李 娟，齊俊生，王 婷，毛 倩，韓 超，李燕軍,2

(1. 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

IPTG添加時(shí)機(jī)對(duì)大腸桿菌產(chǎn)α-酮基丁酸的影響

李 娟1，齊俊生1，王 婷1，毛 倩1，韓 超1，李燕軍1,2

(1. 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

探究IPTG不同添加時(shí)間對(duì)大腸桿菌EscherichiacoliTHRD/pWSK29-ilvA發(fā)酵生產(chǎn)α-酮基丁酸菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)酸、代謝副產(chǎn)物和耗糖的影響.搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明：在菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，菌體OD600值為10～15時(shí)，添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，菌體生物量相對(duì)較高為6.5 g/L，α-酮基丁酸積累量最高達(dá)到16 g/L，同時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率較其他誘導(dǎo)時(shí)間高，且副產(chǎn)物乙酸含量明顯降低.利用7.5 L發(fā)酵罐對(duì)此誘導(dǎo)條件進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，α-酮基丁酸質(zhì)量濃度為22 g/L，高于已有報(bào)道中8 g/L的生產(chǎn)水平.

IPTG；誘導(dǎo)時(shí)機(jī)；α-酮基丁酸；產(chǎn)量

α-酮基丁酸(α-Ketobutyric acid，αKB)又稱2-氧代丁酸，是多種化合物合成的前體物質(zhì)，如1-丙醇、正丁醇、2-羥基丁酸、保洛霉素和呋喃酮.由于α-酮基丁酸可以轉(zhuǎn)化成丙酮酸，因此可以廣泛用于生物和醫(yī)藥行業(yè)，此外還可以作為食品添加劑等[1-2].目前α-酮基丁酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和酶催化法.這些生產(chǎn)方法的缺點(diǎn)包括反應(yīng)條件復(fù)雜、能量消耗過(guò)大和底物成本過(guò)高等.在大腸桿菌代謝途徑中，菌體利用葡萄糖經(jīng)過(guò)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)生成L-草酰乙酸，然后又經(jīng)蘇氨酸途徑生成蘇氨酸，而在有氧條件下由ilvA基因編碼的蘇氨酸脫水酶可直接催化蘇氨酸生成α-酮基丁酸[3].α-酮基丁酸作為微生物代謝的中間代謝產(chǎn)物，利用代謝工程改造，可以達(dá)到積累α-酮基丁酸的效果.

以蘇氨酸高產(chǎn)菌株大腸桿菌EscherichiacoliTHRD作為出發(fā)菌株，通過(guò)載體pWSK29過(guò)表達(dá)編碼蘇氨酸脫水酶的基因ilvA，使得蘇氨酸在蘇氨酸脫水酶的催化下，大量合成α-酮基丁酸.但是，大量發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明，α-酮基丁酸確實(shí)存在很強(qiáng)的毒性作用[4]，即高質(zhì)量濃度(≥8 g/L)的α-酮基丁酸對(duì)大腸桿菌菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成存在嚴(yán)重的抑制作用，當(dāng)產(chǎn)物α-酮基丁酸積累到一定濃度時(shí)，菌體生物量便不會(huì)增加，產(chǎn)物的生成速率也明顯降低，而且在之后的發(fā)酵過(guò)程中，伴隨著α-酮基丁酸的抑制作用逐漸加強(qiáng)，產(chǎn)酸速率會(huì)越低.為了在α-酮基丁酸發(fā)酵過(guò)程中獲得較高的菌體生物量，適當(dāng)?shù)卦黾忧绑w物蘇氨酸的合成量，選擇合適的時(shí)間段添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)具有非常重要的作用.針對(duì)有毒產(chǎn)物的積累，將菌體的快速生長(zhǎng)期和蛋白合成期分隔開(kāi)，使這兩個(gè)階段互不影響，同時(shí)保證在產(chǎn)物積累到高濃度時(shí)受到的抑制作用減弱或阻斷代謝途徑之前維持前體物蘇氨酸含量在較高水平，才能盡可能多的合成α-酮基丁酸.因此，針對(duì)含有誘導(dǎo)型表達(dá)載體的生產(chǎn)菌株，利用發(fā)酵法生產(chǎn)有毒產(chǎn)物α-酮基丁酸時(shí)，確定合適的誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)提高其產(chǎn)量具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 菌 株

