動態(tài)響應(yīng)機制示意圖

5 展望

乙醇是最早報道的、通過代謝工程手段改造藍細(xì)菌實現(xiàn)光合生物合成的化學(xué)品，也是最有代表性的藍細(xì)菌光合化學(xué)品。到目前為止，藍細(xì)菌乙醇合成技術(shù)還處于初級階段，乙醇產(chǎn)量較低 (小于10 g/L)，合成強度低(不超過 0.5 g/(L·d))，相比較于已經(jīng)成熟的釀酒酵母乙醇合成等生物技術(shù)體系，其距離規(guī)?；囵B(yǎng)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還有很長的路要走。但是，如上文中已經(jīng)展示的，蓬勃發(fā)展和廣泛應(yīng)用的系統(tǒng)生物技術(shù)體系已經(jīng)對藍細(xì)菌對乙醇的響應(yīng)和適應(yīng)機制進行了全面、立體的詮釋；各種層面的代謝網(wǎng)絡(luò)模型對潛在的藻株改造靶點和改造策略進行了預(yù)測和設(shè)計；以CRISPR-CAS等技術(shù)為代表的先進、高效的遺傳操作體系的發(fā)展將使得多靶點、多層次的精細(xì)改造和途徑調(diào)控成為可能，在可見的未來，藍細(xì)菌乙醇光合藻株的性能有望迎來新的突破。同時，發(fā)展高效的藍細(xì)菌乙醇光合藻株對其他化學(xué)品光合合成平臺的開發(fā)具有很好的示范與啟示意義。藍細(xì)菌乙醇光合藻株核心代謝途徑簡單、清楚，藻株培養(yǎng)和產(chǎn)物分析技術(shù)成熟、便捷，各種代謝工程和合成生物學(xué)策略可以很快實施和驗證，從而為其他高值化學(xué)品的光合合成的實現(xiàn)和優(yōu)化提供概念和方向性的指引。

光合固碳效率的提升將成為其中最具吸引力的發(fā)展方向。光合作用是藍細(xì)菌細(xì)胞生長和化學(xué)品合成的基礎(chǔ)，光合固碳效率從根本上決定著藍細(xì)菌化學(xué)品光合平臺的效能和潛力。Atsumi等的研究證實在聚球藻PCC7942中過量表達卡爾文循環(huán)關(guān)鍵蛋白1.5-二磷酸核酮糖羧化酶 (Rubisco)，可以提高工程藻株中異丁醛的產(chǎn)量[22]，表明通過改善光合作用效率來提高代謝物合成能力的策略是可行、有效的。在未來，通過系統(tǒng)采用改造Rubisco等關(guān)鍵蛋白[86-87]、強化碳濃縮機制 (Carbon concentrating mechanism)[88]以及調(diào)控光呼吸系統(tǒng)[89]等策略，有望促使藍細(xì)菌工程藻株的光合效率得到進一步提高。中國科學(xué)院微生物研究所李寅研究員團隊最近發(fā)現(xiàn)，通過引入新的NADPH消耗途徑可以有效促進光合固碳效率，加快工程細(xì)胞生長速度[90]，表明在代謝途徑設(shè)計的過程中將藍細(xì)菌光合固碳系統(tǒng)的特點納入考慮，有望實現(xiàn)平臺生長性能與合成性能的協(xié)同提高。對于藍細(xì)菌乙醇光合細(xì)胞工廠而言，此前的主要設(shè)計和改造策略集中于胞內(nèi)固有碳流的重新分配上，而對于從源頭上強化光合固碳、為乙醇合成提供更強的物質(zhì)-能量動力將是未來進一步發(fā)展的必然選擇。隨著對藍細(xì)菌光合固碳、中心代謝以及生理功能等生理和代謝機制認(rèn)識的不斷加深，以及合成生物學(xué)和代謝工程手段的豐富和完善，更為高效、穩(wěn)定的藍細(xì)菌光合平臺必將成功構(gòu)建，結(jié)合乙醇合成途徑的優(yōu)化和代謝互作背景的適配調(diào)控，藍細(xì)菌平臺的乙醇光合合成能力將有望迎來質(zhì)的飛躍。

[1] Kennes D, Abubackar HN, Diaz M, et al. Bioethanol production from biomass: carbohydrate vs syngas fermentation. J Chem Technol Biotechnol, 2016, 91(2): 304–317.

[2] Keasling JD, Chou H. Metabolic engineering delivers next-generation biofuels. Nat Biotechnol, 2008, 26(3): 298–299.

