鄧 祥，黃小梅，王 芬

(1.四川文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 達州 635000； 2.“特色植物開發(fā)研究”四川省高校重點實驗室，四川 達州 635000)

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川佛手中多酚類物質(zhì)的微波和超聲波聯(lián)合提取工藝優(yōu)化

鄧 祥1,2*，黃小梅1,2，王 芬1

(1.四川文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 達州 635000； 2.“特色植物開發(fā)研究”四川省高校重點實驗室，四川 達州 635000)

采用微波和超聲波提取技術(shù)，實現(xiàn)了川佛手中多酚類物質(zhì)的有效提取. 在微波功率800 W和微波提取時間40 min的條件下，通過單因素實驗條件優(yōu)化，考察了超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、超聲時間和提取料液比對提取效率的影響；通過正交試驗設(shè)計，確定了最佳提取工藝條件參數(shù)，即超聲功率800 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度55 ℃、超聲時間1.0 h和提取料液比1∶20 g/mL；通過驗證實驗，得到川佛手多酚的提取率約為20.79 mg/g.

川佛手；多酚；微波；超聲波

佛手(Bergamot)又名佛手柑，為蕓香科植物佛手的干燥果實[1-2]. 佛手原產(chǎn)印度，傳入我國種植已有700多年歷史，現(xiàn)主要分布于四川、福建、廣州和浙江等地，因其產(chǎn)地不同，佛手主要分為川佛手、建佛手、廣佛手和金佛手等品種[3]. 佛手作為一種名貴的傳統(tǒng)中藥材，具有極高的藥用價值[4-5]. 佛手中的藥效成分主要包括揮發(fā)油類、多酚類、香豆素類和多糖類物質(zhì)，由于其特殊的化學(xué)成分組成，佛手不僅應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，也被廣泛的應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)[6-7]. 藥典記載和研究表明：佛手醇提取物具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎、降血脂、降血糖和殺菌抑菌等多種藥理活性[8-9]. 這些藥理活性的影響因素是多方面的，其主要藥效成分除與多糖類物質(zhì)有關(guān)外，還與佛手中多酚類物質(zhì)有關(guān). 因此，研究佛手中多酚類物質(zhì)的有效含量，對于判明川佛手潛在的開發(fā)利用價值具有十分重要的意義[10].

佛手中多酚類物質(zhì)大多包裹在細(xì)胞壁中，采用傳統(tǒng)的固液萃取和溶劑浸提方法提取效率較低. 微波和超聲波輔助提取法是近年來發(fā)展起來的一種高效節(jié)能的植物有效成分提取技術(shù)，主要通過電磁場和超聲波的物理作用，在不改變中藥材有效化學(xué)成分的性能的基礎(chǔ)上，能夠縮短提取時間，顯著提高提取效率[11-12]. 本研究以川佛手中的多酚類物質(zhì)為研究對象，采用微波和超聲波聯(lián)合提取技術(shù)，通過單因素實驗條件優(yōu)化和正交試驗，優(yōu)化川佛手中多酚類物質(zhì)的提取工藝，明確最佳工藝條件，為中藥材中多酚類物質(zhì)的有效提取提供技術(shù)參數(shù).

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HN-1000D型超聲波萃取儀(上海汗諾儀器有限公司)；MAS-2微波萃取儀(新儀微波化學(xué)科技有限公司)；UV-2550型紫外可見分光光度計(日本島津)；FA1104N型電子天平(上海菁海儀器有限公司)；TG20-WS型離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)；FW-135 型中草藥粉碎機(上海五久自動化設(shè)備有限公司)； 101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司).

川佛手(四川龍森中藥材種植有限公司)；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海試劑二廠)；福林酚試劑(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；碳酸鈉、硫酸鐵、水楊酸、H2O2、無水乙醇均為分析純試劑，實驗用水均為二次蒸餾水.

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林酚試劑(Folin-Ciocalteu, FC)顯色法測定多酚含量[13]. 準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥恒重的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇完全溶解，并定容至100 mL，得到0.1 g/L的對照品儲備液. 從儲備液中分別移取0、1.0、2.0、4.0、6.0 、8.0、10.0、12.0 mL于8個25 mL容量瓶中，依次各加入60%乙醇溶液至大約15 mL，福林酚試劑2 mL，混勻后靜置2～3 min，再分別加入20%碳酸鈉溶液4 mL，最后用60%的乙醇定容，搖勻，置于45 ℃的水浴鍋加熱5～6 min. 以第1瓶作對照，在765 nm最大吸收波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.

Each point is an average of three successive measurements.圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of measuring content of gallic acid

1.2.2 多酚提取及測定

將川佛手鮮果放置于35 ℃的真空干燥箱內(nèi)恒溫烘干，經(jīng)粉碎后過60 目篩，除去大顆粒. 準(zhǔn)確稱取0.5 g川佛手粉末，置于離心管中并加入一定量溶劑，先用微波提取，然后用超聲波提取，重復(fù)2～3次. 將提取物離心分離后收集于50 mL容量瓶中，用相應(yīng)溶劑定容，再將定容后的提取液準(zhǔn)確移取5.0 mL于25.0 mL容量瓶中，按1.2.1的方法處理得到吸光度，根據(jù)線性回歸方程求算出多酚的提取濃度，再按下式計算川佛手的多酚提取效率[14-15].

