王占軍，黃士平，歐祖蘭，徐忠東，韓久盼，余文敬

（合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥，230601）

擬南芥 WOX10 基因啟動(dòng)子的克隆與序列分析

王占軍，黃士平，歐祖蘭，徐忠東，韓久盼，余文敬

（合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥，230601）

為探索功能未知的擬南芥 WOX10 基因的表達(dá)規(guī)律，開展對(duì)擬南芥 WOX10 基因啟動(dòng)子的分子克隆及測(cè)序分析，運(yùn)用 PlantCARE 在線工具預(yù)測(cè)測(cè)序結(jié)果中可能含有的順式作用元件。結(jié)果表明，除 TATA-box 和 CAAT-box 外， 擬南芥 WOX10 基因啟動(dòng)子含有生長(zhǎng)素、 赤霉素和脫落酸等植物激素以及光信號(hào)，干旱、鹽分和壓力等脅迫相關(guān)的順式作用元件。該研究結(jié)果有益于解析擬南芥 WOX10 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律及其功能。

WOX10 基因；擬南芥；啟動(dòng)子；順式作用元件

WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX （WOX）是僅存在于植物細(xì)胞內(nèi)的一類編碼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基因 家 族[1]。 1996 年 ，Laux 等[2]利 用 EMS 誘 變 的 方 法 ，在擬南芥中克隆并鑒定出 WUS基因； 該基因編碼291 個(gè)氨基酸， 具有維持植物莖端分生組織中干細(xì)胞數(shù)量的功能。WUS 的同源異型結(jié)構(gòu)域（Homeodomain 區(qū)） 是由 66 個(gè)氨基酸殘基所構(gòu)成的特殊空間結(jié)構(gòu)（Helix 1-loop-helix 2-turn-helix 3），該 結(jié)構(gòu)及 其 特 殊 功 能 引 起 了 研 究 人 員 的 廣 泛 關(guān) 注[3]。Haecker 等[4]通 過(guò) 對(duì) 擬 南 芥 基 因 組 的 開 放 閱 讀 框（ORF）進(jìn)行同源性比對(duì)分析，共鑒定出 14 個(gè)基因的ORF 區(qū)域與 WUS 基因的 Homeodomain 區(qū)存在高度的一致性或相似性， 這些基因被命名為 WOX1-WOX14。 目前，WOX 基因家族已在擬南芥、水稻、葡萄 、高 粱 、玉 米 等 30 多 種 植 物 中 鑒 定 出 來(lái)[5]； 根 據(jù) 功能分析的結(jié)果，可將 15 個(gè)基因家族成員分為調(diào)節(jié)植物 干細(xì) 胞活動(dòng)[6]、控 制 細(xì) 胞 胚 胎發(fā)生[7]、調(diào) 節(jié) 側(cè) 生 器 官的 生 長(zhǎng) 和 發(fā) 育[8]以 及 功 能 未 知 WOX10 基 因 共 4 種類型。

啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)中重要的順式作用元件，控制著基因表達(dá)的起始時(shí)間與表達(dá)程度，是基因表 達(dá) 活性的 “開關(guān) ”[9]。 啟 動(dòng)子 一 般是位 于基因編 碼區(qū) 5'端上游的一段特殊的核苷酸序列，它包含 RNA聚合酶以及一個(gè)或多個(gè)特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié) 構(gòu) 上 通 常 包 括 核 心 啟 動(dòng) 子 元 件 （TATA-box、CAAT-box）和應(yīng)答調(diào)控元件，參與轉(zhuǎn)錄的起始與調(diào)控[10]。

鑒于擬南芥 WOX10 基因的功能目前尚未見報(bào)道， 本研究針對(duì) WOX10 基因的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆及分析，獲得該啟動(dòng)子區(qū)域基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一系列調(diào)控元件；此外，旨在基于 WOX10 基因啟動(dòng)子序列的分析結(jié)果，為進(jìn)一步研究 WOX10 基因的表達(dá)規(guī)律和基因功能提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 啟動(dòng)子序列的獲取

根 據(jù) NCBI （National Center for BiotechnologyInformation，美國(guó)國(guó)立生物 技術(shù)信息中心）公布 的 擬南芥全基因組測(cè)序結(jié)果，利用 Map Viewer 確定擬南芥 WOX10 （簡(jiǎn)寫為：AtWOX10） 基因序列的位置信息，下 載該 基因 翻 譯起始位 點(diǎn) （ATG）上 游 2000 bp的啟動(dòng)子序列（簡(jiǎn)寫為：pAtWOX10）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及方法

1.引物設(shè)計(jì)：依據(jù) pAtWOX10 核苷酸序列，使用Primer Premier v5.0 軟件設(shè)計(jì)啟動(dòng)子克隆引物，具體信息如下：pAtWOX10–F：AATAAACTAAAGATCCCTTTATTCATAAACAAAAG （從 5' 至 3' 端 ），pAt-WOX10-R：CTCCTCTTTCACCACTTTGCCTTCTC（從5'至 3'端）。

