楊 波，許 韋，賈東旭，金利群

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

生物法制備木糖醇的研究進(jìn)展

楊 波，許 韋，賈東旭，金利群

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

木糖醇是一種存在于自然的五碳糖醇，在醫(yī)藥、食品和化工等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用.目前，工業(yè)上制備木糖醇的方法主要是化學(xué)加氫法，生物法制備木糖醇具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)勢，已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注.對微生物發(fā)酵法和酶催化法制備木糖醇以及制備過程中所涉及到的一些方法進(jìn)行了綜述，并對未來在提高木糖醇產(chǎn)量方面的一些著手點(diǎn)進(jìn)行展望.

木糖醇；生物法；木糖還原酶

木糖醇是一種天然存在的五碳糖醇(分子式C5H12O5，相對分子質(zhì)量152.15)，廣泛存在于草莓、李子和梨等水果中，但是含量較低[1].2004年，木糖醇被美國能源部門列為12種最重要的來源于生物質(zhì)的基礎(chǔ)化學(xué)物質(zhì)之一.木糖醇廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)和化工等領(lǐng)域.木糖醇的甜度與蔗糖相當(dāng)，但其口感清涼，且不會引起齲齒，可用于制作口香糖[2-4].木糖醇作為一種功能性甜味劑，能夠參與人體的糖代謝，無需胰島素的促進(jìn)，也能透過細(xì)胞膜，為人體吸收利用.有學(xué)者通過臨床研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射木糖醇不會引起血糖值升高，卻可以刺激胰島素的分泌[5].木糖醇具有五個羥基，因此可以代替甘油和食用油制備合成油漆的重要原料——醇酸樹脂.木糖醇還可以與牙膏中的氟化物和中草藥混合使用，起到預(yù)防齲齒及保護(hù)牙齦的作用.

目前，木糖醇的生產(chǎn)方法主要有固液萃取法、化學(xué)加氫法及生物法.由于天然果蔬中的木糖醇含量較低，因此利用固液萃取法生產(chǎn)木糖醇困難且不經(jīng)濟(jì)，目前已很少被采用.化學(xué)加氫法是目前工業(yè)上制備木糖醇最常用的方法，但是這種方法需要在苛刻的條件下對純木糖進(jìn)行化學(xué)加氫，且得率僅有50%～60%[6-7].在整個制備過程中需要進(jìn)行多步分離純化，大大地增加了生產(chǎn)成本.而生物法具有反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境無污染和無需多步分離純化等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景，目前已經(jīng)受到廣泛的關(guān)注.生物法又可分為微生物發(fā)酵法及酶催化法：微生物發(fā)酵法主要是利用微生物在一定的條件下代謝底物生成產(chǎn)物的方法；酶催化法即利用木糖還原酶直接將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇.

1 微生物發(fā)酵法制備木糖醇

目前的研究主要集中在微生物發(fā)酵法，通過優(yōu)化發(fā)酵過程來提高木糖醇產(chǎn)量的方法主要可以概括為以下三點(diǎn).

1.1 通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基提高木糖醇的產(chǎn)量

培養(yǎng)基的成份對菌體的生長及代謝具有重要影響，Ling等[8]以玉米芯半纖維素水解液為底物，以CandidatropicalisHDY-02為生產(chǎn)菌株，利用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選出重要變量KH2PO4、酵母粉、(NH4)2SO4和MgSO4·7H2O，再通過中心組合設(shè)計(jì)法(CCD)確定重要變量的最佳水平.結(jié)果表明：酵母粉和MgSO4·7H2O對木糖醇產(chǎn)量影響較大，優(yōu)化后的培養(yǎng)基成份為5 g/L (NH4)2SO4，1.3 g/L KH2PO4，4.6 g/L酵母粉和0.6 g/L MgSO4·7H2O.在該條件下，連續(xù)補(bǔ)料的分批發(fā)酵可產(chǎn)生58 g/L的木糖醇，木糖轉(zhuǎn)化率為73%.

輔助底物的添加可以實(shí)現(xiàn)菌體生長發(fā)酵過程中輔酶NAD(P)H的再生，但是不同輔助底物對于菌體代謝生成產(chǎn)物的促進(jìn)作用是不一樣的，因此，Hernández-Pérez等[9]分別研究麥芽糖、蔗糖和纖維二糖作為輔助底物對CandidaguilliermondiiFTI 20037產(chǎn)木糖醇的影響.結(jié)果表明：補(bǔ)充蔗糖(10 g/L)會使木糖的吸收率(1.11 g/(L·h))、木糖醇的終質(zhì)量濃度(36.11 g/L)及時空產(chǎn)率(0.75 g/(L·h))分別增加8.88%，12.88%和8.69%.