采用L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株大腸桿菌E.coliTHRD作為出發(fā)菌株[5]，菌株保藏于天津科技大學(xué)菌種保藏中心，保藏號(hào)為TCCC11825，將包含蘇氨酸脫水酶基因ilvA的表達(dá)質(zhì)粒pWSK29轉(zhuǎn)入E.coliTHRD，最終得到一株α-酮基丁酸工程菌.

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH為6.7～7.0，121 ℃濕熱滅菌20 min.

種子培養(yǎng)基：蔗糖25 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨6 g/L，KH2PO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VB11.3 mg/L，VH0.3 mg/L，pH為6.7～7.0，121 ℃濕熱滅菌20 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉2 g/L，蛋白胨4 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 100 mg/L，MnSO4·H2O 100 mg/L，VB10.8 mg/L，VH0.2 mg/L，pH為6.7～7.0，消泡劑2～3滴，苯酚紅2%(體積分?jǐn)?shù))，115 ℃滅菌15 min.

1.3 培養(yǎng)方法

活化斜面培養(yǎng)：將保藏菌種劃線接種于Ampr活化斜面，37 ℃培養(yǎng)16 h左右.

30 mL搖瓶培養(yǎng)：從新鮮活化斜面上挑取1環(huán)大腸桿菌菌體于種子培養(yǎng)基中，500 mL圓底三角瓶裝液量30 mL，9層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床，200 r/min，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為12～14時(shí)，按體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，500 mL擋板三角瓶裝液量30 mL(發(fā)酵期間根據(jù)指示劑苯酚紅顏色變化，用氨水調(diào)節(jié)pH≈7.0).

7.5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：吸取適量滅菌的去離子水于4 支新鮮的活化斜面中，刮下斜面表面濕菌體，將所有菌體懸液接入7.5 L發(fā)酵罐(裝液量為2 L)中.種子培養(yǎng)初始通氣量1 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，通過(guò)增加通氣量和提高轉(zhuǎn)速使溶氧維持在30%～50%.通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH≈7.0，培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)至OD600為12～14時(shí)，按10%接種量棄掉多余的種子液，接入新的發(fā)酵培養(yǎng)基，開(kāi)始恒溫發(fā)酵培養(yǎng).發(fā)酵過(guò)程通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH≈7.0，溶氧控制在30%～50%.當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降至一定值時(shí)，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的葡萄糖溶液以一定脈沖速度流加至培養(yǎng)基中以維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在菌體所需濃度范圍內(nèi)(殘?zhí)强刂啤? g/L).

1.4 IPTG添加時(shí)間的選擇

IPTG添加時(shí)間為菌體生長(zhǎng)到某個(gè)階段時(shí)，添加誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)的具體時(shí)間點(diǎn).首先繪制α-酮基丁酸生產(chǎn)菌株THRD/pWSK29-ilvA隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線，根據(jù)生長(zhǎng)曲線選取發(fā)酵過(guò)程中OD600值分別為0(發(fā)酵0 h)，0.2，0.6，1.0，2.0，4.0，6.0，9.0，12，16，20時(shí)添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，以不添加IPTG誘導(dǎo)為對(duì)照組(CK)，在37 ℃，200 r/min的條件下恒溫發(fā)酵28 h，取樣品進(jìn)行處理，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中的蘇氨酸、α-酮基丁酸和乙酸含量，并進(jìn)行對(duì)比分析.