[3] Thangavelu SK, Ahmed A, Ani FN. Review on bioethanol as alternative fuel for spark ignition engines. Renew SustEnerg Rev, 2016, 56: 820–835.

[4] Tabah B, Pulidindi IN, Chitturi VR, et al. Utilization of solar energy for continuous bioethanol production for energy applications. RSC Adv, 2016, 6(29): 24203–24209.

[5] Agarwal AK. Biofuels (alcohols and biodiesel) applications as fuels for internal combustion engines. Prog Energ Combust Sci, 2007, 33(3): 233–271.

[6] Weber C, Farwick A, Benisch F, et al. Trends and challenges in the microbial production of lignocellulosic bioalcohol fuels. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87(4): 1303–1315.

[7] Rude MA, Schirmer A. New microbial fuels: a biotech perspective. Curr Opin Microbiol, 2009, 12(3): 274–281.

[8] Himmel ME, Ding SY, Johnson DK, et al. Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production. Science, 2007, 315(5813): 804–807.

[9] Ji SQ, Wang B, Lu M, et al. Direct bioconversion of brown algae into ethanol by thermophilic bacterium. Biotechnol Biofuels, 2016, 9: 81.

[10] Murphy JD, Thamsiriroj T. What will fuel transport systems of the future? Mater Today, 2011, 14(11): 518–524.

[11] Xia A, Jacob A, Tabassum MR, et al. Production of hydrogen, ethanol and volatile fatty acids through co-fermentation of macro-and micro-algae. Bioresour Technol, 2016, 205: 118–125.

[12] Zhou J, Li Y. Engineering cyanobacteria for fuels and chemicals production. Protein Cell, 2010, 1(3): 207–210.

[13] Lu XF. A perspective: photosynthetic production of fatty acid-based biofuels in genetically engineered cyanobacteria. Biotechnol Adv, 2010, 28(6): 742–746.

[14] Melis A. Solar energy conversion efficiencies in photosynthesis: minimizing the chlorophyll antennae to maximize efficiency. Plant Sci, 2009, 177(4): 272–280.

[15] Zhou J, Zhu TC, Cai Z, et al. From cyanochemicals to cyanofactories: a review and perspective. Microb Cell Fact, 2016, 15: 2.

[16] McNeely K, Xu Y, Bennette N, et al. Redirecting reductant flux into hydrogen production via metabolic engineering of fermentative carbon metabolism in a cyanobacterium. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(15): 5032–5038.

[17] Deng MD, Coleman JR. Ethanol synthesis by genetic engineering in cyanobacteria. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(2): 523–528.

[18] Lan EI, Liao JC. ATP drives direct photosynthetic production of 1-butanol in cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(16): 6018–6023.

[19] Zhou J, Zhang HF, Zhang YP, et al. Designing and creating a modularized synthetic pathway in cyanobacteriumenables production of acetone from carbon dioxide. Metab Eng, 2012, 14(4): 394–400.

[20] Liu XY, Sheng J, Curtiss R III. Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(17): 6899–6904.

[21] Angermayr SA, Paszota M, Hellingwerf KJ. Engineering a cyanobacterial cell factory for production of lactic acid. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(19): 7098–7106.

[22] Atsumi S, Higashide W, Liao JC. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat Biotechnol, 2009, 27(12): 1177–1180.

[23] Gao X, Gao F, Liu D, et al. Engineering the methylerythritol phosphate pathway in cyanobacteria for photosynthetic isoprene production from CO2. Energ Environ Sci, 2016, 9(4): 1400–1411.

[24] Wang WH, Liu XF, Lu XF. Engineering cyanobacteria to improve photosynthetic production of alka(e)nes. Biotechnol Biofuels, 2013, 6(1): 69.

[25] Ducat DC, Avelar-Rivas JA, Way JC, et al. Rerouting carbon flux to enhance photosynthetic productivity. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(8): 2660–2668.

[26] Du W, Liang FY, Duan YK, et al. Exploring the photosynthetic production capacity of sucrose by cyanobacteria. Metab Eng, 2013, 19: 17–25.

[27] Heyer H, Krumbein WE. Excretion of fermentation products in dark and anaerobically incubated cyanobacteria. Arch Microbiol, 1991, 155(3): 284–287.

[28] Carrieri D, Momot D, Brasg IA, et al. Boosting autofermentation rates and product yields with sodium stress cycling: application to production of renewable fuels by cyanobacteria. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(19): 6455–6462.

[29] He MX, Wu B, Qin H, et al.: a novel platform for future biorefineries. Biotechnol Biofuels, 2014, 7: 101.