發(fā)酵過程中，底物或產(chǎn)物的濃度過高會對生產(chǎn)菌株產(chǎn)生抑制作用，因此，將發(fā)酵液中的底物或產(chǎn)物濃度控制在合適的范圍內(nèi)對提高菌株的發(fā)酵性能至關(guān)重要.Kim等[10]利用CandidatropicalisATCC 13803，研究木糖和木糖醇濃度對木糖醇產(chǎn)率的影響，最終發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中木糖質(zhì)量濃度為100 g/L，木糖與木糖醇的總質(zhì)量濃度少于200 g/L為最適條件，木糖醇的質(zhì)量濃度達(dá)到187 g/L，產(chǎn)率為75%，時空產(chǎn)率為3.9 g/(L·h).細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵也是防止底物或產(chǎn)物抑制的一種有效方法，由于其具備高的細(xì)胞濃度，可以縮短發(fā)酵時間，提高底物消耗速率.Kwon等[11]設(shè)計(jì)了一種帶有吸入壓力和空氣噴射功能的浸沒式膜生物反應(yīng)器，以C.tropicalisKCTC 10457為菌種進(jìn)行細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng).在每一批細(xì)胞發(fā)酵中，產(chǎn)生的平均木糖醇質(zhì)量濃度及時空產(chǎn)率分別為180 g/L，8.5 g/(L·h).

1.2 通過優(yōu)化發(fā)酵條件提高木糖醇的產(chǎn)量

初始pH、溫度等發(fā)酵條件對菌體的生長代謝具有重要影響.Srivani等[12]對CandidaparapsilosisNCIM-3323發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的初始pH、溫度進(jìn)行了優(yōu)化.結(jié)果表明：在初始pH 3.5，溫度30 ℃條件下，以60 g/L的木糖作為底物，木糖醇的產(chǎn)率及時空產(chǎn)率達(dá)到最優(yōu)，分別為46.9%，0.7 g/(L·h).

溶氧也是菌株發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的一個關(guān)鍵因素，由于菌株的最大生長速率與木糖醇的積累不在同一溶氧水平，因此，Li等[13]以C.tropicalis作為生產(chǎn)菌株，采用兩步補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法，通過改變通氣速率將發(fā)酵分為通氣階段和微通氣階段，初始木糖質(zhì)量濃度為80 g/L，培養(yǎng)120 h，最終獲得96.5 g/L的木糖醇，產(chǎn)率及時空產(chǎn)率分別達(dá)83%，1.01 g/(L·h)，分別比補(bǔ)料分批發(fā)酵過程提高12.16%和65.57%.

1.3 通過野生菌代謝過程改造提高木糖醇的產(chǎn)量

然而，僅僅通過傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵法還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了工業(yè)化需求，近幾年，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，利用代謝工程的手段改造野生菌，構(gòu)建更加高效制備木糖醇的工程菌已經(jīng)成為了國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn).木糖在微生物體內(nèi)的代謝路徑主要有兩條：一條是木糖在木糖異構(gòu)酶的作用下生成木酮糖，木酮糖在木酮糖激酶的作用下生成木酮糖-5-磷酸，最后進(jìn)入磷酸戊糖途徑；另一條是木糖由NAD(P)H依賴型的木糖還原酶(xylose reductase，XR)還原為木糖醇，木糖醇通過NAD+依賴型的木糖醇脫氫酶(XDH)氧化為木酮糖，最終進(jìn)入磷酸戊糖途徑.第一條路徑主要存在于細(xì)菌當(dāng)中，第二條路徑一般存在于絲狀真菌及酵母中.木糖的代謝路徑為

目前文獻(xiàn)中所報道的通過代謝工程改造來提高木糖醇產(chǎn)量的方法主要可以概括為改造木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和改造木糖醇的代謝路徑.

