曹玉瑤，董 增，曹穩(wěn)根

（宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000）

響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶法破壁提取油菜蜂花粉總黃酮的工藝

曹玉瑤，董 增，曹穩(wěn)根

（宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000）

采用纖維素酶法破壁提取油菜蜂花粉總黃酮，以總黃酮得率為指標(biāo)，研究了料液比、酶解溫度、酶解時間對總黃酮得率的影響，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解破壁提取工藝。 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果表明，最佳工藝條件為料液比 1∶51，酶解溫度 50℃，酶解時間為 5.6h。在此條件下，總黃酮得率為（10.34±0.05）%。 通過對酶解處理前后油菜蜂花粉表面的掃描電鏡觀察，表明纖維素酶具有很好的破壁作用，能促進(jìn)總黃酮等內(nèi)容物的釋放，提高總黃酮的得率。

油菜蜂花粉；纖維素酶；總黃酮；響應(yīng)面優(yōu)化

油菜 蜂花粉（Rape bee pollen）是蜜 蜂 采 集 油 菜花粉時加上蜜蜂自身的腺體分泌物（花蜜和唾液）混合 而成 了一種 不 規(guī)則扁 圓 形狀物[1]。 蜂 花 粉除了 含 有蛋白質(zhì)、糖類和不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分，還含有豐富的 黃 酮 類 物 質(zhì)[2，3]。 研 究發(fā)現(xiàn) 蜂 花 粉 具 有 保 護(hù) 心 血管、增強免疫力、抗癌、抗氧化、抑制前列腺疾病等生理功效，可以應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品、美容等行業(yè)，具有 廣泛 的應(yīng)用 價 值[4-8]。

油菜蜂花粉雖然具有較高的應(yīng)用價值，但是花粉細(xì)胞壁的存在影響了其利用價值?；ǚ奂?xì)胞壁分為內(nèi)壁和外壁，孢粉素和纖維素組成的外壁抗酸堿、耐高溫，內(nèi)壁則由纖維素和果膠構(gòu)成，萌發(fā)孔是各種營養(yǎng)成分釋放的唯一通道，導(dǎo)致花粉的營養(yǎng)利用率低[9]。 目 前 ，破 壁 的 方 法 主 要 有物理 法 （如 機 械 法 、超聲波處理及溫差解凍法等）、生物法（發(fā)酵破壁、酶解破壁 等）和化 學(xué) 破壁等[10]。 其中 ，酶法破 壁 條件 溫 和 、對 熱 敏 性 物 質(zhì) 破 壞 小 而 被 廣 泛 應(yīng) 用 。 董 亞 婷 等[11]利用纖維素酶和堿性蛋白酶處理蜂花粉，提取的酚類物 質(zhì) 和 其 抗 氧 化 性 都 得 到 提 高 ；高 鯤 等[12]研 究 了 復(fù)合蛋白酶酶解油菜蜂花粉，獲得最佳酶解條件為pH8、溫度 48℃、時間 48h，并對其表征進(jìn)行了分析；董 捷 等[13]研 究 了 酶 法 處 理 對 油 菜 花 粉 萌 發(fā) 孔 通 透 性的影響，發(fā)現(xiàn)復(fù)合蛋白酶+復(fù)合纖維素酶處理花粉后，萌發(fā)孔打開最明顯。很多學(xué)者關(guān)注于酶處理對花粉營養(yǎng)物質(zhì)的溶出及花粉結(jié)構(gòu)的影響，缺少工藝的研究。

因此，本文采用纖維素酶酶解破壁法對油菜蜂花粉進(jìn)行處理，用乙醇加熱回流法提取黃酮，以黃酮含量為指標(biāo)，采用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計優(yōu)選出蜂花粉破壁最優(yōu)工藝條件，并用電鏡觀察破壁前后花粉表面的構(gòu)造，為油菜蜂花粉的綜合利用提供工藝研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜蜂花粉：青海省門源縣昆珍土特產(chǎn)南貿(mào)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶（50u/mg）：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3310 型紫外分光光度計, 日本 Hitachi公司；Su1510 型電子掃描顯微鏡， 日本 Hitachi公司；RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器， 上海青浦瀘西儀器廠；DHG-924OA 鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將購置的油菜蜂花粉原料于 50℃烘箱中干燥2h，控制其水分含量在 5-10%之間，將蜂花粉研磨成粉末狀過 80 目篩，在紫外燈照射下滅菌處理，裝入干燥的磨口瓶中，置于干燥器中備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 0.005g 用80%乙醇完全溶解 （可稍加熱或使用超聲波輔助）后， 定容至于 25mL 容量瓶得到 0.2mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。 分別準(zhǔn)確吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于 25mL 比色管中， 用 80%乙醇溶液定容至 10mL， 然后向每個試管中各加入 5%亞硝酸 鈉溶 液 0.7mL，反 應(yīng) 6min，依次 加入 0.7mL10%硝酸鋁溶液，搖勻后靜止 6min，再依次加入 5mL10%氫氧化鈉溶液混合均勻， 用 80%乙醇溶液定容至25mL，靜置。 15min 后進(jìn)行掃譜，得到最大吸收峰為510nm，然后于 510nm 處測吸光度，平行 3 次。 以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度 x（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度 y 為縱坐標(biāo)，得回歸方程為 y=8.5536x-0.006，相關(guān)系數(shù) R2= 0.9990，總黃酮在 0-0.048mg/mL 濃度范圍內(nèi)與其 吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.3.3 油菜蜂花粉總黃酮酶解破壁提取液的制備

