陳思行+陳發(fā)+蔡灣灣+吳燕+廖艷偉+鄧云+吳秀山+王躍群

摘 要 為研究fhl1a基因在心臟發(fā)育中的作用，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除斑馬魚(yú)fhl1a基因.在斑馬魚(yú)fhl1a基因的三號(hào)外顯子處選取打靶位點(diǎn)，構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體.將體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分別顯微注射到斑馬魚(yú)單細(xì)胞期的受精卵中以期實(shí)現(xiàn)對(duì)目的靶基因fhl1a的敲除.隨后收集部分72 h胚胎進(jìn)行PCR檢測(cè)和產(chǎn)物直接測(cè)序，確定有無(wú)突變.為進(jìn)一步驗(yàn)證突變是否可穩(wěn)定遺傳，選擇具有敲除了的F0與野生型斑馬魚(yú)進(jìn)行外交，對(duì)獲得的F1進(jìn)行逐一剪尾，提取DNA進(jìn)行PCR和測(cè)序分析.結(jié)果顯示F1獲得了不同程度的插入、缺失等突變類型.研究結(jié)果證明所設(shè)計(jì)的fhl1a基因CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)能在斑馬魚(yú)體內(nèi)有效地形成基因突變，該突變能穩(wěn)定地遺傳到下一代個(gè)體，這為進(jìn)一步研究fhl1a基因在心臟發(fā)育中的具體調(diào)控機(jī)制打下了基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞 CRISPR/Cas9；fhl1a基因；斑馬魚(yú)；敲除

中圖分類號(hào) Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2017）03-0021-06

The Validation Study of Zebrafish Fhl1a Gene Knockout by CRISPR/Cas9 System

CHEN Si-xing， CHEN Fa， CAI Wan-wan， WU Yan， LIAO Yan-wei， DENG Yun， WU Xiu-shan， WANG Yue-qun*

（The Center for Heart Development， Key lab of MOE for Department Biology and Protein Chemistry， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

Abstract To study the function of the fhl1a gene in heart development， we generated the fhl1a gene knockout zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. At first， we constructed the sgRNA expression vector targeting zebrafish fhl1a gene at the third exon. After in vitro transcription of sgRNA and Cas9 vectors， we co-injected them into single-cell fertilized zebrafish eggs to generate zebrafish with the targeted mutation. After 72 h of injection， embryos were collected， the genome DNA was extracted， PCR and sequencing were then performed. To further verify the stability of genetic mutations， we selected mutated founder to outcross with wild type zebrafish. The first generation （F1） was then analyzed by PCR and sequencing of the caudal fin. Our results confirmed that insertion and deletion mutations were able to be introduced into F1 using this method. Our study demonstrated that CRISPR/Cas9-induced fhl1a gene mutations can be successfully transmitted through the gremline， which lays the foundation for future studies on gene fhl1as specific regulatory mechanism during heart development.

Key words CRISPR/Cas9；fhl1a gene；zebrafish；knockout

斑馬魚(yú)因其成年魚(yú)個(gè)體小、易于飼養(yǎng)、發(fā)育快速、性成熟期短、繁殖力強(qiáng)、體外受精、胚胎在體外發(fā)育并且透明等特點(diǎn)成為研究生物發(fā)育過(guò)程非常受青睞的模式生物[1-2].

FHL家族因含有四個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域而得名.它們通過(guò)LIM結(jié)構(gòu)域與其他蛋白質(zhì)相互作用，在細(xì)胞增殖、腫瘤、骨骼肌疾病以及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，但其是否調(diào)控心臟的發(fā)育還有待研究.fhl1a （four and a half LIM domains 1a）基因編碼產(chǎn)物是斑馬魚(yú)心臟組織cDNA中的一個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域蛋白，與人FHL1第五亞型高度同源[3-5]，因此建立fhl1a基因敲除斑馬魚(yú)，對(duì)于研究fhl1a基因與心臟發(fā)育的關(guān)系具有重要意義.