[30] Yomano LP, York SW, Zhou S, et al. Re-engineeringfor ethanol production. Biotechnol Lett, 2008, 30(12): 2097–2103.

[31] Nikel PI, De Lorenzo V. Robustness ofKT2440 as a host for ethanol biosynthesis. New Biotechnol, 2014, 31(6): 562–571.

[32] Raj KC, Talarico LA, Ingram LO, et al. Cloning and characterization of the Zymobacter palmae pyruvate decarboxylase gene (pdc) and comparison to bacterial homologues. Appl Environ Microbiol, 2002, 68(6): 2869–2876.

[33] Coleman JR, Duehring U, Enke H, et al, Genetically modified photoautotrophic, host cell, useful to produce ethanol, comprises genetic modification changing enzymatic activity or affinity of endogenous host cell enzyme and genetic modification comprising overexpressed enzyme: WO, 2009098089, 2009-08-13.

[34] Dexter J, Armshaw P, Sheahan C, et al. The state of autotrophic ethanol production in cyanobacteria. J Appl Microbiol, 2015, 119(1): 11–24.

[35] Stevenson BJ, Liu JW, Ollis DL. Directed evolution of yeast pyruvate decarboxylase 1 for attenuated regulation and increased stability. Biochemistry, 2008, 47(9): 3013–3025.

[36] Sun HW, Plapp BV. Progressive sequence alignment and molecular evolution of the Zn-containing alcohol dehydrogenase family. J Mol Evol, 1992, 34(6): 522–535.

[37] Dexter J, Fu PC. Metabolic engineering of cyanobacteria for ethanol production. Energy Environ Sci, 2009, 2(8): 857–864.

[38] Gao ZX, Zhao H, Li ZM, et al. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energy Environ Sci, 2012, 5(12): 9857–9865.

[39] Vidal R, López-Maury L, Guerrero MG, et al. Characterization of an alcohol dehydrogenase from the cyanobacteriumsp. strain PCC 6803 that responds to environmental stress conditions via the Hik34-Rre1 two-component system. J Bacteriol, 2009, 191(13): 4383–4391.

[40] Takahashi H, Uchimiya H, Hihara Y. Difference in metabolite levels between photoautotrophic and photomixotrophic cultures ofsp. PCC 6803 examined by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. J Exp Bot, 2008, 59(11): 3009–3018.

[41] Luan GD, Qi YJ, Wang M, et al. Combinatory strategy for characterizing and understanding the ethanol synthesis pathway in cyanobacteria cell factories. Biotechnol Biofuels, 2015, 8: 184.

[42] Waterbury JB, Watson W, Guillard RRL, et al. Widespread occurrence of a unicellular, marine, planktonic, cyanobacterium. Nature, 1979, 277(5694): 293–294.

[43] Oliver JWK, Machado IMP, Yoneda H, et al. Cyanobacterial conversion of carbon dioxide to 2,3-butanediol. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(4): 1249–1254.

[44] Kusakabe T, Tatsuke T, Tsuruno K, et al. Engineering a synthetic pathway in cyanobacteria for isopropanol production directly from carbon dioxide and light. Metab Eng, 2013, 20: 101–108.

[45] Hirokawa Y, Maki Y, Tatsuke T, et al. Cyanobacterial production of 1,3-propanediol directly from carbon dioxide using a synthetic metabolic pathway. Metab Eng, 2016, 34: 97–103.

[46] Chwa JW, Kim WJ, Sim SJ, et al. Engineering of a modular and synthetic phosphoketolase pathway for photosynthetic production of acetone from CO2inPCC 7942 under light and aerobic condition. Plant Biotechnol J, 2016, 14(8): 1768–1776.

[47] Griese M, Lange C, Soppa J. Ploidy in cyanobacteria. FEMS Microbiol Lett, 2011, 323(2): 124–131.

[48] Dienst D, Georg J, Abts T, et al. Transcriptomic response to prolonged ethanol production in the cyanobacteriumsp. PCC6803. Biotechnol Biofuels, 2014, 7: 21.

[49] Ludwig M, Bryant DA. Acclimation of the global transcriptome of the cyanobacteriumsp. strain PCC 7002 to nutrient limitations and different nitrogen sources. Front Microbiol, 2012, 3: 145.

[50] Yu JJ, Liberton M, Cliften PF, et al.UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Sci Rep, 2015, 5: 8132.

