羅振國(guó)，李淑奎，陶 然，鄧勇泉，遲寶進(jìn)，杜從林

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科,黑龍江 佳木斯 154003)

檢測(cè)尿液中的USP9Y-TTTY15RNA對(duì)前列腺癌的早期診斷①

羅振國(guó)，李淑奎，陶 然，鄧勇泉，遲寶進(jìn)，杜從林

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科,黑龍江 佳木斯 154003)

目的:通過檢測(cè)尿液中的USP9Y-TTTY15RNA 的含量，判斷其是否可以用于前列腺癌的早期診斷。方法:收集2014-10～2016-02前列腺癌患者40例、前列腺增生患者40例和健康男性40例。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)受試者前列腺按摩后尿液中的PSAmRNA和USP9Y-TTTY15RNA的含量。計(jì)算USP9Y-TTTY15RNA在各組患者中的相對(duì)濃度。結(jié)果:USP9Y-TTTY15RNA在各組中均有表達(dá)，但前列腺癌中表達(dá)最多，與前列腺增生組和健康男性組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:USP9Y-TTTY15RNA在各組中均有表達(dá)，但在前列腺癌中表達(dá)最高，可作為前列腺癌的特異性標(biāo)記物，可用于前列腺癌的早期臨床診斷。

前列腺癌;USP9Y-TTTY15;早期診斷;腫瘤標(biāo)記物

前列腺癌的發(fā)病率有著明顯的地理和種族差異。根據(jù)2013年美國(guó)最新的癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告，美國(guó)前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為了危害男性健康的第一位腫瘤[1]。我國(guó)前列腺癌發(fā)病率相對(duì)較低，然而隨著近年來人們生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，前列腺癌的發(fā)病率在我國(guó)呈逐年升高的趨勢(shì)。

98%的前列腺癌是起源于腺細(xì)胞的腺癌，其最終確診依賴于穿刺活檢以及術(shù)后病理。然而穿刺后所取得的前列腺組織量很少，而且現(xiàn)有的輔助檢查手段往往無法對(duì)早期前列腺癌進(jìn)行精準(zhǔn)的定位，致使臨床工作中不能實(shí)現(xiàn)對(duì)穿刺取得的少量細(xì)胞或腺體進(jìn)行分析與準(zhǔn)確診斷。目前公認(rèn)的前列腺癌篩查方法是直腸指檢(DRE)聯(lián)合血清前列腺特異性抗原(PSA)[2]，而對(duì)篩查結(jié)果異常的人群行前列腺的穿刺活檢，總體檢出率為 27.4%[3]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一些惡性腫瘤在其癌變的早期，腫瘤相關(guān)的分子生物學(xué)指標(biāo)已有顯著異常表現(xiàn)，因此，研究重點(diǎn)已逐漸轉(zhuǎn)向分子病理領(lǐng)域。

USP9Y-TTTY15融合基因是我國(guó)學(xué)者近年來發(fā)現(xiàn)的具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的前列腺癌標(biāo)記物[4]。USP9Y-TTTY15融合基因不表達(dá)融合蛋白，而是作為一個(gè)lncRNA發(fā)揮生物學(xué)作用。本次實(shí)驗(yàn)旨在測(cè)定USP9Y-TTTY15RNA在前列腺癌組、前列腺增生組和正常男性組中的表達(dá)，以判定USP9Y-TTTY15RNA是否可以用于前列腺癌的早期診斷。由于前列腺按摩后脫落的前列腺細(xì)胞數(shù)量不等，所以本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定PSAmRNA用于實(shí)驗(yàn)校正[5]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014-10～2016-02前列腺按摩后尿液共120例，包括：①前列腺癌患者40例，年齡61～92歲，平均78歲，均為經(jīng)前列腺穿刺活檢和術(shù)后病理回報(bào)為前列腺癌的患者；②前列腺增生患者40例，年齡69～88歲，平均81歲，均為臨床診斷明確且未經(jīng)手術(shù)的患者；③健康男性40例，年齡22～40歲，平均32歲，均為無腫瘤及其他前列腺疾病相關(guān)疾病的患者。不符合尿液標(biāo)本收集與納入實(shí)驗(yàn)的條件包括：①前列腺炎癥患者；②患者留置導(dǎo)尿管或膀胱造瘺管；③收集到的尿液絮狀物多。采集尿液前，充分和患者溝通，患者知情同意。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑：UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、焦碳酸二乙酯、瓊脂糖、溴化乙錠溶液、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、DEPC水、PCR管、熒光定量PCR板、熒光定量型封膜、熒光定量PCR8聯(lián)管&蓋、SGExcelFastSYBRMixture(WithROX)、PBS粉末裝、taq酶、DNTP等試驗(yàn)相關(guān)試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2．2 引物設(shè)計(jì)及合成。通過NCBI查詢PSAmRNA和USP9Y-TTTY15RNA的rs號(hào)，由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成引物。PSAmRNA正義：AGTCTGCGGCGGTGT，反義：TGAGGTCGTGGCTGGAGT；USP9Y-TTTY15正義：CATCACCTGGAGTCCGTGTAAG，反義：CCTACTGGAGAGCCATGAGTG。合成的引物OD值為2.0，經(jīng)HAP方法純化后通過質(zhì)譜檢測(cè)證實(shí)為合格引物。

