郭琲婷 郭曉霞

山西省中醫(yī)藥研究院2014級(jí)碩士研究生班 （山西 太原，030012）

基于TLR4／NF-κB信號(hào)通路研究調(diào)肝理脾方聯(lián)合熊去氧膽酸干預(yù)原發(fā)性膽汁性膽管炎小鼠的作用機(jī)制*

郭琲婷 郭曉霞△

山西省中醫(yī)藥研究院2014級(jí)碩士研究生班 （山西 太原，030012）

目的：通過(guò)研究腫瘤壞死因子-a（TNF-α）及Toll樣受體4／核轉(zhuǎn)錄因子κB（TLR4／NF-κB）信號(hào)通路相關(guān)基因在原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）模型小鼠回腸組織中的表達(dá)情況，探討中藥調(diào)肝理脾方（TGLP）聯(lián)合熊去氧膽酸（UDCA）干預(yù)PBC小鼠的作用機(jī)制。方法：將100只C57BL／6雌性小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性組（UDCA 0.1g·kg－1·d－1）、中藥組（TGLP 5.4g·kg－1· d－1）、聯(lián)合組（TGLP 5.4g·kg－1·d－1＋UDCA 0.1g·kg－1·d－1），每組20只；采用聚肌胞苷酸（poly l：C）5mg／kg復(fù)制PBC小鼠模型；給藥8w、16w后頸脫位法處死小鼠，采集末端回腸，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測(cè)回腸組織中TLR4、TNF-α的表達(dá)水平，RT-PCR法測(cè)定回腸組織中TLR4、NF-κBmRNA的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組比較，正常組小鼠回腸組織中NF-κB、TNF-α表達(dá)水平較低，差異有顯著性意義（P＜0.01）；經(jīng)治療后3個(gè)治療組小鼠TLR4、NF-κB、TNF-α表達(dá)水平均較模型組降低，差異有顯著性意義（P＜0.01或P＜0.05），且聯(lián)合組小鼠TLR4、NF-κB、TNF-α表達(dá)水平下降最顯著；與聯(lián)合組相比，中藥組小鼠NF-κB表達(dá)水平較高，差異有顯著性意義（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論：負(fù)性調(diào)節(jié)小鼠回腸組織中TLR4／NF-κB信號(hào)通路并抑制TNF-α因子的釋放可能是TGLP聯(lián)合UDCA干預(yù)PBC模型小鼠的作用機(jī)制之一。

原發(fā)性膽汁性膽管炎；調(diào)肝理脾方；TLR4／NF-κB信號(hào)通路；TNF-α

原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）是一種病因未明的以慢性進(jìn)行性、非化膿性、肝內(nèi)小膽管破壞、膽汁淤積性為特征的自身免疫性疾病，好發(fā)于中年女性，可逐漸發(fā)展到肝纖維化、肝硬化，最終導(dǎo)致肝衰竭而需肝臟移植［1］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外基礎(chǔ)與臨床研究表明，多種肝病的發(fā)生、發(fā)展與腸道微生態(tài)的變化關(guān)系密切，有學(xué)者指出［2，3］，PBC患者中腸道微生物可能通過(guò)腫瘤壞死因子-a（TNF-α）發(fā)揮致病或免疫調(diào)節(jié)的作用，而TNF-α的產(chǎn)生與Toll樣受體4／核轉(zhuǎn)錄因子κB（TLR4／NF-κB）信號(hào)通路密切相關(guān)。調(diào)肝理脾方是郭曉霞導(dǎo)師在長(zhǎng)期臨床工作中擬定的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過(guò)臨床反復(fù)驗(yàn)證，該方可明顯改善PBC患者的肝纖維化程度及生存質(zhì)量。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明，調(diào)肝理脾方對(duì)PBC小鼠慢性肝損傷及小膽管改變具有很好的防護(hù)作用［4］，我們選用調(diào)肝理脾方聯(lián)合熊去氧膽酸，觀察其對(duì)PBC模型小鼠回腸組織中TNF-α及TLR4、NF-κB表達(dá)水平的影響，探討調(diào)肝理脾方聯(lián)合熊去氧膽酸干預(yù)PBC的作用機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用5-6周雌性SPF級(jí)C57BL／6小鼠100只，體質(zhì)量18±2g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。