CRISPR/Cas9 是最近發(fā)展起來(lái)的一種新型基因定向編輯技術(shù)[6-10]，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌的一套免疫系統(tǒng)，依據(jù)基因的多樣性，CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為1，2和3 型，其中2型來(lái)源的Cas9蛋白表現(xiàn)出非常強(qiáng)的DNA裂解活性，可僅在一種非編碼RNA（sgRNA）介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)定向基因打靶[11-14].本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)斑馬魚(yú)的fhl1a基因進(jìn)行敲除，從而獲得能穩(wěn)定遺傳的fhl1a敲除個(gè)體.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 AB品系斑馬魚(yú)購(gòu)于武漢水生所，飼養(yǎng)在湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育中心自動(dòng)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，光暗周期比為14 h∶10 h.取健康、性成熟的斑馬魚(yú)，于飼養(yǎng)系統(tǒng)關(guān)燈前將雌雄按1∶1的比例放入產(chǎn)卵缸內(nèi).次日給光后拿掉擋板，讓其完成產(chǎn)卵與受精.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒 gRNA 骨架載體為p42250；Cas9的質(zhì)粒為PH-Cas9.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑 T4 DNA 連接酶和10 kb Marker購(gòu)自TaKaRa公司；BsaⅠ及XbaⅠ 內(nèi)切酶購(gòu)自Promega 公司； 氨芐青霉素（ ampicilin） 及寡核苷酸（oligo）購(gòu)自上海生工公司； 瓊脂糖購(gòu)自BBI有限公司； PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司； Gel Extraction kit 和Plasmid Mini Kit 購(gòu)自O(shè)mega公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì) 用Esembl（http：//www.ensembl.org/index.html）網(wǎng)站獲得斑馬魚(yú)目標(biāo)基因的完整序列、該基因組上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄本、編碼序列、編碼蛋白、功能域和結(jié)構(gòu)域等信息；用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站對(duì)目的基因的信息進(jìn)行核實(shí)與補(bǔ)充.CRISPR/Cas9系統(tǒng)中g(shù)RNA靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)需要遵循如下原則：靶位點(diǎn)處以18～20個(gè)堿基為最佳；PAM區(qū)其序列必須嚴(yán)格要求為NGG（N可以為任意堿基）；所選靶位點(diǎn)位置一定要在該基因編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)部或之前的位置所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，或是盡量靠前的位置，一般來(lái)講，靶位點(diǎn)要在該基因CDS區(qū)前2/3區(qū)域的外顯子中，起始密碼子之后，同時(shí)注意避免首個(gè)起始密碼子下游還存在其他擁有相同讀碼框的起始密碼子.如果該基因編碼多種蛋白，所選靶位點(diǎn)應(yīng)盡量能同時(shí)破壞其所有編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域.另外，靶位點(diǎn)也可選在外顯子和內(nèi)含子交界處，也可能破壞基因的剪接.靶位點(diǎn)處的堿基序列最好具有一定的復(fù)雜性，沒(méi)有過(guò)多的連續(xù)重復(fù).符合這些要求的靶位點(diǎn)需要在NCBI中斑馬魚(yú)全基因組上進(jìn)blast， 以確定其單一性和減少脫靶效應(yīng).其中PAM區(qū)以及靠近PAM區(qū)部分的序列較為重要，比較不同靶位點(diǎn)各種參數(shù)后擇優(yōu)使用.

1.2.2 gRNA的制備 將質(zhì)粒p42250 通過(guò)BsaⅠ進(jìn)行酶切（ 37 ℃水浴2 h）.酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收后作為PCR的模板.以公司合成的fhl1a-oligo-1，fhl1a-oligo-2引物（見(jiàn)表1）分別作為F端引物，序列（AAGCACCGACTCGGTGCACT）作為R端引物，退火溫度54 ℃，延伸時(shí)間30 s，高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后用試劑盒純化PCR產(chǎn)物作為模板，T7啟動(dòng)子進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用RNA純化試劑盒進(jìn)行純化回收，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)以及RNA濃度測(cè)定之后置于-80 ℃冰箱待用.