準(zhǔn)確稱取 3g 預(yù)處理樣品，按一定的料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2%的纖維素酶溶液，在特定的溫度下處理一定時間。酶解結(jié)束后，75℃熱水中滅酶 10min，冷卻后將酶解液轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中減壓抽濾。再加入80%的乙醇 60mL，80℃下回流提取 3h。 提取完畢，用與 80%乙醇反復(fù)洗滌， 定容于 100mL 容量瓶中，即得油 菜蜂花 粉 總黃酮 酶 解破壁 提 取液[14，15]。

1.3.4 油菜蜂花粉酶解破壁提取液中總黃酮含量

精 確吸 取 0.5mL 提 取 液 置 于 25mL 的 比 色 管中，用 80%乙醇稀釋到 10mL 處，加人 5%的亞硝酸鈉溶液 0.7mL，混勻，放置 6min；加入 0.7mL10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置 6min，再加入 5mL10%的氫氧化鈉溶液， 混勻， 加入 80%的乙醇溶液定容，搖勻，15min 后于波長 510nm 處測定其吸光度， 同時做 3組平行實驗，黃酮得率計算公式如（1）：

1.3.5 單因素試驗

以油菜蜂花粉總黃酮提取率為指標(biāo)，通過改變料液比、酶解溫度、酶解時間某一單因素值，分別考察料液比、酶解溫度、酶解時間對破壁提取油菜蜂花粉總黃酮提取率的影響，以確定破壁提取總黃酮的最佳條件。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化酶解法破壁提取油菜蜂花粉總黃酮的工藝

參 考 董 增[16]方 法 ， 在 單 因 素 試 驗 結(jié) 果 基 礎(chǔ) 上 采 用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計。 以-1，0，1 代表自變量水平，以油菜蜂花粉總黃酮得率為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.7 表面結(jié)構(gòu)觀察

用牙簽挑取少量處理過的蜂花粉粉末粘在貼了雙面膠的樣品臺上，用洗耳球吹去未粘附的樣品，噴金后用掃描電子顯微鏡觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對破壁提取油菜蜂花粉總黃酮提取率的影響

由圖 1 可知，當(dāng)料液比小于 1∶50 時，隨著料液比的增加，黃酮得率上升；當(dāng)料液比為 1∶50 時，黃酮得率最高；超過 1∶50 時，總黃酮得率出現(xiàn)下降。 因此，選取 1∶50 為佳。

圖1 料液比對黃酮得率的影響

2.1.2 酶解溫度對破壁提取油菜蜂花粉總黃酮提取率的影響

由圖2可知，總黃酮得率隨著溫度的升高不斷上升，但是當(dāng)溫度超過 50℃的時候得率反而下降，說明纖維素酶活性的最適溫度在 50℃左右。 因此，50℃為最適酶解溫度。

圖2 酶解溫度對黃酮得率的影響

2.1.3 酶解時間對破壁提取油菜蜂花粉總黃酮提取率的影響

由圖3可知，提取時間的延長能夠提高總黃酮的得率，但是當(dāng)提取超過 5h 時，總黃酮的得率下降。因此，選取 5h 為因素時間的中心點。

圖3 酶解時間對黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

為了使酶解破壁提取工藝更加科學(xué)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取料液比、酶解溫度、酶解時間為因素，以總黃酮得率為響應(yīng)值，根據(jù) Box-Behnken 原理設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面實驗，實驗因素水平和編碼見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表

2.2.2 二次多元回歸模型分析

表2是響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果，結(jié)果利用Design Expert 8 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析， 得到回歸方程為（2）:

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

分析結(jié)果如表 3 所示。 該模型 P＜0.0001，表明該回歸模型非常顯著；失擬項 P=0.4015＞0.05，不顯著，相關(guān)系數(shù) R2=0.9882 和調(diào)整系數(shù) Adj.R2=0.9662 也表明該回歸模型對試驗結(jié)果擬合較好，試驗誤差較小，因此該回歸模型設(shè)計與實驗結(jié)果基本一致。

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

從各個因素的顯著性水平差異可知，對油菜蜂花粉黃酮得率的影響次序為：酶解時間 X3＞酶解溫度X2＞料液比 X1。 酶解時間 X3、酶解溫度 X2、料液比 X1的二次項對總黃酮得率的影響都達(dá)到了極顯著水平（P＜0.001）；料液比 X1、酶解時間 X3的交互項 X1X3對總黃酮的得率有顯著（P＜0.05）的影響。