1.2 藥物 熊去氧膽酸膠囊（公司：Dr.Falk Pharma GmbH，生產(chǎn)企業(yè)：Losan Pharma GmbH，產(chǎn)品批號(hào)：12K21424L），規(guī)格250mg／粒，25粒／盒。實(shí)驗(yàn)室用雙蒸水配制成濃度為0.5%的混懸液。調(diào)肝理脾方由以下藥物組成：炙黃芪、丹參、枸杞子各30g，山藥20g，白術(shù)、茯苓各15g，柴胡、姜黃、羌活、忍冬藤各10g，陳皮6g，郁金12g，均由江陰天江藥業(yè)有限公司提供的免煎顆粒。根據(jù)前期研究，選用療效最佳的中劑量，在實(shí)驗(yàn)室用雙蒸水配制成濃度為66.7%的免煎溶液。

1.3 主要試劑及儀器 聚肌胞苷酸Poly C（美國(guó)Amersco公司），小鼠TNF-αELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司），EasyPure?RNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司，ER101），TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，AT301），QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit（德國(guó)QIAGEN公司）。組織勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司，T25 ULTRA-TURRAX），微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek公司，Synergy H1）；低溫臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司，Auegrax-30k），Veriti定性PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司，9902），熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司，7500）。

1.4 動(dòng)物分組及處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后，稱(chēng)取體重。采用Excel隨機(jī)分組方法［5］，根據(jù)體重隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，生成隨機(jī)數(shù)字，將100只C57BL／6小鼠隨機(jī)分配到5個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，每組20只，分別是正常組、模型組、陽(yáng)性組（UDCA 0.1g·kg－1·d－1）、中藥組（TGLP 5.4g·kg－1·d－1）、聯(lián)合組（TGLP 5.4g·kg－1·d－1＋UDCA 0.1g·kg－1·d－1）。參考文獻(xiàn)報(bào)道［6～8］，除正常組外，其余4組小鼠均腹腔注射聚肌胞苷酸（poly l：C）5mg／kg，正常組小鼠予等體積生理鹽水腹腔注射，2次／w，連續(xù)16周。8周、16周時(shí)頸脫位法處死小鼠（處理前禁食一天），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只，采集末端回腸，0.9%生理鹽水沖洗后保存于-80℃冰箱以備檢測(cè)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 腸組織中TNF-α的檢測(cè) 使用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)腸組織中TNF-α濃度。步驟參照試劑盒說(shuō)明。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法測(cè)定腸組織中TNF-αmRNA的表達(dá)水平。步驟參照試劑盒說(shuō)明。引物序列見(jiàn)表1。

1.5.2 腸組織中TLR4、NF-κB的檢測(cè) 采用RT-PCR法檢測(cè)腸組織中TLR4mRNA、NF-κBmRNA表達(dá)水平。步驟參照試劑盒說(shuō)明。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，正常組死亡1只，模型組死亡1只，陽(yáng)性組死亡2只，聯(lián)合組死亡3只中藥組死亡0只，共死亡7只老鼠，均因灌胃后出現(xiàn)死亡，解剖后未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性病變，考慮可能與灌胃時(shí)操作不當(dāng)有關(guān)。

2.2 各組小鼠腸組織中TNF-α的表達(dá)水平 見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腸組織中TNF-α表達(dá)水平比較 （±s）

表2 各組小鼠腸組織中TNF-α表達(dá)水平比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

正常組8 153.00±21.35**153.81±10.31**模型組8 230.61±40.39 236.86±43.55陽(yáng)性組8 189.31±17.33**180.33±28.06**中藥組8 194.95±31.40*198.32±36.64*聯(lián)合組8 179.73±24.17**176.17±24.03**