1.2.3 Cas9 mRNA的制備 將質(zhì)粒h-Cas9 通過(guò)XbaⅠ進(jìn)行酶切（ 37 ℃水浴2 h），使之線性化.之后用DNA純化試劑盒進(jìn)行回收溶于RNase Free 的ddH2O中作為模板，參照T7 Ultra Kit （Ambion，AM1345） 使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體外加帽轉(zhuǎn)錄.體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用RNA純化試劑盒進(jìn)行純化回收，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)以及RNA濃度測(cè)定之后置于-80 ℃冰箱待用.

1.2.4 靶位點(diǎn)有效性檢驗(yàn) 按照約300 pg Cas9 mRNA和30 pg sgRNA劑量混合注射到斑馬魚(yú)胚胎一細(xì)胞期的單細(xì)胞中，注射后的胚胎培養(yǎng)72 h后，收集部分胚胎進(jìn)行檢測(cè)，并用野生型胚胎作為對(duì)照組.收集好的胚胎經(jīng)過(guò)裂解提基因組DNA，用引物fhl1a-PCR-F（AATCCACCACTGTTCTGTT）和fh1a-PCR-R（GGAGTACAAGCATAAAGTC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后T7E1酶進(jìn)行酶切檢測(cè).

1.2.5 突變個(gè)體篩選 待有效性檢測(cè)為陽(yáng)性的那一批斑馬魚(yú)長(zhǎng)成至三個(gè)月后進(jìn)行單個(gè)個(gè)體剪尾提取基因組測(cè)序.若測(cè)序結(jié)果顯示有雙峰即表明有堿基的插入或缺失，再將測(cè)序有雙峰的樣品與PMD18-T克隆載體進(jìn)行連接，進(jìn)行轉(zhuǎn)化后挑取10個(gè)單克隆進(jìn)行PCR后再測(cè)序，根據(jù)BLAST結(jié)果判斷靶位點(diǎn)具體堿基突變情況.

2 結(jié)果

2.1 gRNA靶位點(diǎn)的確定及打靶載體的構(gòu)建

按照1.2.1所述方法擇優(yōu)選取兩個(gè)靶位點(diǎn)，在設(shè)計(jì)好的靶位點(diǎn)序列之前加上保護(hù)堿基tg和T7啟動(dòng)子，靶位點(diǎn)之后加上gRNA骨架上游序列作為正向引物，gRNA骨架的下游序列為反向引物進(jìn)行擴(kuò)增， fhl1a-PRC-F/R 為鑒定基因型所用擴(kuò)增引物序列（見(jiàn)表1、圖1A和1B）.

2.2 sgRNA活性檢測(cè)及突變個(gè)體的篩選

按照約300 pg Cas9 mRNA和30 pg sgRNA劑量混合注射到斑馬魚(yú)胚胎一細(xì)胞期的單細(xì)胞中，并對(duì)注射情況以及魚(yú)卵存活狀態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表2所示.

待注射胚胎培養(yǎng)到72 h，隨機(jī)提取部分斑馬魚(yú)全胚胎基因組，5個(gè)胚胎為一組，共6組進(jìn)行打靶位點(diǎn)的有效性檢測(cè).若此打靶位點(diǎn)有效則繼續(xù)讓斑馬魚(yú)生長(zhǎng)至兩個(gè)月大剪尾提取基因組篩選突變個(gè)體.

按照1.2.4所述方法將6組注射fhl1a-Cas9-sgRNA的72 h胚胎提取基因組標(biāo)號(hào)為1～6號(hào)以及1管野生型胚胎作為對(duì)照組，之后用T7E1酶進(jìn)行酶切，結(jié)果見(jiàn)圖2.

將注射后檢測(cè)有效的胚胎養(yǎng)至3個(gè)月齡左右即可篩選F0代陽(yáng)性個(gè)體，通過(guò)剪尾鰭方法進(jìn)行基因組鑒定（方法見(jiàn)1.2.5），其中fhl1a-Cas9-sgRNA-oligo1和fhl1a-Cas9-sgRNA-oligo1共注射后長(zhǎng)大的成魚(yú)46條，分別進(jìn)行剪尾、提基因組進(jìn)行擴(kuò)增，目的條帶大小為651 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，部分測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3.

