閻晶璐 薛曉興 李君玲 夏 愷 王 田 王 偉

北京中醫(yī)藥大學研究院 （北京，100029）

肝纖維化大鼠肝氣郁結證與肝藏血關系的研究*

閻晶璐 薛曉興 李君玲 夏 愷 王 田 王 偉△

北京中醫(yī)藥大學研究院 （北京，100029）

目的：探討中醫(yī)藏象理論“肝藏血主疏泄”相關肝臟病理生理學基礎。方法：以四氯化碳皮下注射法建立肝纖維化肝氣郁結證大鼠模型，利用血生化檢測法及高效液相色譜檢測法，研究其血清及腦部主要蛋白標志物的含量變化。結果：在肝纖維化病程之中大鼠的肝纖維化標志物ALT、AST、IV-C、LV、HA、TGF-b，腦血管軸標志物ANG-II、NE，腦腸軸標志物5-HT、CRH-ACTHCORT等均有升高，神經(jīng)內分泌軸標志物等多種蛋白含量均有發(fā)生變化。結論：血清及腦部主要蛋白標志物含量變化與肝藏血主疏泄理論具有相關性。

肝纖維化大鼠；肝氣郁結證；肝藏血；血清蛋白標志物

“肝藏血”是現(xiàn)代藏象理論中關于肝功能重要的描述，其主要的生理病理生物學基礎尚不明確。前期研究發(fā)現(xiàn)，四氯化碳造模的肝纖維化大鼠在4～10W多表現(xiàn)為肝氣郁結證。本實驗通過分析研究肝纖維化疾病模型大鼠的血清蛋白主要標志的含量變化，探索肝纖維化肝氣郁結證病程中肝藏血主疏泄的生物學基礎。

1.材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物60只SD大鼠，雄性，體重140～160g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（實驗動物生產許可證：SCXK（京）2006－0009），所有動物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學科研實驗中心實驗室。所有大鼠先適應性飼養(yǎng)1W，自由飲食。

1.2 藥品與試劑 四氯化碳（國藥集團有限公司）；花生油（魯花花生油，山東魯花集團產品）；水合氯醛（國藥集團有限公司）；四逆散免煎顆粒（柴胡、枳實、芍藥、炙甘草各6g，北京康仁堂藥業(yè)有限公司）；逍遙散免煎顆粒（柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓、生姜各15g、薄荷、炙甘草各6g）；柴胡疏肝散免煎顆粒（柴胡、陳皮各6g，川芎、香附、枳殼、芍藥各4.5g，炙甘草1.5g）；秋水仙堿（北京普博欣生物科技有限責任公司）。

NE、E、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT標準品（Sigma公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific）；二正丁胺（BAS進口分裝，上?；瘜W試劑）；B8離子對試劑（天津化學試劑二廠），；高氯酸（HCLO4）、乙酸鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑北京有限公司）；超純水（北京中醫(yī)藥大學科研實驗中心）。

1.3 主要儀器 Alliance2695高效液相色譜儀；ECD2465電化學檢測器：玻碳工作電極和銀／氯化銀（Ag／AgCl）參比電極；高速冷凍離心機（Thermo science，美國）；JY88-ⅡN超聲細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PHS-3B精密PH計；MA240D型電子分析天平；DECADEIISDC型電化學檢測器（ANTEC公司，荷蘭）；Olympus 2700全自動生化分析儀。

1.4 CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型的制備與分組處理 60只SD大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組20只，模型組40只。模型組大鼠皮下注射40%CCl4／花生油溶液0.3ml／100g，每周兩次，首劑0.5ml／100g；正常組大鼠以同樣方法注射等量花生油。根據(jù)宏觀表征采集、行為學實驗、大鼠抓力測試進行證候屬性判別，造模4w后從造模大鼠中篩選出典型肝氣郁結證大鼠，根據(jù)隨機數(shù)字表隨機分為證候模型組、四逆散組、秋水仙堿組；未出現(xiàn)肝氣郁結證的造模大鼠為非證候模型組。造模4w后開始灌胃給藥，1次／d，6d／w。四逆散組大鼠給予ml－1·kg－1·d－1劑量的四逆散灌胃給藥，秋水仙堿組大鼠給予ml－1·kg－1·d－1劑量的秋水仙堿灌胃給藥0.002g／kg／d。其他3組大鼠給予等劑量的生理鹽水灌胃。以正常對照組、證候模型組、非證候模型組及各治療組造模12w的肝纖維化肝氣郁結證大鼠的血清和組織樣本為測量對象。