1.5 分析方法

菌體生物量(g/L)：菌體生物量以菌體干重表示，取生長(zhǎng)到不同OD600值的發(fā)酵液20 mL，8 000 r/min離心10 min，將菌體用蒸餾水吹懸洗滌2 次后置于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，再用分析天平稱重，其中菌體OD600值利用752紫外分光光度計(jì)測(cè)定.

α-酮基丁酸、乙酸質(zhì)量濃度(g/L)：采用高效液相分析系統(tǒng)測(cè)定.色譜分離條件：AminexRHPX-87H(300 mm×7.8 mm)，5 mmol/L H2SO4等梯度洗脫，流動(dòng)相流速為0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm.

L-蘇氨酸質(zhì)量濃度(g/L)：采用高效液相分析系統(tǒng)測(cè)定.色譜分離條件：Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，2,4-二硝基氟苯柱前衍生，乙腈和NaAc溶液進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為1 mL/min，柱溫33 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm.

糖酸轉(zhuǎn)化率w計(jì)算公式為

式中：A為發(fā)酵液含α-酮基丁酸總量，g；P為發(fā)酵過(guò)程中投放總糖量，g；P0為發(fā)酵液殘?zhí)橇?，g.殘?zhí)荘0采用SBA-40C生物傳感分析儀測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒pWSK29-ilvA的構(gòu)建

首先以E. coliMG1655基因組中蘇氨酸脫水酶ilvA的基因序列為模板，采用Primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出ilvA片段，乙醇沉淀法回收產(chǎn)物.再經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI分別雙酶切回收ilvA片段和質(zhì)粒pWSK29，經(jīng)SolutionI在16 ℃條件下連接過(guò)夜，連接體系化轉(zhuǎn)入E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)菌落PCR和單雙酶切驗(yàn)證后利用試劑盒提取質(zhì)粒pWSK29-ilvA，結(jié)果如圖1所示.

M—Marker；1—重組質(zhì)粒pWSK29-ilvA；2—Xba I單酶切；3—BamH I和Xba I雙酶切pWSK29-ilvA圖1 重組質(zhì)粒pWSK29-ilvA的單雙酶切驗(yàn)證Fig.1 Single and double digestion digistion of pWSK29-ilvA

XbaI和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pWSK29-ilvA后，分別在約5 300 bp和1 500 bp處有目的條帶，其中大片段與空質(zhì)粒pWSK29(5 343 bp)大小一致，小片段條帶與目的基因ilvA(1 545 bp)大小一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符，表明重組質(zhì)粒pWSK29-ilvA構(gòu)建成功.以重組質(zhì)粒為模板，用pWSK29的鑒定引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增出DNA片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示與E.coliTHRD基因組上ilvA基因序列一致，表明未發(fā)生突變.再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliTHRD中進(jìn)行一系列搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證.

2.2 IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的選擇

發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明，產(chǎn)物α-酮基丁酸對(duì)菌株本身存在很強(qiáng)的毒性作用，即高質(zhì)量濃度(≥8 g/L)的α-酮基丁酸對(duì)大腸桿菌菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成具有嚴(yán)重的抑制作用，圖2為生產(chǎn)菌株E.coliTHRD/pWSK29-ilvA在α-酮基丁酸質(zhì)量濃度梯度下的生長(zhǎng)曲線(LB培養(yǎng)基)，可知α-酮基丁酸質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)，菌體質(zhì)量濃度明顯降低，α-酮基丁酸質(zhì)量濃度高于10 g/L，菌體基本不能正常生長(zhǎng)，初步確定了生產(chǎn)菌株對(duì)α-酮基丁酸的耐受能力.

圖2 α-酮基丁酸濃度梯度下生產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of strain produced under the concentration gradient of α-ketobutyric acid

圖3為α-酮基丁酸生產(chǎn)菌株在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)曲線，可知在發(fā)酵4 h后，菌體開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，持續(xù)到16 h菌體濃度達(dá)到穩(wěn)定值.選擇在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期開(kāi)始誘導(dǎo)，將菌體的快速生長(zhǎng)期和蛋白合成期分隔開(kāi)，初步確定誘導(dǎo)時(shí)的OD600值為2～16，即處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并最終選擇OD600值分別為0(即發(fā)酵0 h)，0.2，0.6，1.0，2.0，4.0，6.0，9.0，12，16，20時(shí)作為添加誘導(dǎo)劑的具體時(shí)間點(diǎn).