1.2.3RNA提取及cDNA合成。收集前列腺按摩后的第一次排尿前中段尿液約20mL，密封于50mL無菌離心管內(nèi)，迅速將尿液至于冰盒冷卻并送往實(shí)驗(yàn)室[6]，高速離心(4500g×15min，4℃)，棄去尿液上清，并用 1×PBS清洗2遍后再次離心(4500g×10min，4℃)，棄上清液，用UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取尿沉渣中的RNA。用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒及引物合成PSA和USP9Y-TTTY15的cDNA，并對(duì)cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)及電泳驗(yàn)證。

1.2.4 染料法熒光定量PCR測(cè)定尿液中PSAmRNA和USP9Y-TTTY15RNA的含量。應(yīng)用AB7300熒光定量PCR儀對(duì)合格的cDNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，加入SGExcelFastSYBRMixture(WithROX)等相關(guān)試劑，根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的CT值計(jì)算USP9Y-TTTY15RNA的相對(duì)初始濃度，最終結(jié)果用2Ct(PSA)-Ct(USP9Y-TTTY15)×1000表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過染料法熒光定量PCR檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)融合基因USP9Y-TTTY15RNA在所有尿沉渣樣本中均有表達(dá)，Ct值均在22～26之間。計(jì)算USP9Y-TTTY15RNA初始濃度后，應(yīng)用SPSS17.0分別對(duì)前列腺癌組、前列腺增生組和健康男性組的尿沉渣樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P分別為 0.006和 0.020和0.012，提示USP9Y-TTTY15RNA在各組中呈偏態(tài)性分布。運(yùn)用Mann-WhitneyU-test非參數(shù)檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)USP9Y-TTTY15在前列腺癌患者尿沉渣中表達(dá)量明顯高于前列腺增生組和健康男性組，P=0.009。而前列腺增生組和健康男性組之間無明顯差異，P=0.211，見表1。

表1 尿沉渣中USP9Y-TTTY15的相對(duì)初始濃度

*前列腺癌組與其他兩組相比，P<0.05。

以上結(jié)果證實(shí)了融合基因USP9Y-TTTY15不僅能夠在前列腺腫瘤患者尿沉渣中被檢測(cè)到，而且表達(dá)量明顯高于前列腺增生組和健康男性組。由此推斷，該融合基因在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的危險(xiǎn)因子作用，可用于前列腺癌的早期診斷。

3 討論

世界范圍內(nèi)，我國(guó)是前列腺癌的低發(fā)國(guó)家，但隨著人口老齡化時(shí)代的到來，疾病篩查意識(shí)的提高，新發(fā)的前列腺癌患者逐年升高。1998～2008年中國(guó)男性前列腺癌發(fā)病率的年均增加比例為12. 07%，2008年中國(guó)男性前列腺癌粗發(fā)病率為11.00/10萬[7]。目前診斷早期前列腺癌的最常見手段是經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)下前列腺穿刺活檢獲取組織標(biāo)本行病理檢查。前列腺癌的篩查主要通過直腸指檢和血清前列腺特異抗原(Prostate-specific-antigen，PSA)水平，但大部分的前列腺癌患者都不能實(shí)現(xiàn)早期診斷。自從1980年P(guān)SA第一次從血液中定量測(cè)出以來，PSA被廣泛應(yīng)用于前列腺疾病的診斷，但其對(duì)前列腺癌診斷的特異性低和存在灰區(qū)一直在被關(guān)注和討論。國(guó)內(nèi)的一組數(shù)據(jù)顯示血清總PSA(tPSA)介于4～10ng/mL時(shí)，應(yīng)用5區(qū)13針法前列腺穿刺活檢的陽(yáng)性率僅為15.9%[8]。同時(shí)tPSA也受年齡和前列腺體積的影響，Zhi-Yong等研究表示確診無前列腺癌的前列腺增生患者年齡≥80歲時(shí)，tPSA為0～8.0ng/mL[9]。為此尋找新的前列腺癌特異性標(biāo)記物成為了近年來研究的熱點(diǎn)。