1.5 血清指標測定 將血清稀釋后按全自動生化儀使用說明進行操作測定ALT和AST指標；ELISA試劑盒嚴格按產品說明書操作，測定稀釋后血清中IV-C、LN、HA、TGF-b、CRH、ACTH、CORT、ANG-II、HCY、NE、ACH、5-HT含量。

1.6 高效液相色譜法檢測下丘腦內單胺類神經(jīng)遞質

1.6.1 蛋白沉淀劑及標準品溶液的配制 精確稱量試劑配置0.1mol／L高氯酸溶液，內含0.3mmol／c乙二胺四乙酸二鈉，0.5mmol／c亞硫酸鈉。精密稱取NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HTNE標準品適量，以0.1mol／L高氯酸溶液溶解，配成濃度為100μg／ml的儲備液，4℃避光保存。

1.6.2 樣品處理方法 將含腦組織樣品的EP管從－80℃冰箱中迅速取出，置入冰盒，迅速加入3倍體積的0.1mol／L高氯酸溶液，腦組織在冰浴中以超聲細胞粉碎機進行勻漿10秒，組織充分混勻，無碎塊及成團組織后，靜置10min，高速冷凍離心（12000r／min，10min，4℃），吸取上清再以同樣轉速時間離心后，吸取上清作為待測樣品。

1.6.3 色譜條件 色譜柱：Atlantis C18色譜柱（2.1×150mm，3μm）；流動相：50mM檸檬酸－乙酸鈉，pH3.5，內含1mMB8離子對試劑，4%甲醇，1.8mM二正丁胺，0.3mM Na2EDTA。流速：0.35m l／min；柱溫：35℃；檢測電壓：＋0.75V；每次進樣量：20μL。1.6.4 樣品測試 每次測試前將混標（NE、E、DOPAC、DA、5-HIAA、5-HT和HVA）1ppm進樣20μL，進行質控。樣品標準曲線測試：分別以0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5、2ppm濃度，20μL進樣，記錄峰面積。以混標濃度為X軸，色譜峰面積為Y軸建立7個標準曲線，通過該標準曲線，以外標法定量計算樣品濃度。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析；計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差的形式表示；統(tǒng)計方法：多組比較時選用兩因素析因設計資料的方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異法（LSD），P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 各組大鼠血清ALT和AST檢測結果 見表1。

表1 各組大鼠血清ALT和AST比較 （±s，IU／mL）

表1 各組大鼠血清ALT和AST比較 （±s，IU／mL）

與正常組比較，★P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

n AST ALT正常組12 162.42±43.51 64.83±20.78模型組9 1354.33±471.88★861.11±563.40★柴胡疏肝散組9 938±529.67★●523.11±298.08★●四逆散組8 856.13±441.68★●541±251.01★●秋水仙堿組10 756±481.57★●494.4±144.75★●逍遙散組10 1007.3±504.15★●502±196.93★●

2.2 各組大鼠血清中各指標檢測結果 見表2、表3。

表2 各組大鼠血清IV-C、LN、HA、TGF-b、ACH、5-HT含量比較 （±s，ng／mL）

表2 各組大鼠血清IV-C、LN、HA、TGF-b、ACH、5-HT含量比較 （±s，ng／mL）

與正常組比較，★P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

n IV-C LN HA TGFb ACH 5-HT正常組12 96.79± 2.56 46.59± 1.54 232.23± 18.90 223.08± 28.07 65.19± 10.34 24.18± 9.57模型組9 120.27± 23.88★69.71± 35.52★385.12± 66.16★540.92± 150.93★65.61± 17.46 39.54± 12.05★非模組8 106.43± 2.80●47.02± 0.81●224.42± 48.31●312.32± 44.63★●109.89± 57.42★39.131± 10.93柴胡疏肝散組9 104.79± 2.24●48.67± 2.46●252.84± 55.60●412.15± 141.92★●65.77± 12.72 42.04± 19.14★四逆散組8 104.94± 3.60●48.96± 1.89●248.00± 58.70●436.75± 100.10★●92.08± 67.45 36.11± 14.07★秋水仙堿組10 106.98± 3.89●47.83± 3.45●292.57± 38.14★●363.68± 95.23★●97.99± 40.84 34.07± 11.38★逍遙散組10 107.64± 2.38●49.71± 4.20●256.70± 53.06●353.17± 71.06★●77.84± 15.92 33.16± 11.22