圖3 生產(chǎn)菌株THRD/pWSK29-ilvA的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of strain THRD/pWSK29-ilvA

2.3 IPTG添加時(shí)間對(duì)菌體生物量的影響

通過(guò)對(duì)菌株耐受α-酮基丁酸能力的測(cè)定，明確了當(dāng)α-酮基丁酸積累到一定濃度時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響菌體的生物量，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最佳的誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)，在增加菌體生物量的基礎(chǔ)上同時(shí)提高生產(chǎn)菌株的α-酮基丁酸積累量.

搖瓶發(fā)酵28 h，不同誘導(dǎo)時(shí)間(以O(shè)D600表示)生產(chǎn)菌株的菌體生物量見(jiàn)圖4，用菌體干重表示生物量.同對(duì)照組(CK, 未誘導(dǎo))相比，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始誘導(dǎo)的菌體生物量只達(dá)到其50%左右，說(shuō)明菌體生長(zhǎng)明顯受到了抑制，結(jié)合這個(gè)時(shí)間段α-酮基丁酸的積累量達(dá)到10～16 g/L，可知不進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，菌株能夠正常生長(zhǎng)，干重達(dá)到10 g/L，開(kāi)始誘導(dǎo)后，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的逐步延遲，菌體干重呈現(xiàn)小幅度的增加.如果在穩(wěn)定期開(kāi)始誘導(dǎo)，雖然誘導(dǎo)之前菌體已經(jīng)達(dá)到很高的生物量，但是穩(wěn)定期內(nèi)菌體生長(zhǎng)和代謝所需酶系的活力已經(jīng)大大降低，并不利于產(chǎn)物α-酮基丁酸的積累.

圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間(以O(shè)D600表示)菌體的最大生物量 Fig.4 The maximum cells biomass of the different induction times

2.4 IPTG添加時(shí)間對(duì)α-酮基丁酸積累量的影響

豐寧的鄉(xiāng)村旅游發(fā)展，應(yīng)堅(jiān)持“文旅結(jié)合、農(nóng)旅聯(lián)姻，構(gòu)建文、旅、農(nóng)三位一體的發(fā)展模式”。鄉(xiāng)村旅游自身的產(chǎn)業(yè)附加性決定鄉(xiāng)村旅游與鄉(xiāng)村文化、鄉(xiāng)村農(nóng)業(yè)具有天然的產(chǎn)業(yè)融合優(yōu)勢(shì)。豐寧縣內(nèi)山青水秀、村莊錯(cuò)落有致，呈現(xiàn)恬靜、怡然的鄉(xiāng)村風(fēng)貌，鄉(xiāng)村民俗文化豐富多彩。農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)較好，已經(jīng)培育形成黃旗小米、莜面、食用菌等特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)。豐寧縣旅游產(chǎn)業(yè)規(guī)劃發(fā)展要緊密結(jié)合鄉(xiāng)村文化與農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)，形成文旅結(jié)合、農(nóng)旅聯(lián)姻，構(gòu)建文、旅、農(nóng)三位一體的發(fā)展模式，保障旅游產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

α-酮基丁酸是一種對(duì)菌體生長(zhǎng)和自身積累都有明顯抑制作用的發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)酵過(guò)程中，如果不經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)，菌體細(xì)胞利用葡萄糖經(jīng)過(guò)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)生成草酰乙酸，進(jìn)而經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)合成L-蘇氨酸[9]，由于染色體上ilvA表達(dá)量相對(duì)較低，所以只有L-蘇氨酸的大量合成，基本沒(méi)有α-酮基丁酸的積累.一旦加入IPTG啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，蘇氨酸脫水酶開(kāi)始大量表達(dá)，α-酮基丁酸實(shí)現(xiàn)積累并開(kāi)始抑制菌體生長(zhǎng)，同時(shí)還對(duì)蘇氨酸途徑中一種或幾種酶系產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用，最直觀的表現(xiàn)就是L-蘇氨酸合成量嚴(yán)重降低，前體物合成受阻最終導(dǎo)致α-酮基丁酸產(chǎn)量不高.