1.3.1 改造木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

提高木糖在微生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)速度對提高木糖醇生產(chǎn)效率至關(guān)重要，為了促進(jìn)木糖的吸收，Zhang等[14]分別將Kluyveromycesmarxianus水-甘油跨膜運(yùn)輸通道蛋白基因(KmFPS1)，Candidaintermedia葡萄糖/木糖誘導(dǎo)基因(CiGXF1)或葡萄糖/木糖同向轉(zhuǎn)運(yùn)基因(CiGXS1)導(dǎo)入到K.marxianusYZJ017中進(jìn)行過表達(dá).結(jié)果表明：在42 ℃條件下，帶有CiGXF1基因的YZJ074利用99.55 g/L的木糖產(chǎn)生99.29 g/L的木糖醇，時空產(chǎn)率高達(dá)4.14 g/(L·h).通過重復(fù)補(bǔ)加未經(jīng)滅菌的底物進(jìn)行分批發(fā)酵，YZJ074可以產(chǎn)生312.05 g/L的木糖醇.為了進(jìn)一步提高木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，Wang等[15]將來源于Meyerozymaguilliermondii的轉(zhuǎn)運(yùn)基因Mgt05196p導(dǎo)入到Saccharomycescerevisiae進(jìn)行表達(dá)，并對Mgt05196p的蛋白結(jié)構(gòu)及基因序列進(jìn)行分析，通過定點(diǎn)突變的方式確定其關(guān)鍵氨基酸殘基.最終發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)432A及N360S突變體能夠提高M(jìn)gt05196p的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性.

1.3.2 改造木糖醇的代謝路徑

在絲狀真菌及酵母中，木糖經(jīng)木糖還原酶(XR)轉(zhuǎn)化為木糖醇，但是木糖醇脫氫酶(XDH)會繼續(xù)將木糖醇轉(zhuǎn)化為木酮糖，這就嚴(yán)重阻礙了木糖醇的大量積累，因此，Ko等[16]將Candidatropical中編碼木糖醇脫氫酶(XDH)的基因XYL2破壞，使木糖醇脫氫酶(XDH)的活性喪失，從而提高木糖醇的產(chǎn)量.結(jié)果表明：突變株BSXDH-3以50 g/L的D-木糖為底物，15 g/L的甘油為輔助底物，培養(yǎng)16 h，木糖醇的終質(zhì)量濃度達(dá)到48.6 g/L，時空產(chǎn)率為3.23 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率高達(dá)98%.Mahmud等[17]通過在Aspergillusoryzae中編碼木糖醇脫氫酶的xdhA基因中插入選擇性標(biāo)記基因pyrG，降低木糖醇脫氫酶的活性，篩選出突變菌株xdhA2-1，最終，此突變菌株可產(chǎn)生16.6 g/L的木糖醇，木糖醇的產(chǎn)率及時空產(chǎn)率分別為43%，0.248 g/(L·h)，均高于原始菌株.

2 酶催化法制備木糖醇

酶催化法是一種新興的方法，此過程簡單、易行，是一種非常具有工業(yè)前景的木糖醇制備方法.

2.1 木糖還原酶的基本特性

木糖還原酶(XR)是木糖代謝過程中的關(guān)鍵酶，它負(fù)責(zé)將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，主要存在于絲狀真菌和酵母中.木糖還原酶屬于氧化還原酶，只有在輔酶的參與下才能起作用，就目前所發(fā)現(xiàn)的木糖還原酶而言，大多數(shù)均是輔酶NADPH依賴型，如來源于Candidatropicals[18]，Talaromycesemersonii[19]和Pichiastipitis[20]等的木糖還原酶；少部分是輔酶NADH依賴型，如來源于Candidaparapsilosis[21]的木糖還原酶；還有個別是雙輔酶依賴型，如來源于Candidatenuis[22]和Candidaintermedia[23]的木糖還原酶.木糖還原酶普遍存在專一性差的特點(diǎn)，能夠?qū)⒍喾N糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的糖醇，這給木糖醇的分離純化帶來了很大的困難，此外，在催化木糖制備木糖醇的過程中需要額外添加價格昂貴的輔酶NAD(P)H來提供還原力，這些因素很大地制約了酶催化法的工業(yè)化發(fā)展.分子改造是提高酶專一性的一種手段，Su等[24]通過對來源于Neurosporacrassa的木糖還原酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得的突變體VMCQIRTT對阿拉伯糖的活性較突變前的酶降低了73.5%，從而提高了其對木糖的專一性.Rafiqul等[25]考察了反應(yīng)時間、溫度、pH、木糖濃度、NADPH濃度、酶添加量以及轉(zhuǎn)速等因子對來源于C.tropicalis的木糖還原酶催化木屑半纖維素水解液制備木糖醇的影響.最終，以18.8 g/L的木糖作為底物，木糖醇的產(chǎn)率僅為56%.為了減少輔酶NAD(P)H的添加量，構(gòu)建高效的輔酶再生體系至關(guān)重要，Branco等[26]將甘蔗渣經(jīng)弱酸水解獲得含有18 g/L木糖和6 g/L葡萄糖的半纖維素水解液，通過來源于CandidaguilliermondiiFTI 20037木糖還原酶(XR)與葡萄糖脫氫酶(GDH)偶聯(lián)催化含木糖的半纖維素水解液制備木糖醇，最終轉(zhuǎn)化效率可達(dá)100%.Nidetzky等[27]利用來自Candidatenuis的NADH依賴型的木糖還原酶(XR)與來自Bacilluscereus的葡萄糖脫氫酶(GDH)相偶聯(lián)，并通過構(gòu)建動力學(xué)模型對反應(yīng)過程進(jìn)行優(yōu)化，最終，以300 g/L的木糖作為底物，獲得96%的木糖醇產(chǎn)率及80 g/(L·d)的時空產(chǎn)率.

