校 瑞，張曉婷，牛家華，秦培鴿，楊藝欣，盧明華

(河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,河南 開封 475004)

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高效液相色譜法同時分離檢測食品添加劑

校 瑞，張曉婷，牛家華，秦培鴿，楊藝欣，盧明華*

(河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,河南 開封 475004)

建立了一種同時分離檢測沒食子酸丙酯(PG)、特丁基對苯二酚(TBHQ)、二丁基羥基甲苯(BHT)和苯甲酸等食品添加劑的高效液相色譜(HPLC)分析方法. 通過對流動相、流速、柱溫、檢測波長等色譜條件的優(yōu)化，確定了最佳的分離檢測條件：甲醇(B)和水(A)(0.1%的乙酸溶液)作為流動相，梯度洗脫：0～6 min，60%B，流速0.3 mL/min；6～9 min，60%～100% B，流速0.6 mL/min，柱溫維持在25 ℃，檢測波長280 nm(PG、TBHQ、BHT)，230 nm(苯甲酸). 在最佳的色譜條件下，方法的線性范圍分別為1～200、2～400、2～400、0.5～400 mg/L，檢出限(LOD)為0.02～0.06 mg/L，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999 4，加標回收率在77.76%～106.27%之間. 該方法還成功應(yīng)用于話梅、薯片、方便面實際樣品中食品添加劑的分析檢測.

高效液相色譜；同時分離檢測；食品添加劑；抗氧化劑；防腐劑

抗氧化劑中的丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(PG)、特丁基對苯二酚(TBHQ)是廣泛使用的幾種人工合成抗氧化劑[1]，它們可以單獨使用或與檸檬酸，抗壞血酸等酸性增效劑復(fù)合使用，可滿足大部分食品制品的需要，但在實際生活中，往往兩種或多種抗氧化劑同時使用，這為分離檢測工作帶來了困難. 這些抗氧化劑具有一定的急性毒性和慢性致癌作用，過量添加會損害人體健康[2-3]，BHA和BHT己在許多國家禁止使用，TBHQ在日本食品中要求不得檢出[4-5]. 由于抗氧化劑種類較多，抗氧化的作用機理也不盡相同，比較復(fù)雜，存在著多種可能性，歸納起來，主要有以下幾種：1)通過抗氧化劑的還原作用，降低食品體系中的氧含量；2)中斷氧化過程中的鏈式反應(yīng)，阻止氧化過程進一步進行；3)破壞、減弱氧化酶的活性，使其不能催化氧化反應(yīng)的進行；4)將能催化及引起氧化反應(yīng)的物質(zhì)封閉，如絡(luò)合能催化氧化反應(yīng)的金屬離子等[6-9].

苯甲酸及其鹽是最常見的防腐劑之一，廣泛應(yīng)用于制藥、化妝品、食品等行業(yè). 以苯甲酸鈉作為防腐劑一直引起爭議，特別是飲料中的維生素C添加劑與苯甲酸鈉相結(jié)合時，會產(chǎn)生致癌物苯，對人體造成極大危害[10-12]. GB2760-2014規(guī)定，苯甲酸鈉最大使用量為1.0 g/kg. 過量添加苯甲酸，還會破壞維生素B1，且使鈣形成不溶性物質(zhì)，影響人體對鈣的吸收，同時對胃腸道有刺激性作用，長期使用可誘發(fā)蕁麻疹、哮喘及血管性水腫等不良反應(yīng)，對人體健康造成不利的影響[13-14]. 因此，考慮到食品安全問題，苯甲酸的定性和定量的分析就顯得尤為重要，在國內(nèi)外也受到了高度重視.

我們利用高效液相色譜對PG、BHT、TBHQ、苯甲酸這四種物質(zhì)(圖1)進行定性定量分析，并對實際樣品中的添加劑含量進行分析檢測.