由圖5可知：不加IPTG誘導(dǎo)時(shí)，CK組α-酮基丁酸積累量為0 g/L，在菌體OD600值較低時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)(OD600≤1)，由于正處于延滯期，菌體剛開(kāi)始生長(zhǎng)，蛋白表達(dá)量較低，所以在此階段誘導(dǎo)，α-酮基丁酸積累量不高且變化量不大；進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體代謝旺盛，隨著前體物L(fēng)-蘇氨酸合成量增加，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延遲誘導(dǎo)時(shí)間，α-酮基丁酸的積累量呈遞增趨勢(shì)，如果選擇在對(duì)數(shù)中后期誘導(dǎo)，即菌體OD600值約為12時(shí)，α-酮基丁酸產(chǎn)量最高可達(dá)16 g/L.另外，當(dāng)菌體量達(dá)到最大值時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，由于L-蘇氨酸濃度過(guò)高也會(huì)對(duì)菌體代謝產(chǎn)生一定抑制作用，且此時(shí)細(xì)胞活力已經(jīng)嚴(yán)重降低，所以L-蘇氨酸生成α-酮基丁酸的轉(zhuǎn)化效率較低.

圖5 不同誘導(dǎo)時(shí)間(以O(shè)D600表示)α-酮基丁酸的積累量 Fig.5 The amount of accumulation of α-ketobutyric acid at different induction times

2.5 IPTG添加時(shí)間對(duì)L-蘇氨酸積累量的影響

L-蘇氨酸為菌體細(xì)胞利用葡萄糖發(fā)酵合成α-酮基丁酸的直接前體物[7-8]，理論上，在菌體細(xì)胞具有相當(dāng)酶活力的基礎(chǔ)上，通過(guò)增加前體物蘇氨酸的量能提高α-酮基丁酸的積累量.因?yàn)楦邼舛圈?酮基丁酸會(huì)嚴(yán)重抑制蘇氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶的活力，導(dǎo)致L-蘇氨酸合成受阻，所以需要延遲誘導(dǎo)時(shí)間，保證蘇氨酸積累到一定量才開(kāi)始誘導(dǎo)，這樣即使L-蘇氨酸合成速率減慢，但合成的蘇氨酸量在細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)維持在較高水平.若此時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，在活性較高的蘇氨酸脫水酶催化下，L-蘇氨酸會(huì)源源不斷地轉(zhuǎn)化為α-酮基丁酸，一定程度上彌補(bǔ)了因關(guān)鍵酶受到抑制而導(dǎo)致的L-蘇氨酸合成量的不足.

分析圖6可知：不添加IPTG誘導(dǎo)，蘇氨酸高產(chǎn)菌株THRD的L-蘇氨酸積累量高達(dá)32 g/L；經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后，可以看出蘇氨酸基本全部被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物α-酮基丁酸；而當(dāng)OD600值為9～16時(shí)，前體物蘇氨酸稍有富余，質(zhì)量濃度約為2 g/L.這說(shuō)明蘇氨酸脫水酶的酶活力非常高，蘇氨酸生成量決定了α-酮基丁酸的積累量，后期可以考慮繼續(xù)增加L-蘇氨酸的積累量，比如通過(guò)誘變手段解除α-酮基丁酸對(duì)蘇氨酸途徑的抑制作用，或是改造L-蘇氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)前體物蘇氨酸的合成量進(jìn)而提高α-酮基丁酸的積累量.