2.2 重組木糖還原酶的構(gòu)建及在制備木糖醇中的應(yīng)用

然而，僅僅通過簡單的酶催化條件的優(yōu)化來制備木糖醇，其產(chǎn)量還無法達(dá)到理想的要求，利用基因工程的手段構(gòu)建更加高效制備木糖醇的重組木糖還原酶工程菌已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注.目前，這種方法主要集中于強(qiáng)化木糖還原酶基因的表達(dá).影響木糖還原酶基因表達(dá)的因素主要為還原酶的合成速度和木糖還原酶的表達(dá)宿主.

2.2.1 木糖還原酶的合成速度

酶的可溶性表達(dá)量大小決定了其活性的高低，酶的合成速度過快，則會導(dǎo)致其折疊錯誤，形成大量的包涵體，最終導(dǎo)致木糖還原酶的活性降低，為了解決這個問題，Su等[28]考察了不同啟動子對來源于Neurosporacrassa木糖還原酶表達(dá)的影響，最終發(fā)現(xiàn)，Trc啟動子能夠使木糖還原酶的翻譯起始速率處于相對較低的水平，在相對較高的溫度下誘導(dǎo)表達(dá)，幾乎沒有形成包涵體，從而很大程度上提高了木糖還原酶的活性.降低誘導(dǎo)溫度也可以減少木糖還原酶的合成速度，但是過低的誘導(dǎo)溫度會增加能源的消耗，同時也會使木糖還原酶的表達(dá)量降低.

2.2.2 木糖還原酶的表達(dá)宿主

木糖還原酶的原宿主與表達(dá)宿主的內(nèi)環(huán)境不同，也不利于酶的表達(dá).因此，Jeon等[29]將Neurosporacrassa中的木糖還原酶基因(NcXR)導(dǎo)入到C.tropicalis中，但由于NcXR在C.tropicalis中因密碼子的偏愛性不同而不能夠表達(dá).因此，將NcXR的氨基酸序列以偏好于C.tropicalis的密碼子翻譯為新的基因序列.最終利用經(jīng)密碼子優(yōu)化過的重組菌株LNG2轉(zhuǎn)化木糖制備木糖醇，轉(zhuǎn)化率高達(dá)96%，時空產(chǎn)率為1.44 g/(L·h)，分別比對應(yīng)的親本菌株BSXDH-3提高62%和73%.

由于木糖還原酶大多來源于酵母，因此目前關(guān)于重組木糖還原酶工程菌的研究大多以酵母為宿主，Govinden等[30]從Pichiastipitis和Candidashehatae中分離的木糖還原酶基因(XYL1)，在啟動子ADH2和終止子PGK1的控制下克隆進(jìn)YEp載體，然后通過電轉(zhuǎn)的方式將其轉(zhuǎn)入SaccharomycescerevisiaeY294中.Pratter等[31]將來自Candidatenuis的木糖還原酶基因(CtXR)導(dǎo)入到Saccharomycescerevisiae中，最終，利用重組菌轉(zhuǎn)化40 g/L的木糖，木糖醇的產(chǎn)率高達(dá)100%.酵母培養(yǎng)條件普通，可以大規(guī)模生產(chǎn)，同時具有一定的翻譯后加工能力，對外源蛋白質(zhì)進(jìn)行一定的折疊加工和糖基化修飾，特別適用于真核基因的表達(dá).