圖1 四種目標分析物的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structures of the four analytes

1 實驗部分

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀(Agilent，美國)，Agilent C18液相色譜柱(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm)安捷倫科技有限公司，塞多利斯電子天平，超聲波清洗器(SB-120 DT，寧波新芝)，漩渦混合儀(QL-866，海門市其林貝爾)，pH酸度計(梅特勒-托利多)，臺式高速冷凍離心機(TGL-16)，Milli-Q超純水系統(tǒng). 微量移液槍(10～00 μL和100～1000 μL，eppendorf)，0.22 μm有機系濾頭.

1.2 樣品與試劑

PG(98%，阿拉丁)、苯甲酸(99.5%，阿拉丁)、TBHQ(97%，σ)、BHT(≥99%，σ)，冰乙酸(≥99.9%，阿拉丁)，甲醇(一級色譜純，德國默克)，超純水. 實際樣品話梅、方便面、薯片均購自學(xué)校附近亞星超市.

1.3 標準溶液的配制

分別稱取PG、苯甲酸、TBHQ、BHT四種目標分析物1.0 mg，用甲醇溶解配成1.0 g/L的儲備液，超聲混勻. 低濃度的工作溶液由此儲備溶液逐級稀釋得到.

1.4 樣品前處理

分別稱取方便面、薯片、話梅(去核)樣品各5.0 g于10 mL的離心管中，加入10 mL 甲醇溶劑，漩渦混合10 min，8 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，再次向殘渣加入10 mL甲醇，重復(fù)以上操作，合并上清液，在60 ℃條件下氮吹，吹干后再用1 mL甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機測定.

1.5 HPLC分析

甲醇(B)和水(A)(0.1%的乙酸溶液)作為流動相，梯度洗脫：0～6 min，60%B，流速0.3 mL/min；6～9 min，60%～100% B，流速0.6 mL/min，檢測波長280 nm(PG、TBHQ、BHT)，230 nm(苯甲酸)，柱溫維持在25 ℃，進樣量5 μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

通過對有機相比例、流速、柱溫等色譜條件的優(yōu)化，色譜條件為：甲醇(B)和水(A)(0.1%的乙酸溶液)作為流動相，梯度洗脫：0～6 min，60%B，流速0.3 mL/min；6～9 min，60%～100% B，流速0.6 mL/min，檢測波長280 nm(PG、TBHQ、BHT)，230 nm(苯甲酸)，柱溫維持在25 ℃，進樣量5 μL. 在最佳的條件下得到的色譜圖如圖2所示.

1. 沒食子酸丙酯；2. 苯甲酸；3. 特丁基對苯二酚；4. 二丁基羥基甲苯.圖2 標準溶液的色譜圖Fig.2 Standard chromatograms of the analytes

2.2 標準曲線的繪制

分別配制四種物質(zhì)0.5、1、5、10、20、50、100、200、400、600、800、1 000 mg/L等一系列濃度的標準工作溶液并繪制其標準工作曲線如圖3所示. 表1列出了線性方程、線性范圍、檢出限(LOD)以及相對標準偏差(RSD). 以濃度為橫坐標，對應(yīng)的峰面積為縱坐標進行線性回歸，在最佳的色譜條件下平行測定3次取平均值，得到的相關(guān)系數(shù)R2≥ 0.999 5. 其中檢出限是按照信噪比為3進行測量，得到的檢出限在0.37～1.50 mg/L之間，測量5次得到的相對標準偏差小于4.44%，這表明建立的該方法具有較高的靈敏度和很好的重現(xiàn)性.

圖3 沒食子酸丙酯(a)、苯甲酸(b)、特丁基對苯二酚(c)、二丁基羥基甲苯(d)四種物質(zhì)的標準曲線Fig.3 Calibration curves for PG (a), benzoic acid (b), TBHQ (c), BHT (d)

化合物線性方程線性范圍/(mg/L)R2LOD/(mg/L)RSD/(%,n=5)PGy=44.35x-44.711～2000.99940.754.44苯甲酸y=74.16x+121.800.5～4000.99960.371.26TBHQy=7.40x-14.072～4000.99981.501.30BHTy=3.28x-2.872～4000.99971.502.16

2.3 加標回收率

在線性范圍內(nèi)選取低、中、高3個不同濃度的樣品向空白樣品中加標，測其加標回收率，平行檢測3次取平均值，檢測結(jié)果表明回收率均大于79.76%，如表2所示.