表3 各組大鼠血清CRH、ACTH、CORT、ANG-II、HCY、NE含量比較 （±s，ng／mL）

表3 各組大鼠血清CRH、ACTH、CORT、ANG-II、HCY、NE含量比較 （±s，ng／mL）

與正常組比較，★P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

n CRH ACTH CORT ANG-II HCY NE正常組12 13.35± 2.42 80.42± 13.46 7.62± 1.13 0.60± 0.14 2.02± 1.08 24.82± 6.70模型組9 19.07± 4.39★89.76± 15.53 11.23± 3.93★1.15± 0.78★2.09± 1.01 50.93± 16.61★非模組8 17.34± 4.86 108.16± 24.40★11.84± 2.36★0.39± 0.16●1.85± 1.61 48.40± 13.39柴胡疏肝散組9 18.39± 5.73★91.37± 26.67 10.42± 2.60 0.57± 0.33●2.73± 1.67 49.34± 25.88★四逆散組8 18.28± 5.94★93.83± 28.94 10.13± 1.40 0.43± 0.27●2.65± 2.77 48.54± 22.76★秋水仙堿組10 18.55± 4.97★86.76± 17.35 11.46± 2.70★0.57± 0.46●1.59± 0.85 43.55± 17.20逍遙散組10 18.39± 3.55★78.50± 14.41 9.27± 0.89 0.53± 0.32●2.38± 0.84 35.592± 7.94●

2.3 高效液相色譜法測大鼠下丘腦神經(jīng)遞質含量結果 用0.001μg／mL，0.005μg／mL，0.01μg／mL，0.02μg／mL，0.05μg／mL，0.1μg／mL，0.2μg／mL，0.5μg／mL，1.0μg／mL，1.5μg／mL，2.0μg／mL濃度的復合標準液為檢測標準品，分別通過NE、E、DOPAC、DA、5-HIAA、5-HT和HVA測定的峰面積為橫坐標，濃度為縱坐標，進行線性回歸分析并計算相關系數(shù)R2，所得的回歸方程如下：

在設置的相關電化學檢測電勢條件下，NE、E、DOPAC、DA、5－HIAA、5－HT和HVA檢測標準曲線的相關系數(shù)R2均大于0.99，標準曲線線性良好，可用于樣品的分析。各指標結果見表4。

表4 各組大鼠下丘腦單胺類神經(jīng)遞質含量比較 （±s，ng／mL）

表4 各組大鼠下丘腦單胺類神經(jīng)遞質含量比較 （±s，ng／mL）

與正常組比較，★P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

n NE DA 5-HIAA 5-HT HVA DOPAC正常組9 0.1238± 0.0452 0.0454± 0.0113 0.049± 0.0102 0.1239± 0.0693 1.7581± 0.4341 0.047± 0.0067模型組10 0.1877± 0.0469★0.0577± 0.0093★0.073± 0.0157★0.2403± 0.0979★2.495± 0.5561 0.049± 0.0048★非模組9 0.1776± 0.0486 0.0556± 0.011 0.08± 0.0174★0.2789± 0.1223★2.5975± 0.5939 0.047± 0.0041柴胡疏肝散組9 0.1693± 0.0791 0.0564± 0.0165★0.073± 0.024★0.2778± 0.1578★2.2722± 0.8957 0.056± 0.0157★●四逆散組7 0.2164± 0.1264★0.0506± 0.0125 0.068± 0.02★0.1863± 0.1052 2.3086± 0.4784 0.05± 0.0059秋水仙堿組7 0.1711± 0.0306 0.0559± 0.0138★0.068± 0.0162★0.2315± 0.1138★2.0818± 0.2485 0.05± 0.0055逍遙散組8 0.251± 0.0973★0.0605± 0.0169★0.058± 0.0114 0.2402± 0.0741★1.8913± 0.3426 0.054± 0.0009

3.討論

本實驗中涉及的蛋白水平標志物主要分為以下大類，肝纖維化標志物，腦血管軸、腦腸軸、神經(jīng)內分泌軸標志物。肝纖維化標志物包括ALT、AST、IV-C、LA、HA、TGF-b；腦血管軸中包括ANG-II，NE，HCY；腦腸軸有5-HT，神經(jīng)內分泌軸有多巴胺，乙酰膽堿、促腎上腺皮質激素釋放素、高香草酸3，4-二羥基苯乙酸，5-羥吲哚乙酸等。