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間(以O(shè)D600表示)L-蘇氨酸的積累量Fig.6 The amount of accumulation of L-Threonine at different induction times

2.6 IPTG添加時(shí)間對(duì)副產(chǎn)物乙酸的影響

乙酸是大腸桿菌高密度培養(yǎng)過(guò)程中主要的抑制性代謝副產(chǎn)物，發(fā)酵過(guò)程中乙酸的過(guò)多積累會(huì)導(dǎo)致菌體過(guò)早衰老、自溶、比活性降低.高濃度的乙酸會(huì)減緩菌體生長(zhǎng)速率，很大程度上降低發(fā)酵過(guò)程中的菌體生物量，也是影響重組蛋白表達(dá)的重要因素[11].

圖7 不同誘導(dǎo)時(shí)間(以O(shè)D600表示)乙酸的積累量 Fig.7 The amount of accumulation of acetic acid at different induction times

2.7 IPTG添加時(shí)間對(duì)糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)生產(chǎn)菌株的α-酮基丁酸積累量、葡萄糖總投放量和發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇坑?jì)算出每組的糖酸轉(zhuǎn)化率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示.

由圖8可知：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期開(kāi)始誘導(dǎo)，發(fā)酵結(jié)束后生產(chǎn)菌的糖酸轉(zhuǎn)化率明顯較高，OD600=12時(shí)達(dá)到18%左右.綜合分析可知，因?yàn)镺D600=12實(shí)驗(yàn)組的菌體生物量和α-酮基丁酸積累量最高，而副產(chǎn)物乙酸含量最低，且代謝途徑受到嚴(yán)重抑制時(shí)，前體物蘇氨酸仍稍有富余，在實(shí)際耗糖量差別不明顯的前提下，本組實(shí)驗(yàn)糖酸轉(zhuǎn)化率最高是正常的.

圖8 不同誘導(dǎo)時(shí)間(以O(shè)D600表示)的糖酸轉(zhuǎn)化率Fig.8 Sugar acid conversion rate at different induction times

2.8 7.5 L發(fā)酵罐驗(yàn)證最適誘導(dǎo)時(shí)間

通過(guò)搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析不同的IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)α-酮基丁酸生產(chǎn)菌株生長(zhǎng)、產(chǎn)酸、副產(chǎn)物乙酸和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響，初步確定菌體生長(zhǎng)到OD600值為12時(shí)為最佳的誘導(dǎo)時(shí)機(jī).最后根據(jù)搖瓶發(fā)酵條件在7.5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行驗(yàn)證，即37 ℃恒溫發(fā)酵培養(yǎng)到菌體OD600值為12時(shí)添加終濃度為0.2 mmoL/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)增加通風(fēng)量和提高轉(zhuǎn)速使溶氧維持在30%～50%，pH為6.7～7.0，每隔1 h取樣檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)直至28 h發(fā)酵結(jié)束.

從圖9可以看出：未誘導(dǎo)的前4 h蘇氨酸合成量不斷增加，菌體生物量也在快速增長(zhǎng)，而基本不積累α-酮基丁酸；當(dāng)菌體生長(zhǎng)到OD600值為12時(shí)，即菌體干重為5 g/L左右時(shí)添加終濃度為0.2 mmoL/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，α-酮基丁酸開(kāi)始不斷積累，此后發(fā)酵液中蘇氨酸的總量開(kāi)始降低；隨著α-酮基丁酸濃度升高到一定值，對(duì)菌體的毒害作用明顯顯現(xiàn)出來(lái)，菌體量達(dá)到穩(wěn)定值，α-酮基丁酸生成速率明顯減緩，導(dǎo)致發(fā)酵最后10 h α-酮基丁酸產(chǎn)量基本沒(méi)有太大變化，直到后期菌體開(kāi)始衰亡.此次利用THRD/pWSK29-ilvA菌株上罐發(fā)酵，α-酮基丁酸積累量可達(dá)22 g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前報(bào)道中8 g/L的生產(chǎn)水平.