2.3 各組小鼠腸組織中TLR4、NF-κB、TNF-αmRNA的表達(dá)水平（2△△CT值）（見(jiàn)圖1到圖4） 各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因β-actin和TLR4、NF-κB、TNF-α熔解曲線(xiàn)中均有單一的主峰，熔解溫度為85℃，相同擴(kuò)增條件下重復(fù)多次，得到的β-actin和TLR4、NF-κB、TNF-α熔解溫度均在85℃左右，變化不超過(guò)1℃，說(shuō)明所擴(kuò)增的產(chǎn)物具有特異性。

圖1 β-actin內(nèi)參基因溶解曲線(xiàn)

圖2 TLR4基因溶解曲線(xiàn)

圖3 NF-κB基因溶解曲線(xiàn)

圖4 TNF-α基因溶解曲線(xiàn)

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果及2△△CT值顯示，與模型組比較，正常組小鼠腸組織中TLR4、NF-κB、TNF-α基因表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各治療組小鼠腸組織中TLR4、NF-κB、TNF-α基因表達(dá)水平有不同程度的下降但均高于正常組，其中聯(lián)合組下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。與聯(lián)合組比較，中藥組TLR4、TNF-α基因表達(dá)水平較高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；NF-κB基因表達(dá)水平較組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。與聯(lián)合組比較，陽(yáng)性組TLR4、NF-κB、TNF-α基因表達(dá)水平均有升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠腸組織中TLR4、NF-κB、TNF-αmRNA表達(dá)水平2△△CT的比較 （±s）

表3 各組小鼠腸組織中TLR4、NF-κB、TNF-αmRNA表達(dá)水平2△△CT的比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與聯(lián)合組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別n 8周TLR4 NF-κB TNF-α 16周TLR4 NF-κB TNF-α正常組8 0.24± 0.92**0.18± 0.05**0.30± 0.15**0.22± 0.82**0.26± 0.14**0.29± 0.14**模型組8 1.07± 0.17 1.00± 0.13 1.04± 0.10 1.06± 0.22 1.01± 0.13 1.03± 0.07陽(yáng)性組8 0.53± 0.21**0.51± 0.13**0.66± 0.12**0.49± 0.12**0.51± 0.16**0.65± 0.21**中藥組8 0.67± 0.26*0.59± 0.15**＃＃0.70± 0.24**0.62± 0.17**0.58± 0.12**＃0.70± 0.16**陽(yáng)性＋中藥組8 0.47± 0.20**0.34± 0.10**0.49± 0.12*0.45± 0.07*0.35± 0.12**0.49± 0.14**

3 討論

PBC是一種病因未明的自身免疫性、慢性進(jìn)行性肝臟疾病，其病理特點(diǎn)以肝內(nèi)細(xì)小膽管的非化膿性破壞、匯管區(qū)炎癥、膽汁淤積、肝纖維化為主，可發(fā)展為肝硬化，最終導(dǎo)致肝衰竭而需肝臟移植。PBC多見(jiàn)于中老年女性［10］，最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)為乏力和皮膚瘙癢。全球范圍內(nèi)PBC的年發(fā)病率為0.33～5.8／10萬(wàn)，患病率為1.91～40.2／10萬(wàn)［11］；我國(guó)的發(fā)病率雖無(wú)大樣本流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，但近年來(lái)PBC的發(fā)病率及檢出率逐漸增多，2010年在對(duì)廣州當(dāng)?shù)厝说恼{(diào)查中顯示，PBC的患病率為49.2／10萬(wàn)，其中40歲以上女性的患病率為155.8／10萬(wàn)。血清抗線(xiàn)粒體抗體（AMA）陽(yáng)性，特別是AMA-M2亞型陽(yáng)性對(duì)本病診斷具有很高的敏感性和特異性。