2. 利用 BioTeke 試劑盒提取擬南芥幼苗的基因組 DNA， 利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)提取 DNA 的質(zhì)量。

3. 使用 KOD 高保真酶進(jìn)行 pAtWOX10 基因啟動(dòng)子序列的 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系的總體積為 50μL，具 體 包 括 ：10 ×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo，5.0μL；2 mM dNTPs，5.0μL；25mM MgSO4，3.0μL；pAtWOX10 – F 引 物 ，1.5μL；pAtWOX10 – R 引 物 ，1.5μL；KOD-Plus-Neo 酶 1.0 μL； 擬 南 芥 DNA，3.0μL；ddH2O，30.0μL。

4.PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5min； 循環(huán)內(nèi)：94℃變 性 30sec，50℃退 火 30sec，72℃延 伸 2min，執(zhí)行 30 次循環(huán)；72℃延伸 10 min。

5.PCR 產(chǎn)物檢測(cè)：使用 1%的瓊脂糖凝膠中檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的大小及質(zhì)量。

6.膠回收及連接、轉(zhuǎn)化：針對(duì) PCR 產(chǎn)物大小與預(yù)期目標(biāo)產(chǎn)物相符的條帶進(jìn)行切膠，使用 Axygen 公司的 DNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，將膠回收產(chǎn)物加 Poly （A） 尾 處 理 后 ， 連 接 至 TaKaRa 公 司 的pMDTM19-T 載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，菌液 PCR 檢測(cè)無(wú)誤后送至上海英俊生物技術(shù)有限公司（簡(jiǎn)寫為：英俊公司）測(cè)序。

1.3 序列分析方法

運(yùn) 用 PlantCARE （http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/） 在 線 分 析 軟 件 對(duì) At-WOX10 基因啟動(dòng)子的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 AtWOX10 基因及其啟動(dòng)子的位置信息

依據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的 AtWOX10 基因及其啟動(dòng)子的相關(guān)信息，揭示 AtWOX10 基因位于擬南芥的 1 號(hào) 染色體上（如圖 1A），利 用 GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）基因結(jié)構(gòu)分析工具解析 AtWOX10基因序列后，發(fā)現(xiàn) AtWOX10 基因全長(zhǎng) 783bp，其中編 碼 區(qū) 長(zhǎng) 度 為 594bp， 含 有 3 段 外 顯 子 區(qū) 域（7184485-7184642；7184731-7185129；7185221-7185267） 和兩段內(nèi)含子區(qū)域 （7184643-7184730；7185130-7185220）（見圖 1B 和表 1）。

圖1 AtWOX10 基因在染色體上位置（A）及基因結(jié)構(gòu)（B）示意圖

表1 AtWOX10 基因及其啟動(dòng)子信息

2.2 AtWOX10 基因啟動(dòng)子的克隆

圖2 AtWOX10 基因啟動(dòng)子序列的PCR 產(chǎn)物(A)和膠回收產(chǎn)物（B）

利用具有高保真性的 KOD 聚合酶和特異性引物克隆 AtWOX10 基因的啟動(dòng)子序列， 由于 PCR 反應(yīng)體系的退火溫度較低，造成產(chǎn)物出現(xiàn)了雜帶，針對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化后， 凝膠電泳檢測(cè)的條帶單一。