[51] Xu Y, Alvey RM, Byrne PO, et al. Expression of genes in cyanobacteria: adaptation of endogenous plasmids as platforms for high-level gene expression insp. PCC 7002. Methods Mol Biol, 2011, 684: 273–293.

[52] Akiyama H, Kanai S, Hirano M, et al. A novel plasmid recombination mechanism of the marine cyanobacteriumsp. PCC7002. DNA Res, 1998, 5(6): 327–334.

[53] Reppas NB. Metabolic switch: WO, 2012/071547, 2012-05-31.

[54] Green BD, Reppas NB, Robertson DE. Ethanol production in microorganisms: US, 8048666 2011-11-01.

[55] Piven I, Friedrich A, Dühring U, et al.sp. for production of compounds: US, 9157101. 2015-10-13.

[56] Song K, Tan XM, Liang YJ, et al. The potential ofUTEX 2973 for sugar feedstock production. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(18): 7865–7875.

[57] Angermayr SA, Hellingwerf KJ. On the use of metabolic control analysis in the optimization of cyanobacterial biosolar cell factories. J Phys Chem B, 2013, 117(38): 11169–11175.

[58] Angermayr SA, Van Der Woude AD, Correddu D, et al. Exploring metabolic engineering design principles for the photosynthetic production of lactic acid bysp. PCC6803. Biotechnol Biofuels, 2014, 7: 99.

[59] Van Der Woude AD, Angermayr SA, Veetil VP, et al. Carbon sink removal: increased photosynthetic production of lactic acid bysp. PCC6803 in a glycogen storage mutant. J Biotechnol, 2014, 184: 100–102.

[60] Gründel M, Scheunemann R, Lockau W, et al. Impaired glycogen synthesis causes metabolic overflow reactions and affects stress responses in the cyanobacteriumsp. PCC 6803. Microbiol, 2012, 158: 3032–3043.

[61] Suzuki E, Ohkawa H, Moriya K, et al. Carbohydrate metabolism in mutants of the cyanobacteriumPCC 7942 defective in glycogen synthesis. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(10): 3153–3159.

[62] Davies FK, Work VH, Beliaev AS, et al. Engineering limonene and bisabolene production in wild type and a glycogen-deficient mutant ofsp. PCC 7002. Front Bioeng Biotechnol, 2014, 2: 21.

[63] Choi YN, Park JM. Enhancing biomass and ethanol production by increasing NADPH production insp. PCC 6803. Bioresour Technol, 2016, 213: 54–57.

[64] Meng HK, Liu P, Sun HB, et al. Engineering a d-lactate dehydrogenase that can super-efficiently utilize NADPH and NADH as cofactors. Sci Rep, 2016, 6: 24887.

[65] Sengupta T, Bhushan M, Wangikar PP. Metabolic modeling for multi-objective optimization of ethanol production in amutant. Photosynth Res, 2013, 118(1/2): 155–165.

[66] Erdrich P, Knoop H, Steuer R, et al. Cyanobacterial biofuels: new insights and strain design strategies revealed by computational modeling. Microb Cell Fact, 2014, 13(1): 128.

[67] Knoop H, Steuer R. A computational analysis of stoichiometric constraints and trade-offs in cyanobacterial biofuel production. Front Bioeng Biotechnol, 2015, 3: 47.

[68] Aoyama K, Uemura I, Miyake J, et al. Fermentative metabolism to produce hydrogen gas and organic compounds in a cyanobacterium,. J Ferment Bioeng, 1997, 83(1): 17–20.

[69] Yoshikawa K, Aikawa S, Kojima Y, et al. Construction of a genome-scale metabolic model ofNIES-39 and metabolic design for cyanobacterial bioproduction. PLoS ONE, 2015, 10(12): e0144430.

[70] Simon R. DNA content of heterocysts and spores of the filamentous cyanobacterium Anabaena variabilis. FEMS Microbiol Lett, 1980, 8: 241-245.

[71] JainI H, Vijayan V, O’Shea EK. Spatial ordering of chromosomes enhances the fidelity of chromosome partitioning in cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(34): 13638–13643.

[72] Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013, 339(6121): 819–823.

[73] Yao L, Cengic I, Anfelt J, et al. Multiple gene repression in cyanobacteria using CRISPRi. ACS Synth Biol, 2016, 5(3): 207–212.

[74] Gordon GC, Korosh TC, Cameron JC, et al. CRISPR interference as a titratable,regulatory tool for metabolic engineering in the cyanobacteriumsp. strain PCC 7002. Metab Eng, 2016, 38: 170–179.