中醫(yī)學(xué)沒(méi)有PBC病名，根據(jù)疾病階段及臨床表現(xiàn)將其歸屬于“脅痛”、“積聚”、“黃疸”、“鼓脹”等病癥。歷代醫(yī)家對(duì)病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)各不相同，張景岳將脅痛的病因分為外感和內(nèi)傷。肝為將軍之官，性喜條達(dá)，調(diào)暢氣機(jī)，情志不遂、飲食不節(jié)、外感濕熱、病后所致等均可受累于肝，發(fā)為本病。結(jié)合文獻(xiàn)查閱［12，13］及前期研究［14］發(fā)現(xiàn)，肝郁脾虛是PBC患者的基本證型，研究中采用腹腔注射聚肌胞苷酸C57BL／6小鼠，成功建立了早期PBC小鼠動(dòng)物模型，經(jīng)郭曉霞導(dǎo)師經(jīng)驗(yàn)方調(diào)肝理脾方干預(yù)后，通過(guò)肝組織病理及超微結(jié)構(gòu)觀察肝損傷情況，結(jié)果提示調(diào)肝理脾方可有效抑制膽小管的增生及膠原纖維的沉積。調(diào)肝理脾方以柴芍六君子湯為基礎(chǔ)方，佐以枸杞子、黃芪、丹參補(bǔ)腎以固本，忍冬藤、羌活祛風(fēng)勝濕，共奏調(diào)肝健脾、補(bǔ)腎祛濕之效。熊去氧膽酸（UDCA）是經(jīng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究證實(shí)的安全有效的治療藥物［15］，雖能夠改善生物化學(xué)和臨床指標(biāo)，但并不能真正改善患者的遠(yuǎn)期生存率和對(duì)肝移植的需求，對(duì)UDCA生化應(yīng)答欠佳的患者，目前尚無(wú)統(tǒng)一的治療方案。前期研究表明［15］，調(diào)肝理脾方聯(lián)合UDCA治療PBC較單用中藥或西藥的效果更好。本研究沿用上述方法成功建立PBC動(dòng)物模型，對(duì)調(diào)肝理脾方聯(lián)合熊去氧膽酸改善PBC模型小鼠的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

Toll樣受體（TLRs）是介導(dǎo)天然免疫及病原體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要跨膜信號(hào)傳遞受體，可識(shí)別高度保守的微生物組分—病原相關(guān)分子模式（PAMPS），在B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞表面都有分布，主要在天然免疫系統(tǒng)的細(xì)胞上表達(dá)。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少15種TLRs。由TLRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以誘導(dǎo)很多反應(yīng)的快速活化，產(chǎn)生一氧化氮合成酶、抗菌肽、炎癥細(xì)胞因子、共刺激分子、趨化細(xì)胞因子等效應(yīng)分子，激活炎癥反應(yīng)，參與機(jī)體防御反應(yīng)［16］。目前研究以TLR4／NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑較多且最為明確，在Yoon等［17］用LPS刺激BV2細(xì)胞所造成的炎癥模型中，TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組均有所增高。TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴(lài)性途徑作為經(jīng)典傳導(dǎo)途徑，其主要激活NF-κB并促使細(xì)胞因子的產(chǎn)生［18］。NF-κB是真核細(xì)胞中普遍存在的一類(lèi)具有多向性調(diào)節(jié)作用的誘導(dǎo)性核轉(zhuǎn)錄因子，這些基因編碼促炎細(xì)胞因子和內(nèi)在免疫和急性時(shí)相反應(yīng)蛋白［19，20］，廣泛調(diào)控著免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)。

在多種肝臟疾病，如病毒性肝炎、酒精性肝病、肝硬化和肝癌患者中大部分存在腸道菌群的移位和腸源性?xún)?nèi)毒素血癥［21］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)腸源性?xún)?nèi)毒素在肝纖維化［22］和酒精性肝?。?3］的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，PBC也存在由各種因素通過(guò)多途徑、多環(huán)節(jié)、多機(jī)制造成腸粘膜損傷，引起一系列的并發(fā)癥。引起損傷的各種因素中，促炎細(xì)胞因子起了重要作用，TNF-α是公認(rèn)的促炎細(xì)胞因子，其產(chǎn)生與TLR4／NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。炎癥反應(yīng)中，促炎因子如TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄家族的激活將誘導(dǎo)其基因轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子［24］，加重腸粘膜損傷。