響應(yīng)面三維模型如圖 4 所示。 從圖 4a中可看出，料液比和酶解溫度交互作用顯著，隨著料液比的減小，總黃酮的提取率先增加再減少，溶劑的增多，能夠使溶劑和溶質(zhì)間具有較高的濃度差，利于傳質(zhì)的進(jìn)行，促進(jìn)總黃酮的溶出，但是過多的溶劑酶和底物不能夠很好的結(jié)合，并使后繼處理困難，因此，溶劑與蜂花粉的配比在合適的范圍內(nèi)才利于總黃酮的提取。同樣，總黃酮的提取率也是隨著溫度的升高，先升高再降低，這是由于酶的活性有最適的溫度，高于或低于此溫度都會使酶的活性降低。

圖4b反應(yīng)了料液比和酶解時間對于總黃酮提取的交互作用，在圖中我們可以看出，隨著時間的延長，提取率先升高后降低。 這可能是因為時間太短，酶的活性能力沒有被充分利用，而時間過長導(dǎo)致部分 酶 失 去 活 性 ，使 得 提 取 率 降 低[17]。 圖 4c 是 酶 解 溫度和酶解時間的交互作用，總黃酮的提取率隨著溫度的升高和時間的延長迅速增大，但是過高的溫度和過長的時間都會導(dǎo)致提取率的下降。

圖4 兩因素交互作用對破壁提取油菜花粉總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

2.2.3 最優(yōu)工藝條件確定及驗證

運用響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計最佳條件為： 料液比1∶50.58，恒溫 水浴溫度 49.74℃，時 間 5.62h，在此 提 取條件下，總黃酮得率的預(yù)測值為 10.348%。 考慮到實際實驗條件，將工藝條件簡化為：料液比 1∶51，溫度50℃，時間 5.6h，在此條件下重復(fù) 3 次實驗，測得黃酮 的 得 率為 （10.34±0.05）%，與 預(yù)測 值 接 近 ，表 明 該模型設(shè)計成功，該模型能夠很好的預(yù)測油菜蜂花粉總黃酮的得率。

2.3 形態(tài)分析

圖5反映蜂花粉纖維素酶處理前和處理后不同放大倍數(shù)的電鏡掃描照片對比結(jié)果。 圖（5a，5b）是酶處理前樣品不同放大倍數(shù)下的表面形態(tài)，此時花粉粒呈規(guī)則的橢圓形，萌發(fā)孔表面有覆蓋物附著而沒有顯露出來。 圖（5c，5d）是加酶處理后不同放大倍數(shù)下的花粉粒，內(nèi)部結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)出來，能夠清楚的觀察到花粉破裂顯現(xiàn)出多孔的結(jié)構(gòu)，花粉?？s小成球形，花粉內(nèi)部的營養(yǎng)物質(zhì)可以方便的溶出。因此可以得出，纖維素酶能夠很好的破壞油菜蜂花粉壁，改善細(xì)胞壁的通透性，利于內(nèi)容物的釋放。

圖5 纖維素酶處理前（5a,5b）和處理后（5c,5d）蜂花粉的掃描電鏡照片

3 結(jié) 論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化了纖維素酶破壁提取油菜蜂花粉總黃酮的工藝，最佳工藝條件為料液比 1∶51，溫度 50℃， 時間 5.6h。在此條件下， 總黃酮得率為（10.34±0.05）%，與預(yù)測值 10.348%基本一致。纖維素酶處理前后不同放大倍數(shù)油菜蜂花粉的掃描電鏡對比照片表明纖維素酶具有很好的破壁作用，改善了蜂花粉細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)其內(nèi)容物溶出，提高總黃酮得率。

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責(zé)任編輯：胡德明

Response Surface Optimization of Total Flavonoids Extracted from Rape Bee Pollen by Cellulase

Cao Yuyao,Dong Zeng,Cao Wengen
（School of Biological and Food Engineering,Suzhou University,Suzhou 234000,China）

Total flavonoids from rape bee pollen were extracted by using cellulase wall-breaking method,and with the extraction yield of total flavonoids as investigation index,the effects of solid-liquid ratio,enzyme extraction temperature,extraction time on the extraction yield of total flavonoids were discussed.The process was optimized with response surface methodology.The optimization results of RSM indicated that the extraction yield of total flavonoids was (10.34±0.05)%under the optimum processing condition with the solid-to-liquid ratio of 1:51,the temperature of 50℃ and the hydrolysis time of 5.6 h.An SEM observation of the surface of rape bee pollen before and after enzymolysis treatment indicated that cellulase played an important role in breaking walls,stimulating the release of such contents as total flavonoids and improving the extraction yield of total flavonoids.

rape bee pollen;cellulase;total flavonoids;response surface optimization

S896.4

：A

：1672-447X（2017）03-0053-05

2016-11-16

宿州區(qū)域發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心學(xué)生開放課題（2015SZXTXSKF05）

曹玉瑤(1995-)，安徽宿州人，宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，研究方向為藥物化學(xué)；

曹穩(wěn)根(1964-)，安徽東至人，宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院教授，研究方向為生物化學(xué)及天然產(chǎn)物化學(xué)。