金宇林++吳潔瑩++陸琰++陳勁松+李發(fā)濤++謝閨娥++吳韶清

[摘要] 目的 觀察6.0 Gy X射線輻照對BALB/c小鼠造血系統(tǒng)的影響。 方法 將80只BALB/c小鼠隨機分為對照組和輻照組，每組各40只。用直線加速器X射線對輻照組BALB/c小鼠進行一次性全身6.0 Gy X射線照射。照射后，每天記錄小鼠體重和狀況。輻照前和輻照后1、3、5、7、14、21、28 d檢測小鼠外周血血象和骨髓有核細胞數(shù)的變化。 結(jié)果 與對照組相比，輻照組小鼠輻照后體重下降（P < 0.05），6 d后緩慢上升；外周血象中白細胞、紅細胞、血小板和血紅蛋白含量均下降（P < 0.05），分別于照射后5、14、14、14 d下降至最低值，然后回升；骨髓有核細胞數(shù)急劇下降（P < 0.05），于照射后5 d下降至最低值，而后逐漸上升。 結(jié)論 6.0 Gy X射線輻照可引起B(yǎng)ALB/c小鼠造血系統(tǒng)損傷，其機體有一定的自我修復(fù)機制。

[關(guān)鍵詞] X射線；BALB/c小鼠；外周血；骨髓有核細胞

[中圖分類號] R14 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（a）-0013-04

Dynamic detection of 6.0 Gy X-irradiation induced the hematopoietic system damage in BALB/c mice

Guangzhou Women and Children's Medical Center， Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510623， China

[Abstract] Objective To observe the effects of 6.0 Gy X-irradiation on the hematopoietic system of BALB/c mice. Methods 80 BALB/c mice were randomly divided into control and irradiated groups， each group had 40 mice. The irradiated group mice received 6.0 Gy X-total body irradiation. Body weight and life condition were noted down everyday. Peripheral blood cell counts and bone marrow nucleated cell counts were measured before irradiation and at 1， 3， 5， 7， 14， 21， 28 d after total body irradiation. Results Compared with control group mice， the body weight of irradiated group mice decreased （P < 0.05）， but slowly increased at 6 d post-irradiation. Compared with control group mice， the peripheral blood of irradiated mice had significant reduced in white blood cell， red blood cell， platelet counts and hemoglobin （P < 0.05）， they respectively decreased to the lowest value at 5， 14， 14， 14 d post-irradiation and subsequently increased slowly. Compared with control group mice， the bone marrow nucleated cell counts of irradiated mice decreased sharply to the minimum value after 5 d post-irradiation （P < 0.05）， and gradually increased. Conclusion 6.0 Gy X-irradiation can cause damage to the hemotopoietic system of BALB/c mice， and the body of mice has a certain self-repair mechanism.

[Key words] X-irradiation； BALB/c mice； Peripheral blood； Bone marrow nucleated cell

大劑量輻照能對機體產(chǎn)生一系列損傷效應(yīng)，其中細胞分裂旺盛的造血系統(tǒng)對輻射損傷非常敏感，在機體受照射早期造血系統(tǒng)即可累及，且貫穿于照射損傷的始終，具有明顯的時相性，射線所致造血功能障礙主要是由于造血干祖細胞增殖能力的抑制或喪失[1-4]。本實驗旨在研究X射線輻照對BALB/c小鼠造血系統(tǒng)的損傷，通過對血液系統(tǒng)中白細胞、紅細胞、血小板、血紅蛋白及骨髓有核細胞數(shù)量進行密切監(jiān)測，為建立造血系統(tǒng)輻射損傷小鼠模型提供新的實驗資料。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

無特定病原體級BALB/c小鼠80只，雌雄各半，8周齡，體重（20±2）g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（粵）2009-0011。輻照后的飼養(yǎng)、生長活動狀態(tài)觀察記錄、血液和骨髓標本采集均在廣東省醫(yī)學實驗動物中心完成。實驗過程中，所有動物均在同等SPF級條件下飼養(yǎng)、自由飲水和攝食。血常規(guī)檢測用Coulter-JT全自動血細胞分析儀（美國貝克曼庫爾特）。輻照用瑞典ELEKTA公司生產(chǎn)的高能醫(yī)用電子直線加速器治療機由廣東藥學院附屬第一醫(yī)院放療中心提供，型號：ELEKTA（5933）。

1.2 動物分組與處理

將BALB/c小鼠隨機分成對照組及輻照組，每組各40只。對照組進行假照射，即搬運到照射地點但不進行X線照射；輻照組小鼠接受一次性劑量為6.0 Gy的X射線全身輻照，輻照條件：能量為8 Mev，源軸距（SAD）為100 cm，劑量率設(shè)為600 cGy/min。

1.3 指標觀察

1.3.1 體重測量 輻射前和輻射后每天用電子天平稱量并記錄小鼠體重。

1.3.2 狀態(tài)觀察 輻射后每天早中晚定時觀察并記錄小鼠的生長活動狀態(tài)，包括毛發(fā)光澤度、運動活力和精神狀態(tài)。

1.3.3 血常規(guī)檢測 分別于輻照前和輻照后1、3、5、7、14、21、28 d共8個時間點，在對照組及輻照組分別隨機選擇5只小鼠，眼球后靜脈叢采集外周血100 μL，ETDA抗凝，用血細胞分析儀檢測各時間點小鼠的血常規(guī)。