[75] Wendt KE, Ungerer J, Cobb RE, et al. CRISPR/Cas9 mediated targeted mutagenesis of the fast growing cyanobacteriumUTEX 2973. Microbial Cell Factories, 2016, 15: 115.

[76] Ungerer J, Pakrasi HB. Cpf1 is aversatile tool for CRISPR genome editing across diverse species of cyanobacteria. Sci Rep, 2016, 6: 39681.

[77] Li H, Shen CR, Huang CH, et al. CRISPR-Cas9 for the genome engineering of cyanobacteria and succinate production. Metab Eng, 2016, 38: 293–302.

[78] Ding JM, Huang XW, Zhang LM, et al. Tolerance and stress response to ethanol in the yeast. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 85(2): 253–263.

[79] Chen TJ, Wang JQ, Yang R, et al. Laboratory-evolved mutants of an exogenous global regulator, IrrE from, enhance stress tolerances of. PloS ONE, 2011, 6(1): e16228.

[80] Qiao JJ, Wang JX, Chen L, et al. Quantitative iTRAQ LC-MS/MS proteomics reveals metabolic responses to biofuel ethanol in cyanobacterialsp. PCC 6803. J Proteome Res, 2012, 11(11): 5286–5300.

[81] Wang JX, Chen L, Huang SQ, et al. RNA-seq based identification and mutant validation of gene targets related to ethanol resistance in cyanobacterialsp. PCC 6803. Biotechnol Biofuels, 2012, 5: 89.

[82] Song ZD, Chen L, Wang JX, et al. A transcriptional regulator Sll0794 regulates tolerance to biofuel ethanol in photosyntheticsp. PCC 6803. Mol Cell Proteomics, 2014, 13(12): 3519–3532.

[83] Zhu Y, Pei GS, Niu XF, et al. Metabolomic analysis reveals functional overlapping of three signal transduction proteins in regulating ethanol tolerance in cyanobacteriumsp. PCC 6803. Mol Biosyst, 2015, 11(3): 770–782.

[84] Zhang YN, Niu XF, Shi ML, et al. Identification of a transporter Slr0982 involved in ethanol tolerance in cyanobacteriumsp. PCC 6803. Front Microbiol, 2015, 6: 487.

[85] Borirak O, De Koning LJ, Van Der Woude AD, et al. Quantitative proteomics analysis of an ethanol-and a lactate-producing mutant strain ofsp. PCC6803. Biotechnol Biofuels, 2015, 8: 111.

[86] Cai Z, Liu GX, Zhang JL, et al. Development of an activity-directed selection system enabled significant improvement of the carboxylation efficiency of Rubisco. Protein Cell, 2014, 5(7): 552–562.

[87] Whitney SM, Houtz RL, Alonso H. Advancing our understanding and capacity to engineer nature's CO2-sequestering enzyme, Rubisco. Plant Physiol, 2011, 155(1): 27–35.

[88] Kamennaya NA, Ahn S, Park H, et al. Installing extra bicarbonate transporters in the cyanobacteriumsp. PCC6803 enhances biomass production. Metab Eng, 2015, 29: 76–85.

[89] Shih PM, Zarzycki J, Niyogi KK, et al. Introduction of a synthetic CO2fixing photorespiratory bypass into a cyanobacterium. J Biol Chem, 2014, 289(14): 9493–9500.

[90] Zhou J, Zhang FL, Meng HK, et al. Introducing extra NADPH consumption ability significantly increases the photosynthetic efficiency and biomass production of cyanobacteria. Metab Eng, 2016, 38: 217–227.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Cyanobacteria cell factories for ethanol photosynthetic production: development and prospect

Yunjing Qi1,2, Jialin Wang1, Guodong Luan2, Xiaoming Tan2, and Xuefeng Lü2

1 College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, Shandong, China 2 Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China

Bioethanol is one of the most promising and representative biofuel products. Photosynthetic production of ethanol using CO2and solar energy based on cyanobacteria is of great significance for research and application, due to the potential to reduce CO2emission and to provide renewable energy simultaneously. Here we review the history and updated development of cyanobacteria cell factories for ethanol photosynthetic production, the progress and problems in pathway optimization, chassis selection, and metabolic engineering strategies, and finally indicate the future development in this area.

cyanobacteria, bioethanol, metabolic engineering, cell factory, ethanol tolerance

10.13345/j.cjb.160457

November 24, 2016; Accepted: January 24, 2017

Guodong Luan. Tel: +86-532-80662711; E-mail: luangd@qibebt.ac.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31600034).

國家自然科學(xué)基金(No. 31600034)資助。