圖9 生產(chǎn)菌株E. coli THRD/pWSK29-ilvA7.5 L罐發(fā)酵過(guò)程曲線 Fig.9 7.5 L fermentation process curve of E. coli THRD/pWSK29-ilvA

3 結(jié) 論

大腸桿菌利用葡萄糖經(jīng)糖酵解等途徑可以直接代謝生成α-酮基丁酸，但是在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)α-酮基丁酸積累量較低(8 g/L)，其根本原因是α-酮基丁酸嚴(yán)重的毒性作用導(dǎo)致菌體生物量太低，發(fā)酵結(jié)束菌體干重大約只有6.5 g/L，而且經(jīng)過(guò)大量發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)α-酮基丁酸很可能抑制了蘇氨酸代謝途徑中的某一步酶促反應(yīng)，代謝通路被減弱或阻斷導(dǎo)致前體物蘇氨酸合成受阻，最終的結(jié)果表現(xiàn)為α-酮基丁酸積累量偏低.筆者從誘導(dǎo)劑IPTG添加時(shí)間方面入手，了解生產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)狀況，確定了IPTG具體添加時(shí)間為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期即OD600=12，將菌體的快速生長(zhǎng)期和蛋白合成期分隔開(kāi)，使這兩個(gè)階段互不影響，盡可能多地合成α-酮基丁酸.同時(shí)，間接解決前體物蘇氨酸不足的問(wèn)題，α-酮基丁酸在誘導(dǎo)后便開(kāi)始積累，當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)會(huì)抑制蘇氨酸合成的關(guān)鍵酶，所以適當(dāng)延遲誘導(dǎo)時(shí)間，使得蘇氨酸合成途徑在受到嚴(yán)重抑制之前，前體物蘇氨酸含量積累到較高水平才開(kāi)始添加IPTG，但是誘導(dǎo)時(shí)間又不能太遲，否則細(xì)胞內(nèi)各種酶系活力降低菌體開(kāi)始衰亡，而且發(fā)酵周期過(guò)長(zhǎng)使生產(chǎn)成本壓力過(guò)大.因此，利用發(fā)酵實(shí)驗(yàn)確定合適的IPTG添加時(shí)間對(duì)提高α-酮基丁酸積累量有重大意義.經(jīng)搖瓶實(shí)驗(yàn)確定了α-酮基丁酸生產(chǎn)菌株生長(zhǎng)到OD600值為12時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，菌體生物量能夠達(dá)到相對(duì)較高值，乙酸較其他誘導(dǎo)時(shí)機(jī)含量更低，同時(shí)在菌體OD600值為12時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，糖酸轉(zhuǎn)化率明顯最高，更重要的是利用7.5 L罐進(jìn)行發(fā)酵，α-酮基丁酸積累量高達(dá)22 g/L.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Effects of IPTG addition time on fermentation of α-ketobutyric acid inEscherichiacoli

LI Juan1, QI Junsheng1, WANG Ting1, MAO Qian1, HAN Chao1, LI Yanjun1,2

(1.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China)

The study investigated the effect of IPTG addition time on the α-ketobutyric acid producing strainEscherichiacoliTHRD/pWSK29-ilvAin the aspects of cell growth, productivity, byproducts formation and sugar consumption. The results indicated that when IPTG was supplemented after theOD600reached 10 to 15, the biomass reached as high as 6.5 g/L with the titer of α-ketobutyric acid 16 g/L. The glucose/acid conversion ratio was the highest compared to other groups with different IPTG addition time, and the acetic acid concentration decreased significantly. The optimized IPTG induction time was applied in a 7.5 L fermentor, and the results showed that the titer of α-ketobutyric acid reached 22 g/L, higher than previously reported results.

IPTG; induction time; α-ketobutyric acid; production

2016-05-03

李 娟(1992—)，女，湖北襄陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)楣劝彼岚魲U菌色氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建，E-mail：2546922910@qq.com.

TQ922

A

1674-2214(2017)02-0077-06