肝纖維化標志物：隨著肝纖維化進展，以上的標志物含量均顯著高于正常組和各治療祖，進一步的證明動物模型的成功建立，以及方劑反證的效果。有文獻指出［1］，肝氣郁結證（肝郁脾虛證），肝纖維化標志物比正常值約升高1.5～2.2倍，隨著中醫(yī)證候向肝腎陰虛、瘀血阻絡證發(fā)展，這些肝纖維化的標志物比正常值的升高倍數(shù)還會繼續(xù)增加。本實驗中，IV-C比正常值約高1.23倍，LN比正常值約高1.48倍，HA比正常值約高1.65倍，也可以一定程度上佐證本實驗中大鼠處于肝纖維化肝氣郁結證。同時，本實驗中證候模型組比非證候模型組肝纖維化標志物顯著性升高，用此模型研究肝藏血和肝疏泄功能具有一定可信度。

腦血管軸標志物：ANG-II通過收縮全身小血管而升高血壓，對于維持血壓起到重要的作用；同時，ANG-II具有促進肝纖維化進程的作用，可以激活HSCs、促進TGF-B分泌、影響MMPS和TIMPS的平衡等，并且ANG-II與抑郁、焦慮、認知功能有密切關系。很多臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化肝硬化患者血清中ANG-II含量明顯增加；本實驗也有一致的趨勢，并且各治療組ANG-II含量均比證候模型組減低。同時，前期研究中發(fā)現(xiàn)肝纖維化肝氣郁結證大鼠存在肝臟血流速度和血流量增高，腦血流量增加等肝藏血功能異常狀態(tài)，可能與ANG-II影響血管收縮并且升高血壓有關；肝氣郁結證具有明顯的情志異常，并且情志變化與肝纖維化程度都可以被用以治療肝氣郁結證的方劑抑制，考慮肝纖維化肝氣郁結證與ANG-II的異常升高有明顯的關系，推測ANG-II與肝藏血主疏泄具有一定關系。

NE是一種由交感節(jié)后神經(jīng)元和腦內腎上腺素能神經(jīng)末梢合成分泌的神經(jīng)遞質，同時也由腎上腺髓質少量合成分泌，其參與胃腸道運動，NE釋放過度可以引起腹瀉；并且抑郁癥的發(fā)生與NE減少有一定關系。陳澤奇等［2］測定30例肝氣郁結證患者血漿去甲腎上腺素發(fā)現(xiàn)，肝氣郁結證患者血漿中NE有升高趨勢，并且偏煩躁的患者NE升高明顯，考慮肝氣郁結證與NE有密切關系。本實驗中NE證候模型組異常升高，與該結論一致，佐證NE與肝主疏泄具有一定關系。

同型半胱甘酸血癥會導致人體產生認知障礙，同時引起焦慮樣行為。在本實驗中，各組大鼠血清HCY無統(tǒng)計學差異，推測在本模型中，HCY與肝藏血主疏泄功能關系不密切。

腦腸軸：5-HT是重要的神經(jīng)遞質，有研究指出，肝硬化病人血液中5-HT含量增加，與血小板的釋放有關，并且5-HT可以促進肝纖維化的發(fā)展。本實驗中模型組及治療組血清5-HT均顯著高于正常組，與臨床研究一致。而大腦中的5-HT作為神經(jīng)遞質，主要分布在下丘腦和松果體，參與痛覺、睡眠和體溫調節(jié)。本實驗中，血清中和下丘腦中5-HT均呈上升趨勢，考慮跟肝纖維化肝氣郁結證時，由于肝失疏泄不能調暢情志，影響副交感神經(jīng)敏感及腸神經(jīng)系統(tǒng)敏感性增高而導致5-HT分泌增加，從而引起大鼠情志變化以及腹瀉，推測5-HT的持續(xù)升高與肝失疏泄肝氣郁結證發(fā)生有關，5-HT含量異常與肝主疏泄關系密切。

CRH-ACTH-CORT通路調節(jié)異常與抑郁癥有關，本實驗中，CRH、CORT含量有明顯上升，ACTH證候模型組與正常組相比變化不明顯，但非證候模型組比證候模型組顯著增高?，F(xiàn)代研究認為，CORT升高可以引起情緒不穩(wěn)、煩躁，而CRH和ACTH作為CORT的上游激素，動態(tài)調節(jié)CORT的含量。在本實驗中，證候模型組大鼠具有明顯的情志變化，考慮該激素軸含量變化與肝臟病變時與以上通路的激素異常合成和滅活有關，并且與肝氣郁結證的情志變化密切相關。該通路的興奮性神經(jīng)遞質有ACH和5-TH，其中ACH變化不明顯，而5-HT呈上升趨勢。5-TH的持續(xù)增高可能是激活CRH-ACTH-CORT的信號分子之一。

