余扣花+王益奎+莫永誠(chéng)+甘桂云+李文嘉+龍明華

摘 要：以Solanum melongena 自交系01為試驗(yàn)材料，利用正交設(shè)計(jì)L16（45）在5因素4水平上對(duì)茄子SRAP反應(yīng)體系穩(wěn)定性的Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶及模板DNA等外部條件進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，并對(duì)所穩(wěn)定的體系進(jìn)行驗(yàn)證。得出最佳的體系的引物的濃度為0.4 mmol/L、dNTPs的濃度為0.2 mmol/L、Mg2+濃度為2.0 mmol/L、模板DNA為40 ng、Taq酶濃度為0.25U/μL。

關(guān)鍵詞：茄子 正交設(shè)計(jì) SRAP

茄子（Solanum.melongena L.）作為中國(guó)重要的蔬菜作物，具有悠久的栽培史，中國(guó)擁有豐富的茄子資源[1]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，SRAP標(biāo)記技術(shù)在茄子種質(zhì)資源上及分子育種方面利用越來越廣泛。Sequence-Related Amplified-Poly- morphism（SRAP）標(biāo)記在2001年開發(fā)出來后，該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，易于分離條帶和進(jìn)行檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于茄子遺傳多樣性分析、構(gòu)建遺傳圖譜、雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)等方面[2]。為了更快捷的利用SRAP標(biāo)記對(duì)茄子進(jìn)行科學(xué)研究。本試驗(yàn)運(yùn)用正交設(shè)計(jì)的方法對(duì)SRAP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用18份茄子及茄亞屬材料包括Solanum melongena系列：自交系01、180、273、航茄1號(hào)、138、130、越南砧木、茄崎茄、CQ、25；Solanum integrifolium系列：BH、Z5、Z7、Z2；Solanum indicum s101；Solanum sisymbriifolium s102；Solanum torvum s103；Solanum surattense Burm s104均由廣西農(nóng)科院蔬菜研究所提供。PCR擴(kuò)增所使用的Taq聚合酶、dNTPs、Mgcl2購(gòu)自上海生物工程有限公司，SRAP引物由金開瑞生物科技有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茄子基因組DNA的提取

基因組DNA提取采用改良CTAB法[3]。將提取的DNA用紫外分光光度計(jì)與1.5 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，OD260/OD280是否在1.8～2.0的區(qū)間，瓊脂糖電泳無拖尾和蛋白質(zhì)殘留，將DNA定量濃度為50 ng/μL，-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SRAP反應(yīng)體系優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)

采用L16（45）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)主要影響SRAP反應(yīng)體系的Mg2+、Taq酶、模板DNA、dNTPs以及引物濃度進(jìn)行5因素4水平篩選，共16個(gè)處理，方案如表1。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。除表中變化因素外，每個(gè)反應(yīng)中添加2 μL 10 × PCR buffer，用ddH2O補(bǔ)足20 μL反應(yīng)體系。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與電泳檢測(cè)

以01基因組DNA作為模板，em3me1為引物進(jìn)行SRAP反應(yīng)體系的建立與正交試驗(yàn)，em3和me1的引物序列分別為5'-GACTGCGTACGAATTGAC-3'和5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3'。PCR擴(kuò)增在Applied Biosystems（美國(guó)）的4375786擴(kuò)增儀上進(jìn)行，選用SRAP-PCR基本的反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，加入2 μL10 × Loading buffer，混合均勻后取1.2 μL產(chǎn)物進(jìn)行7 %聚丙烯酰胺凝膠電泳，穩(wěn)定電壓220V電泳50 min。電泳結(jié)束后用1 %的AgNO3進(jìn)行銀染10 min，然后在顯影液（12 g/L NaOH、0.2 %甲醛、0.3 g/L硼砂）顯影至金黃色，相機(jī)拍照保存結(jié)果。

1.2.4 優(yōu)化體系的驗(yàn)證

用正交試驗(yàn)后優(yōu)化所得的最佳反應(yīng)體系，對(duì)18份茄亞屬單株進(jìn)行DNA的SRAP擴(kuò)增，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP擴(kuò)增條帶的直觀分析