1.3.4 骨髓有核細胞測定 分別于輻照前和輻照后1、3、5、7、14、21、28 d共8個時間點，取血后采用頸椎脫臼法處死小鼠，取一側(cè)股骨，去除肌肉組織，用1 mL細胞培養(yǎng)液將骨髓全部沖洗入抗凝管內(nèi)，輕輕搖晃使得細胞分散均勻，制備成骨髓單細胞懸液，分別計數(shù)每只小鼠骨髓有核細胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 X射線輻射后小鼠體重的變化

輻射組小鼠體重在輻照后先緩慢降低，在輻射后第6天達最低值，然后體重緩慢回升；輻照后的整個檢測過程中，輻照組小鼠體重始終低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 X射線輻射后小鼠生長活動狀態(tài)的變化

與對照組相比，輻照組小鼠在輻射后3 d開始出現(xiàn)不同程度的被毛稀疏，精神萎靡；輻射后6 d部分小鼠出現(xiàn)脫毛，匍匐行走，體型消瘦；輻射后10 d小鼠脫毛處開始不同程度地長出新毛，活動能力增強；輻射后20 d小鼠基本恢復(fù)至正常水平。

2.3 X射線輻射后小鼠外周血血象的變化

2.3.1 X射線輻射后小鼠白細胞的數(shù)量變化 輻照后，輻照組小鼠外周血白細胞水平急劇下降，并且持續(xù)保持較低水平；輻照后第5天，白細胞水平達到最低值；輻照后7 d白細胞水平開始逐漸緩慢上升；但是整個檢測過程中，輻照組小鼠外周血白細胞水平始終低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；在輻照后28 d未能達到完全恢復(fù)。見表2。

2.3.2 X射線輻射后小鼠紅細胞的數(shù)量變化 輻照后，輻照組小鼠紅細胞水平開始持續(xù)下降，直至輻照后14 d達最低水平，然后開始緩慢恢復(fù)。輻射組小鼠紅細胞水平始終低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3.3 X射線輻射后小鼠血小板的數(shù)量變化 輻照后，輻照組小鼠血小板數(shù)量水平開始持續(xù)下降，第14天達到最低值，然后逐步上升；與對照組比較，輻照后1、3、5、7、14、21 d，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），直至28 d恢復(fù)至初始數(shù)量，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.3.4 X射線輻射后小鼠血紅蛋白的數(shù)量變化 輻照組小鼠輻照后，血紅蛋白的變化趨勢類似紅細胞的變化，第14天達到最低值，檢測過程中，兩組小鼠血紅蛋白水平差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.4 X射線輻射后小鼠骨髓有核細胞數(shù)的變化

X射線輻照后，BALB/c小鼠骨髓有核細胞數(shù)量急劇下降，在輻照后第5天下降至最低值，之后逐漸恢復(fù)，但在28天時，仍沒有達到對照組水平。各時間點兩組小鼠骨髓有核細胞數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表3。

3 討論

目前，X射線廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域中，大大推動了生物醫(yī)學科研和臨床的發(fā)展，如用于探測干細胞歸巢的干細胞示蹤和建立移植動物模型[5-6]。臨床中，隨著醫(yī)療設(shè)備的更新?lián)Q代，原來臨床使用的輻射源60Co已被更為精密控制的X線直線加速器所代替，X射線透視與X射線CT成像技術(shù)的應(yīng)用更是挽救了成千上萬人的生命[7-8]。放射診斷與治療的新技術(shù)、新設(shè)備不斷出現(xiàn)，在提高疾病診治水平的同時，也增加了人們受電離輻射照射劑量的負擔，從而會引起對人體不同程度的輻射損傷。本研究使用高能醫(yī)用電子直線加速器治療機一次性6.0 Gy劑量全身輻照BALB/c小鼠后，通過對輻照組和對照組BALB/c小鼠血液系統(tǒng)中白細胞、紅細胞、血小板、血紅蛋白及骨髓單核細胞數(shù)量進行密切監(jiān)測，觀察輻照對BALB/c小鼠造血系統(tǒng)的損傷，為造血系統(tǒng)輻射損傷小鼠模型建立提供新的實驗資料，以期為干細胞移植修復(fù)輻射損傷后的造血系統(tǒng)研究提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

X射線產(chǎn)生的電離輻射可使機體發(fā)生生理、病理和生化等方面的改變[9]。已有研究表明，電離輻射主要通過直接作用和間接作用兩種方式對生物機體造成損害。直接作用是指電離輻射能量直接作用在生物體內(nèi)大分子上，產(chǎn)生一系列破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，降低酶類活性，甚至致使DNA單鏈或雙鏈斷裂等生物效應(yīng)。間接作用是指電離輻射能量使生物體內(nèi)的水分子生成兩個自由基OH-和H+，進而通過一系列自由基鏈式反應(yīng)，對生物體內(nèi)活性大分子造成破壞，或產(chǎn)生各種氧化能力很強的自由基和過氧化物而破壞DNA合成[10-14]。