DA是下丘腦和腦垂體中重要得的神經(jīng)遞質，研究證明DA與精神因素明顯相關，本實驗證候模型組大鼠下丘腦DA增加，與已發(fā)現(xiàn)的大鼠情志變化應該有一定關系。5-HIAA是5-HT的終產物，其含量與陣痛和睡眠有一定關系，有實驗研究表明5-HIAA降低與抑郁癥有關，DOPAC是一種兒茶酚胺類神經(jīng)遞質，HVA是NE和E的終產物，中樞中HVA無明顯變化，外周血和腦組織中NE均有不同程度的增加，提示NE代謝異常與肝氣郁結證組有一定關系。綜合多種腦部神經(jīng)遞質含量有升高趨勢，本實驗中大鼠肝氣郁結證情志變化可能屬于偏煩躁型。

中醫(yī)認為氣屬陽，血屬陰，肝藏血偏于陰，主疏泄偏于陽，陰血不足則不足以涵陽，肝氣郁結證早期情緒變化往往偏抑郁，但是后期因為陰血不足，虛熱內生，可以以出現(xiàn)情緒煩躁、急躁易怒等癥狀，臨床也可見肝氣郁結證患者存在抑郁型情緒變化和煩躁型情緒變化，在臨床上可能與個人素體體質、病程長短、疾病嚴重程度相關。本實驗中，肝纖維化肝氣郁結證大鼠在藏血功能上存在功能失常，在前期研究中發(fā)現(xiàn)，肝纖維化肝氣郁結證大鼠存在腦部血流量明顯增加，腦部神經(jīng)遞質含量升高，調節(jié)情緒的中央杏仁核存在功能異常激活，都與肝失疏泄引起的情志異常密切相關，考慮這些異常改變從宏觀的調控到微觀蛋白調控存在一定的共同作用，共同引起肝藏血主疏泄功能的失常；推測這些宏觀調控和微觀指標都是肝藏血主疏泄的相關病生理基礎。

綜上，本實驗中肝纖維化標志物、ANG-II、5-HT、NE、CRHACTH-CORT軸等指標與肝纖維化肝氣郁結證大鼠關系較為密切，與肝藏血主疏泄有一定關系。進一步實驗的過程中可開展更多血清蛋白標志物的分析檢測，以更好的詮釋相關動態(tài)性變化的生物學機制。

［1］ 羅國鈞，羅海琳.慢性肝病肝郁脾虛證的研究進展［J］.山西中醫(yī)，2001，17（3）：57－59.

［2］ 陳澤奇，金益強，陳國林.肝氣郁結證血漿去甲腎上腺素和腎上腺素測定結果分析［J］.中醫(yī)藥學報，1997，25（5）：47－48.

Study the relationship between liver qi stagnation and liver stores blood in liver fibrosis rats

YAN Jing-lu，XUE Xiao-xing，WANGWei，et al.Beijing university of traditional chinesemedicine（Beijing，100029）China.

Objective：To explore the biologicalmechanism of“l(fā)iver storing blood and Liver Controlling Disper”.Methods：The rat liver fibrosismodelwas established by subcutaneous injection of carbon tetrachloride；The functionalmagnetic resonance imaging and liver ultrasound were used to detect brain and liver blood flow velocity，the vein diameter and blood flow in the model rats.Results：The test result shows that vein diameter and blood flow of the hepatic artery and hepatic vein，the blood flow of hippocampus and hypothalamus were increased in liver fibrosis.Also abnormal activation of brain amygdala was found in brain functionalmagnetic analysis.Conclusion：The results were proved to relate to“l(fā)iver storing blood“theory closely.The abnormal function of“l(fā)iver storing blood”was closely related to the hemodynamics changes of liver and brain.

liver fibrosisrat；syndrome of liver Qi stagnation；liver stores blood；serum protein markers.

10.3969／j.issn.1005－0264.2017.02.011

2016－07－07 編輯：黃育華）

國家“十二五”973項目（No.2011CB505106）；△通訊作者，E-mail：wang wei26960＠126.com