按照表1設(shè)計(jì)對(duì)16個(gè)處理進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，見圖1，根據(jù)條帶的數(shù)量，清晰度，及背景顏色進(jìn)行打分：條帶豐富，清晰度高，背景顏色淺的打9分，反之，打1分[5]。對(duì)3次重復(fù)分別進(jìn)行計(jì)分，得分見表1，從結(jié)果可以看出，3次結(jié)果一致性高，重復(fù)性好。假設(shè)各因素不存在交互作用的情況下，對(duì)3次結(jié)果進(jìn)行直觀分析：計(jì)算各因素同一水平對(duì)應(yīng)的K值、平均值k和極差R，結(jié)果見表2。

極差R大小反映了各因素對(duì)正交體系的影響，R值越大，對(duì)體系影響越大；每個(gè)因素水平下的k大小反映了各水平對(duì)體系的影響情況，k值越大，反應(yīng)水平越好[6]。由表2 可知，對(duì)茄子SRAP正交反應(yīng)體系影響由大到小依次為：Mg2+>引物>DNA模板>dNTPs>Taq酶。

通過電泳得到茄子SRAP正交反應(yīng)最佳體系為：Mg2+濃度為2.0 mmol/L，引物濃度為0.4 mmol/L，DNA模板40 ng，dNTPs的濃度為0.2 mmol/L，Taq酶濃度為0.25 U/μl。

2.2 最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

用引物em2me6（5'-GACTGCGTACGAATTT GC-3'和5'-TGAGTCCAAACCGGTAA- 3'）對(duì)18份茄亞屬單株DNA用上述最佳SRAP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示不僅茄子材料擴(kuò)增的條帶清晰、多態(tài)性好，對(duì)茄亞屬材料也能擴(kuò)增出清晰度高、多態(tài)性好的條帶，說明該穩(wěn)定反應(yīng)體系廣泛適用于茄亞屬的SRAP擴(kuò)增。

3 討論

由于PCR-SRAP反應(yīng)體系是多因素共同作用的反應(yīng)體系，每個(gè)因素的不同水平對(duì)SRAP反應(yīng)結(jié)果都會(huì)產(chǎn)生影響，最優(yōu)的反應(yīng)體系對(duì)試驗(yàn)的后續(xù)進(jìn)行至關(guān)重要，關(guān)系著整個(gè)試驗(yàn)的成敗[7]。因此，優(yōu)化茄子SRAP反應(yīng)體系，更好的利用SRAP分子標(biāo)記在開展茄子研究工作中奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)中，Mg2+濃度對(duì)反應(yīng)體系影響最大，當(dāng)Mg2+濃度為3.0 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶不穩(wěn)定，條帶數(shù)量增多，當(dāng)Mg2+濃度為1.5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶少，條帶不清晰，此結(jié)果與鄒小云[4]研究結(jié)果一致。dNTPs濃度在各水平均為顯著差異，當(dāng)在0.2 mmol/L與0.3 mmol/L水平上整體反應(yīng)評(píng)分較高這與陳書霞[8]和王芳[2]研究結(jié)果基本一致。當(dāng)濃度為0.1 mmol/L時(shí)，條帶增多，且相對(duì)比較清晰，這與陳書霞研究結(jié)果有一定差異，可能是各因素相互影響的原因。引物在各水平上表現(xiàn)出顯著性差異，濃度為0.2 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶變少，主要擴(kuò)增出幾條主帶，當(dāng)濃度為0.8 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶明顯增多。DNA做為反應(yīng)的模板，濃度升高擴(kuò)增出的非特異性條帶增多，一般DNA濃度適合范圍較寬，在20～60 ng，均能擴(kuò)增出清晰條帶。這與何建文[9]和任羽[10]等研究結(jié)果基本一致。

優(yōu)化茄子SRAP反應(yīng)體系，對(duì)更好的利用SRAP分子標(biāo)記研究茄子遺傳多樣性及分子育種，減輕試驗(yàn)工作量，提供更高效、準(zhǔn)確的方法。本試驗(yàn)在5個(gè)因素4水平共16個(gè)處理，優(yōu)化SRAP體系，得到最佳體系。

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