BALB/c小鼠的胃腸道對X射線的電離輻射具有較高的敏感性[15]。輻照早期可引起小腸黏膜上皮細胞受到損傷，輻照后期會導(dǎo)致小腸的運動、分泌功能降低，其中，小腸上皮隱窩細胞對輻射損傷最為敏感，大劑量的電離輻射導(dǎo)致小腸上皮隱窩細胞分裂停止、上皮細胞被破壞以及絨毛被覆上皮剝脫[16-17]。本研究中，6.0 Gy輻照組小鼠在輻照后各檢測時間點的體重均低于對照組（P < 0.05），這與大劑量電離輻射后小鼠小腸上皮細胞受損，破壞了小鼠的胃腸道結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致BALB/c小鼠的小腸對營養(yǎng)吸收產(chǎn)生障礙，以及電離輻射對其他各相關(guān)組織器官損傷的綜合影響有關(guān)。但在輻射6 d后小鼠體重逐步增加，有一定程度的恢復(fù)趨勢，表明機體在輻射后有自我修復(fù)營養(yǎng)吸收功能能力。

造血系統(tǒng)是輻射損傷的敏感靶器官，機體受到照射后，造血祖細胞、造血干細胞以及造血微環(huán)境等都會產(chǎn)生與照射劑量相關(guān)的損傷，導(dǎo)致造血功能損害。輻射的直接損傷可加速血液系統(tǒng)細胞死亡。另外，當機體受到輻射時，在抗原刺激第一信號和第二信號的共同作用下，產(chǎn)生一系列的特異性和非特異性免疫應(yīng)答，這種持久、過強的應(yīng)答進一步加重組織細胞的損傷。高強度的輻射直接造成免疫系統(tǒng)損傷效應(yīng)，而其修復(fù)功能又不足以彌補高劑量率輻射的損傷作用，從而出現(xiàn)CD3和CD4下調(diào)，CD25、CD69和CD95上調(diào)，以及一些免疫因子（如腫瘤壞死因子、白介素等）和免疫球蛋白的變化，使細胞凋亡明顯增多。當血細胞數(shù)目下降，其抗感染、供能、止血等功能隨之下降，可對機體造成不同程度的損傷[18]。白細胞減少是輻射損傷最為經(jīng)典的指標。本研究中小鼠接受6.0 Gy X射線照射后白細胞急劇下降，而且恢復(fù)緩慢，紅細胞、血紅蛋白、血小板也有下降但沒有白細胞顯著，同時恢復(fù)也比白細胞快。同國內(nèi)路璐等[19]報道的小鼠電離輻照后，血小板下降快，恢復(fù)慢不一致，可能是小鼠品種和射線種類不同所致。

骨髓對輻射高度敏感，輻射引起骨髓損傷必將導(dǎo)致骨髓造血細胞的變化。骨髓是主要的造血組織，骨髓有核細胞水平在一定程度上反映了骨髓造血能力。骨髓中的造血干細胞對輻照具有較高的敏感性，這些細胞絕大部分存在于骨髓組織內(nèi)，少量存在于外周血循環(huán)中，具有高度自我復(fù)制及多向分化潛能，可維持重建造血功能[20]。射線照射既能降低造血干細胞的數(shù)量，引起骨髓儲備力下降，削弱宿主的免疫功能，阻斷有絲分裂，抑制細胞增殖，又能對組成造血微環(huán)境的血竇、內(nèi)皮細胞、外膜網(wǎng)狀細胞及吞噬細胞造成損傷，呈現(xiàn)細胞器腫脹、變形等超微結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致造血干細胞出現(xiàn)缺陷，使自身復(fù)制的速率低于分化率，進而影響紅細胞、白細胞及血小板的生成，誘發(fā)再生障礙性貧血。造血功能障礙是輻射損傷的主要表現(xiàn)之一，放射性骨髓損傷常導(dǎo)致骨髓抑制，造血功能衰竭，外周血細胞下降，導(dǎo)致生物體抗感染能力下降，明顯出血、乏力、代謝紊亂等癥狀[21]。本研究中，輻照后，骨髓有核細胞數(shù)量急劇下降，導(dǎo)致血細胞數(shù)量的下降，5 d后骨髓有核細胞數(shù)量回升，是機體自我修復(fù)的結(jié)果，也是產(chǎn)生各種血細胞的前提條件。

綜上所述，本研究動態(tài)觀察了輻射損傷后BALB/c小鼠的體重、外周血血象和骨髓有核細胞數(shù)的變化以及其生活狀態(tài)，X射線輻照對小鼠外周血象、骨髓細胞均造成了損傷，具有一定的時間效應(yīng)關(guān)系，研究結(jié)果豐富了造血系統(tǒng)輻照損傷研究的實驗資料。

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（收稿日期：2016-12-30 本文編輯：程 銘）