由圖3可知，fhl1a基因F0代胚胎的測(cè)序峰圖中靶位點(diǎn)以及之后序列的峰圖出現(xiàn)套峰，說(shuō)明fhl1a基因的F0代存在突變.再將測(cè)序有雙峰的樣品與PMD18-T克隆載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后挑取10個(gè)單克隆PCR后再測(cè)序，根據(jù)BLAST結(jié)果判斷靶位點(diǎn)具體堿基突變位點(diǎn)，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4.黑框表示為靶點(diǎn)；橫線為缺失片段（-）；N為出現(xiàn)同種突變位點(diǎn)斑馬魚(yú)個(gè)體數(shù).

2.3 穩(wěn)定性遺傳的檢測(cè)

為進(jìn)一步驗(yàn)證該技術(shù)造成的缺失是否可以穩(wěn)定傳代，筆者將這些F0代陽(yáng)性嵌合體斑馬魚(yú)與野生型雄魚(yú)雜交得到F1代，并培養(yǎng)至性成熟期.對(duì)F1代成魚(yú)剪尾鰭，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，測(cè)序結(jié)果有雙峰的進(jìn)行TA克隆，將單克隆測(cè)序，結(jié)果顯示有3種突變類型的斑馬魚(yú)獲得了能穩(wěn)定遺傳的突變（見(jiàn)表3）.

綜上，本文選擇F1-fhl1a-Cas9-sgRNA的1號(hào)缺失7 bp個(gè)體，F(xiàn)1-fhl1a-Cas9-sgRNA的2號(hào)缺失8 bp個(gè)體以及F1-fhl1a-Cas9-sgRNA的3號(hào)缺失16 bp的這三種突變F1代來(lái)建立穩(wěn)定的純合子敲除品系，并用這三個(gè)fhl1a突變品系斑馬魚(yú)進(jìn)行斑馬魚(yú)fhl1a基因在心臟發(fā)育中的功能研究.

3 討論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)相較于ZFNs[15]和TALENs[16]兩種更簡(jiǎn)單方便，較短的sgRNA序列也避免了超長(zhǎng)、高度重復(fù)的TALENs編碼載體帶來(lái)的并發(fā)癥，而且CRISPRs比TALENs和ZFNs更容易操作，因?yàn)槊恳粚?duì)TALENs都需要重新合成，而用于 CRISPR的sgRNA只需要替換20個(gè)核苷酸就行，因此相較于TALENs和ZFNs具有更好的應(yīng)用前景.

本研究在sgRNA靶點(diǎn)的篩選中，選擇了位于fhl1a第三號(hào)外顯子區(qū)域的位置.筆者選取了兩個(gè)fhl1a基因的打靶位點(diǎn)并進(jìn)行了共注射，目的是希望得到大片段缺失的fhl1a基因的突變體.但是后來(lái)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)可能只有第二個(gè)靶位點(diǎn)發(fā)揮了功能，因?yàn)楣P者得到的突變體都位于2號(hào)靶位點(diǎn)附近，1號(hào)靶位點(diǎn)在這里并沒(méi)有起作用.

注射fhl1a-Cas9-sgRNA后的斑馬魚(yú)F0代屬于嵌合體，這就意味著并不是所有的細(xì)胞都發(fā)生了基因突變，若突變沒(méi)有發(fā)生在生殖細(xì)胞中則不會(huì)產(chǎn)生遺傳.因此筆者在F0代中篩選到了4種fhl1a敲除類型，而到F1代中只有3種敲除類型得到了遺傳，說(shuō)明10個(gè)堿基缺失的斑馬魚(yú)的生殖細(xì)胞并沒(méi)有發(fā)生突變.F1代為生殖細(xì)胞遺傳，不存在嵌合體現(xiàn)象，為雜合子，所以可用F1代 fhl1a-Cas9-sgRNA-1，2，3號(hào)三個(gè)品系來(lái)繼續(xù)建立穩(wěn)定敲除系.fhl1a基因敲除斑馬魚(yú)的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究fhl1a基因在心臟發(fā)育中的功能提供了研究材料.

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