表2 空白樣品的加標回收率Table 2 Recoveries of spiked blank sample

2.4 實際樣品的檢測

將買來的薯片、方便面、話梅按照1.4進行樣品前處理，然后用HPLC檢測，三種實際樣品與5 mg/L的標準色譜圖比對，結(jié)果如圖4所示.

1. 沒食子酸丙酯；2. 苯甲酸；3. 特丁基對苯二酚；4. 二丁基羥基甲苯.圖4 話梅(A)、薯片(B)、方便面(C)、5mg/L標準溶液的色譜圖(D)Fig.4 Chromatograms of plum (A), potato chips (B), instant noodles (C), 5 mg/L standard solution (D)

將測定結(jié)果(峰面積y)帶入表1中標準工作曲線求得濃度x，按式(1)計算：

式中：X——試樣中標準品的含量(g/kg)；c——測得的峰面積(y)帶入標準工作曲線中所求得的濃度(mg/L)；V——提取后樣液體積(mL)；m——實際樣品質(zhì)量(g).

檢測結(jié)果為：話梅中PG的檢測含量為0.226 g/kg，苯甲酸的檢測含量為2.98 g/kg. 根據(jù)《中華人民共和國食品添加劑使用標準》(GB 2760-2014)規(guī)定，蜜餞涼果和膠基糖果中苯甲酸最大使用量分別為0.5、1.5 g/kg，因此話梅中苯甲酸的使用量是超標的.

3 結(jié)論

建立了一種使用高效液相色譜同時分離檢測四種食品添加劑的方法，并對色譜條件進行了優(yōu)化. 結(jié)果表明，該方法的線性關(guān)系以及回收率良好，檢出限較低，并成功的檢測出話梅中PG和苯甲酸的含量，能夠達到定量分析的要求. 該方法具有簡單、靈敏、快速等優(yōu)點，對食品中添加劑的定性定量分析具有重要意義.

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[責(zé)任編輯：吳文鵬]

Simultaneous separation and determination of food additives by high performance liquid chromatography

XIAO Rui， ZHANG Xiaoting, NIU Jiahua, QIN Peige, YANG Yixin, LU Minghua*

(CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

A HPLC method for the analysis of food additives including propyl gallate (PG), tert-Butylhydroquinone (TBHQ), butylated hydroxytoluene (BHT) and benzoic acid in foods was developed. The chromatographic conditions with mobile phase, flow rate, column temperature were optimized, and methanol (B) and water with 0.1% acetic acid (A) were used as the mobile phase with that the gradient program is 0-6 min, 60% B, the flow rate of 0.3 mL/min; 6-9 min, 60%-100% B, the flow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was maintained at 25 ℃. Under the optimized conditions, the linearity range of the method for the analysis of PG, benzoic acid, TBHQ, BHT were 1-200, 2-400, 2-400 and 0.5-400 mg/L with correlation coefficients (R2) with more than 0.999 4. The limits of detection (LODs) were in the range of 0.02-0.06 mg/L at a signal-to-noise ratio of 3, the recoveries of these compounds were in the range of 77.76%-106.27%. The developed method was also applied to analysis real samples.

HPLC; simultaneous separation and determination; food additives; antioxidant; preservative

2016-04-01.

國家自然科學(xué)基金(21477033)，河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃項目(2014GGJS-024)，河南省高校科技創(chuàng)新人才支持計劃(17HASTIT003).

校 瑞(1990-)，女，碩士生，主要從事色譜分析方面的研究．*

,E-mail：mhlu@henu.edu.cn.

O65

A

1008-1011(2017)03-0348-05