大腸桿菌也是構(gòu)建基因工程菌的常用宿主，具有繁殖速度快、基因操作簡單、培養(yǎng)成本低和表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，Woodyer等[32]從Neurosporacrassa全基因組序列中確定出木糖還原酶基因，將其轉(zhuǎn)入到Escherichiacoli中進(jìn)行表達(dá)，并以His6標(biāo)記融合進(jìn)行高收率純化.然而由于木糖還原酶一般來源于真核生物，而大腸桿菌屬于原核生物，真核生物與原核生物內(nèi)環(huán)境差距較大，蛋白修飾不同，不利于木糖還原酶基因的表達(dá).Suzuki等[33]將來自CandidatropicalIFO 0618的木糖還原酶基因(xyrA)轉(zhuǎn)入到E.coil中，最終將50 g/L的木糖和5 g/L的葡萄糖加入到經(jīng)IPTG誘導(dǎo)過的細(xì)胞中，培養(yǎng)20 h，木糖醇的產(chǎn)量僅有13.3 g/L.

2.3 固定化木糖還原酶在制備木糖醇中的應(yīng)用

固定化酶較游離酶有很多優(yōu)勢，如提高酶的穩(wěn)定性、提高酶的重復(fù)利用性等，但是選擇合適方法是固定化成功的關(guān)鍵.Su等[34]通過比較海藻酸鈣凝膠包埋法、海藻酸/殼聚糖包埋法、殼聚糖-戊二醛交聯(lián)法及聚丙烯酰胺凝膠包埋法對木糖還原酶活性的影響，選擇了殼聚糖-戊二醛交聯(lián)法固定化來源于Candidatropical的木糖還原酶，并比較了固定化酶與游離酶的性質(zhì)，最終發(fā)現(xiàn)，固定化酶在反應(yīng)7個批次后，殘余酶活仍保持在40%，固定化酶對于木糖的親和力及催化效率均高于游離酶.

3 結(jié) 論

目前，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)木糖醇仍然還依賴于化學(xué)加氫法，生物法要想取代化學(xué)法仍然還有許多困難需要克服.筆者主要總結(jié)了目前在生物法制備木糖醇過程中提高木糖醇產(chǎn)量的常用方法，包括發(fā)酵過程條件的優(yōu)化，通過代謝工程技術(shù)改造木糖醇生產(chǎn)菌株，通過基因工程手段強(qiáng)化木糖還原酶的表達(dá)等.盡管這些方法已經(jīng)取得了很大的突破，但是生物法制備木糖醇的工業(yè)化前景依然不容樂觀.接下來的研究可以從以下幾方面入手：1) 通過基因挖掘的方法篩選具有較高活性的木糖還原酶，建立高效的輔酶再生體系，建立高效的高通量篩選法，通過易錯PCR、定點(diǎn)突變和飽和突變等手段對木糖還原酶進(jìn)行分子改造，提高其底物上載量，使其更能滿足工業(yè)化的需求；2) 由于木糖還原酶普遍存在專一性差的特性，容易將半纖維素水解液中的阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為阿拉伯糖醇，而阿拉伯糖醇與木糖醇是同分異構(gòu)體，性質(zhì)極為相似，這給后續(xù)的分離純化帶來了很大的困難，因此篩選高專一性的木糖還原酶顯得尤為重要，也可以通過分子改造技術(shù)提高其底物特異性；3) 由于工業(yè)上制備木糖醇均以半纖維水解液作為底物，而半纖維素水解液中存在糠醛、乙酸等雜質(zhì)，對菌體的生長及木糖還原酶的活性具有很大的負(fù)面影響，因此可以通過基因工程的手段提高菌體及酶對底物及雜質(zhì)的耐受性.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Research progress of preparation of xylitol by biosynthetical method

YANG Bo, XU Wei, JIA Dongxu, JIN Liqun

(College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Xylitol is a natural five carbon sugar alcohol widely used in the medicine, food, chemical industry and other fields. At present, the industrial production of xylitol was mainly achieved by chemical methods. Comparatively, the biosynthesis pathway attracted much attention based on its advantages of mild reaction conditions and less pollution. In this paper, the preparation of xylitol by microbial fermentation and enzymatic catalysis was reviewed, and some points for the improvement of xylitol production were discussed.

xylitol; biosynthesis; xylose reductase

2017-04-19

浙江省科技廳公益技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015C32052)

楊 波(1991—)，男，江蘇淮安人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锎呋?，E-mail: 13588258713@163.com.

TS245.8

A

1674-2214(2017)02-0113-05