2.3 AtWOX10 基因啟動(dòng)子的序列分析

英俊公司測(cè)序結(jié)果顯示， 原長(zhǎng)為 2000bp 的 At-WOX10 基因啟動(dòng)子， 實(shí)際克隆產(chǎn)物的長(zhǎng)度為 1999bp， 在 NCBI 公 布 的 AtWOX10 基 因 啟 動(dòng) 子 －1922 bp 的位置缺失 1 個(gè) A 堿基。 運(yùn)用 PlantCARE 在線工具分析 AtWOX10 基因啟動(dòng)子的測(cè)序結(jié)果，詳細(xì)信息如表 2 所示。 在 ATG 上游 500bp 長(zhǎng)度內(nèi)可能存在 4個(gè) TATA-box（－100；－240；－280；－473）、7 個(gè) CAAT-box（－163；－199；－221；－233；－249；－363；－391），具有真核生物核心啟動(dòng)子元件典型的特征，二者共同介導(dǎo)的 RNA 聚合酶參與的 WOX10 基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的起始與調(diào)控，并且在該序列的多個(gè)位點(diǎn)重復(fù)出現(xiàn)，這對(duì)于提升基因?qū)ν饨缬绊懸蛩刈兓瘧?yīng)答速度及反應(yīng)效率是必不可少的。此外，該序列還存在多種特異性的順式調(diào)控元件，包括光誘導(dǎo)應(yīng)答反應(yīng)、激素誘導(dǎo)應(yīng)答反應(yīng)、脅迫誘導(dǎo)應(yīng)答反應(yīng)以及特異性表達(dá)產(chǎn)物調(diào)控等多方面功能；其中光應(yīng)答元件共 7 種，包括 AE-box、E-box、G-box、GT-1、PIF3、SORLIP1AT 和－10 promoter element。 －10 promoter element是對(duì)藍(lán)光、白光和紫外光應(yīng)答的元件，在植物的花器官發(fā)育調(diào)控中起著重要調(diào)控作用。 激素應(yīng)答調(diào)控元件共 8 種， 包括 ARF、ASF1、AtMYB2、DPBF、GARE、MYBATRD22、TGA-element和 W-BOX，其中生長(zhǎng)素應(yīng)答元件 ARF 與赤霉素應(yīng)答元件 GARE 常在植物的根部轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用。脅迫誘導(dǎo)應(yīng)答元件共 9 種，包括 ABRE、ACGT、LTRE、MYB1AT、MYB1LEPR、MYB2、MYBRE、MYC和 SREATMSD，其中 MYB 類水分脅迫與 LTRE 低溫脅迫誘導(dǎo)元件是根部生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的調(diào)控元件。此外，還發(fā)現(xiàn)如調(diào)控花器官部位相關(guān)基因表達(dá)的應(yīng)答元件 AP1 和 MYBPLANT，根發(fā)育調(diào)控和木質(zhì)部形成相關(guān)的基因表達(dá)的應(yīng)答元件 RHERPATEXPA7 和 XYLAT，以及細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)控元件MYBCOREATCYCB1 等其他有關(guān)轉(zhuǎn)錄起始和特異性表達(dá)產(chǎn)物合成控制的應(yīng)答作用元件，針對(duì)這些表達(dá)部位明確的應(yīng)答作用元件結(jié)果進(jìn)行分析，將有利于深入解析 AtWOX10 基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律及其基因功能。

表2 AtWOX10 基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果

注 ：（－）表 示 pAtWOX10 序 列 ，（+）表 示 與 pAtWOX10 互補(bǔ)序列。

3 結(jié)論及展望

由上述 AtWOX10 基因啟動(dòng)子中相關(guān)順式作用元件分析結(jié)果可知，當(dāng)外界環(huán)境處于干旱、高鹽以及壓力等逆 境脅 迫時(shí)，AtWOX10 基因可能會(huì)被激活（MYB1LEPR、MYB1AT、SREATMSD）；也可能存在對(duì)藍(lán)色、 白色和紫外光等產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答機(jī)制（－10 promoter element）；能夠被諸如 生長(zhǎng) 素 、赤 霉素 和 脫落酸等植物生長(zhǎng)激素誘導(dǎo)表達(dá)（ARF、TGA-element、GARE、DPBF）； 同時(shí)，AtWOX10 基因啟動(dòng)子還具有一些特殊的應(yīng)答作用元件，例如花器官中基因特異性表達(dá)的因子 AP1。 綜上所述，AtWOX10 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能受到光信號(hào)，生長(zhǎng)素、赤霉素和脫落酸等植物激素以及脅迫等多種信號(hào)途徑的協(xié)同作用； 但是，At-WOX10 基因具體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律有待進(jìn)一步研究。

本文對(duì) AtWOX10 基因啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆及序列分析，但關(guān)于其表達(dá)的具體部位，真實(shí)存在哪些與其表達(dá)相關(guān)的光照、激素和溫度等因素，有待下一步通過(guò)構(gòu)建植物表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化至擬南芥中加以驗(yàn)證；同時(shí)，本研究也為 AtWOX10 基因的功能解析提供了參考信息。

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責(zé)任編輯：胡德明

The Cloning and Sequence Analysis of Promoter of WOX Gene Family in Arabidopsis thaliana

Wang Zhanjun,Huang Shiping,Ou Zulan,Xu Zhongdong,Han Jiupan,Yu Wenjing
(School of Life Sciences,Hefei Normal University,Hefei 230601,China)

In order to study the expression rule of WOX10 with unknown function in Arabidopsis thaliana,the promoter of WOX10 gene in Arabidopsis thaliana was cloned and sequenced.Cis-acting elements were predicted by PlantCARE in the promoter of AtWOX10 gene.The results showed that there were TATA-box,CAAT-box and some cis-acting elements in the promoter of AtWOX10 gene,including a variety of plant hormones like auxin,gibberellin and abscisic acid,light responsive element,and also cisacting elements related to drought,salt and stress.The results can also be useful for future studies of AtWOX10 gene in transcriptional regulation and function.

WOX10 gene;Arabidopsis thaliana;promoter;cis-acting element

Q74

：A

：1672-447X(2017）03-0058-04

2016-09-20

安徽省高校自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A186)；安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （1708085MC76）；合肥師范學(xué)院人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2013rcjj01）；合肥師范學(xué)院產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(2014cxy33)；合肥師范學(xué)院課程建設(shè)項(xiàng)目（2013hxk14）

王占軍（1984-），安徽壽縣人，合肥師范學(xué)院講師，研究方向?yàn)橹参锛?xì)胞分子生物學(xué)。