本次研究基于TLR4／NF-κB信號(hào)通路，采用ELISA法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)PBC小鼠末端回腸中促炎細(xì)胞因子TNF-α進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示TGLP聯(lián)合UDCA可降低TNF-α的表達(dá)水平，同時(shí)，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PBC模型小鼠末端回腸中TLR4mRNA、NF-κBmRNA，結(jié)果顯示TGLP聯(lián)合UDCA亦可同時(shí)降低TLR4、NF-κB的表達(dá)水平。研究結(jié)果提示，TGLP聯(lián)合UDCA干預(yù)PBC模型小鼠時(shí)，可通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)TLR4／NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而抑制TNF-α細(xì)胞因子的釋放，減輕腸粘膜的損傷。這對(duì)于探討中藥聯(lián)合UDCA以減輕腸粘膜損傷，改善肝臟損傷來(lái)干預(yù)PBC的作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)有重要意義，未來(lái)有望通過(guò)多中心、大樣本統(tǒng)計(jì)的研究方式，為治療PBC提供新的臨床思路。

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Investigation on themechanism of TLR4／NF-κB signaling pathway in the treatment of primary biliary cholangitis in m ice w ith Tiaogan Lipi decoction and Ursodeoxycholic acid

GUO Bei-ting，GUO Xiao-xia.Shanxi research institute of traditional Chinesemedicine（Taiyuan Shanxi，030012）China

Objective：TO study the hemechanism of TLR4／NF-κB signaling pathway in the treatment of primary biliary cholangitis in mice with Tiaogan Lipi decoction and Ursodeoxycholic acid.Methods：100 C57BL／6 femalemice were randomly divided into normal group，model group，positive group（UDCA 0.1g·kg－1·d－1），Chinesemedicine group（TGLP5.4g·kg－1·d－1）and drug combination group（TGLP 5.4g·kg－1·d－1＋UDCA 0.1g·kg－1·d－1），20 in each group.Establish PBC animalmodel by injectingwith cytidine polyinosinic acid（poly l：C）5mg／kg to them.Allmicewere executed through cervical dislocationmethod after8 and 16 weeks and fasted for24h before processing.Terminal ilea were taken outand cleaned in 0.9%saline，and then stored in－80℃refrigerator for detection.With themethod of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）and real-time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR）.The level of TNF-α，TLR4 and NF-κBmRNA were detected through ELISA and PCR，respectively.Results：Compared with themodel group，the expression levels of NF-κB and TNF-αin the normal group ilea were lower，a statistically significant difference（P＜0.01）.By comparison，the expression level of TLR4 in the normal group was lower than that in themodel group，withouta statistically significant difference（P＞0.05）.The expression levels of TLR4，NF-κB and TNF-αin the treatment groupswere lower than that in themodel group，a statistically significant difference（P＜0.01 orP＜0.05），decreasing significantly in the drug combination group.Compared with the drug combination group，the expression level of NF-κB in the Chinesemedicine group was higher，a statistically significant difference（P＜0.01 orP＜0.05）.Conclusion：Negatively regulating TLR4／NF-κB signal pathway and reducing the release of TNF-αin the ileum tissuemay be one of the actionmechanism in the treatmentof primary biliary cholangitis in mice with Tiaogan Lipi decoction and Ursodeoxycholic acid.

primary biliary cholangitis；Tiaogan Lipi decoction；TLR4／NF-κB signal pathway；TNF-α

10.3969／j.issn.1005－0264.2017.02.013

2016－08－30 編輯：肖明中）

山西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.2015011102）；△通訊作者，E-mail，245467575＠qq.com