融合基因是指兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾相連后形成的新的基因。融合后的基因共用同一套調(diào)控序列，主要包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止子等。USP9Y(ubiquitinspecificpeptidase9,Y-linked)位于Y染色體長(zhǎng)臂1區(qū)1帶2亞帶，包含49個(gè)外顯子。表達(dá)的產(chǎn)物是泛素特定肽酶9。TTTY15(testis-specifictranscript,Y-linked15)位于Y染色體長(zhǎng)臂1區(qū)1帶1亞帶，包含4個(gè)外顯子。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為Y連鎖的睪丸特異轉(zhuǎn)錄因子15，是一個(gè)非編碼RNA。USP9Y與TTTY15融合后形成的融合基因?yàn)閁SP9Y-TTTY15。Ren等通過RNA測(cè)序分析確定了USP9Y-TTTY15與前列腺癌存在相關(guān)性[10]，但國(guó)內(nèi)關(guān)于USP9Y-TTTY15表達(dá)量的研究較少。本文分別測(cè)定USP9Y-TTTY15RNA在前列腺癌組、前列腺增生組和正常男性組的含量，進(jìn)一步明確USP9Y-TTTY15與前列腺癌的關(guān)系。

本次試驗(yàn)收集的樣本是前列腺按摩后的尿液，測(cè)得的數(shù)值用PSAmRNA進(jìn)行校正。前列腺按摩后的尿液中除了含有前列腺脫落細(xì)胞，還含有尿路上皮細(xì)胞等其他脫落細(xì)胞，而PSAmRNA在前列腺細(xì)胞中特異性的表達(dá)，故需要通過檢測(cè)PSAmRNA的含量尿液中脫落的總前列腺細(xì)胞進(jìn)行校正。本次試驗(yàn)證實(shí)USP9Y-TTTY15在前列腺癌中呈高表達(dá)，在其他兩組中低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所以USP9Y-TTTY15可以作為前列腺癌的特異性標(biāo)記物，用于前列腺癌的早期診斷。鑒于PSAmRNA的低特異性，USP9Y-TTTY15有著廣泛的應(yīng)用前景，尤其對(duì)于血PSA介于4～10ng/mL時(shí)，聯(lián)合檢測(cè)USP9Y-TTTY15具有重大意義，如可以增加前列腺穿刺活檢的陽(yáng)性率，避免不必要的前列腺穿刺等，但仍需后續(xù)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)尿液中USP9Y-TTTY15mRNA的具體含量來輔助評(píng)定臨床中診斷證據(jù)不足或者難以診斷的患者是否可行前列腺癌的相關(guān)治療，完成前列腺癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，對(duì)提高患者治愈率和預(yù)后生活水平有重要意義。

綜上所述，前列腺癌病人經(jīng)前列腺按摩收集到的尿液中可以檢測(cè)到USP9Y-TTTY15融合基因的高表達(dá)，可以作為前列腺癌的早期診斷標(biāo)記物之一，而且尿液檢測(cè)具有無創(chuàng)性的特點(diǎn)。聯(lián)合PSA檢測(cè)的結(jié)果，或許對(duì)PSA水平增高但穿刺活檢為陰性的患者有特殊的意義，可以評(píng)定此類患者是否需要再一次的穿刺活檢，但相關(guān)數(shù)據(jù)仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

[1]SiegelR，NaishadhamD，JemalA.Cancerstatistics2013[J].CA:acancerjournalforclinicians， 2013， 63(1):11-30

[2]羅振國(guó), 王超, 陶然,等. 血清PSA、fPSA/tPSA在前列腺癌診斷中的臨床意義[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2012, 35(1):32-33

[3]BeduschiMC,OesterlingJE.Percentfreeprostate-specificantigen:thenextfrontierinprostate-specificantigentesting[J].Urology, 1998, 51(5):98-109

[4]RenS,PengZ,MaoJH,etal.RNA-seqanalysisofprostatecancerintheChinesepopulationidentifiesrecurrentgenefusions,cancer-associatedlongnoncodingRNAsandaberrantalternativesplicings[J].CellResearch, 2013, 23(3):423-427

[5]GoesslC,MüllerM,HeicappellR,etal.DNA-baseddetectionofprostatecancerinurineafterprostaticmassage[J].Urology, 2001, 58(3):335-338

[6]李亮, 羅振國(guó). 尿液中T1E4mRNA對(duì)于早期診斷前列腺癌的意義[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2015，38(6)：69

[7]韓蘇軍, 張思維, 陳萬青,等. 中國(guó)前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢(shì)分析[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志, 2013, 18(4):330-334

[8]李鳴, 那彥群. 不同水平前列腺特異抗原的前列腺癌診斷率[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 88(1):16-18

[9]Zhi-Yong,Ying-Hao,Chuan-Liang,etal.Age-specificPSAreferencerangesinChinesemenwithoutprostatecancer[J].AsianJournalofAndrology, 2009, 11(1):100-103

[10]RenS,PengZ,MaoJH,etal.RNA-seqanalysisofprostatecancerintheChinesepopulationidentifiesrecurrentgenefusions,cancer-associatedlongnoncodingRNAsandaberrantalternativesplicings[J].CellResearch, 2013, 23(3):423-427

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：D201225。

羅振國(guó)(1964～ ) 男，黑龍江寶清人，學(xué)士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

陶然 (1986～ )男 ，黑龍江佳木斯人，碩士,住院醫(yī)師。 E-mail：524808121@qq.com。

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