其中：C—提取液多酚濃度(g/L);m—川佛手質(zhì)量(g);V—提取液的體積(mL).

1.2.3 單因素實驗條件優(yōu)化

在單因素實驗條件優(yōu)化過程中，首先優(yōu)化微波提取功率和提取時間，在優(yōu)化后的微波提取功率800 W和提取時間40 min一定的情況下，先用微波提取，再用超聲波提取，其他按1.2.1和1.2.2中的方法處理，得到川佛手中多酚的提取率. 實驗中除固定微波提取功率和微波提取時間外，微波提取的其他條件與超聲波提取條件一致. 著重討論超聲波提取過程中的提取功率、乙醇濃度、提取溫度、提取時間和料液比各因素對川佛手多酚提取效率的影響.

1.2.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗的條件優(yōu)化結(jié)果，以多酚提取率為指標(biāo)，在固定微波提取功率、提取時間和超聲波提取功率的情況下，對其中乙醇體積分?jǐn)?shù)A(%)、提取溫度B(℃)、提取時間C(h)和料液比D(g/mL)四個因素進行正交試驗，采用三水平四因素即L9(34)模式，見表1所示.

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test L9(34)

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗條件優(yōu)化

2.1.1 超聲功率條件優(yōu)化

在超聲功率條件優(yōu)化過程中，按實驗方法準(zhǔn)確稱取6份川佛手粉末各0.5 g，分別加入12.5 mL無水乙醇，先用微波提取，然后在超聲溫度50 ℃的條件下，提取2.5 h，重復(fù)2～3次，優(yōu)化超聲功率對川佛手中多酚類物質(zhì)提取效率的影響，其結(jié)果如圖2所示. 在所測定的超聲功率范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增加，川佛手中多酚類物質(zhì)提取效率不斷增加，當(dāng)功率提升到800 W時，多酚類物質(zhì)的提取效率達到最大值并趨于穩(wěn)定，所以實驗過程中最適宜的超聲功率為800 W.

Each point is an average of three successive measurements.圖2 超聲功率條件優(yōu)化Fig.2 Ultrasonic power condition optimization

2.1.2 乙醇濃度條件優(yōu)化

在乙醇濃度的條件優(yōu)化過程中，準(zhǔn)確稱取6份川佛手粉末各0.5 g，分別加入12.5 mL不同濃度的乙醇，先用微波提取，再在超聲功率800 W和50 ℃的條件下，提取2.5 h，重復(fù)2～3次，優(yōu)化乙醇濃度對川佛手中多酚類物質(zhì)提取效率的影響，其結(jié)果如圖3所示. 在所測定的乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增大，多酚提取效率不斷增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%時，多酚提取效率達到最大，符合相似相容原理；之后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚提取效率反而下降. 究其原因是乙醇濃度過大，川佛手中的化學(xué)成分競爭溶出，從而限制了某些多酚類物質(zhì)的充分溶解，提取率反而降低. 所以實驗過程中選取體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇為最佳乙醇濃度.

Each point is an average of three successive measurements.圖3 乙醇濃度條件優(yōu)化Fig.3 Ethanol concentration condition optimization

2.1.3 提取溫度條件優(yōu)化

在提取溫度的條件優(yōu)化過程中，準(zhǔn)確稱取6份川佛手粉末各0.5 g，分別加入12.5 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇，先用微波提取，再在超聲功率800 W的條件下，提取2.5 h，重復(fù)2～3次，優(yōu)化提取溫度對川佛手中多酚類物質(zhì)提取效率的影響，其結(jié)果如圖4所示. 在所測定的提取溫度范圍內(nèi)，多酚類物質(zhì)的提取效率對溫度的變化十分敏感，在提取溫度為60 ℃之前，多酚類物質(zhì)的提取效率呈直線上升，這是因為溫度越高，分子熱運動加劇，多酚類物質(zhì)集聚溶出，提取效率明顯提高；提取溫度在60 ℃之后，多酚類物質(zhì)的提取效率下降顯著，這是因為多酚類物質(zhì)具有熱不穩(wěn)定性，溫度過高，多酚類物質(zhì)易于部分氧化和分解，導(dǎo)致了檢測到的多酚提取效率顯著降低. 因此確定50 ℃為川佛手多酚類物質(zhì)的最佳提取溫度.

Each point is an average of three successive measurements.圖4 提取溫度條件優(yōu)化Fig.4 Extraction temperature condition optimization

2.1.4 提取時間條件優(yōu)化

在提取時間的條件優(yōu)化過程中，準(zhǔn)確稱取6份川佛手粉末各0.5 g，分別加入12.5 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇，先用微波提取，再在超聲功率800 W和60 ℃的條件下，重復(fù)提取2～3次，優(yōu)化提取時間對川佛手中多酚類物質(zhì)提取效率的影響，其結(jié)果如圖5所示. 在所測定的提取時間范圍內(nèi)，隨著提取時間的不斷增加，提取率不斷增大，當(dāng)提取時間為1.5 h時，提取率達到最大，這是因為提取時間越長，多酚能充分有效溶出，提取效率較高；之后，隨著提取時間的增加，提取率逐漸下降，這是因為提取時間過長，佛手中其他化學(xué)成分可能抑制部分多酚類物質(zhì)的浸出，導(dǎo)致多酚的提取效率降低. 所以川佛手多酚類物質(zhì)的最佳提取時間為1.5 h.

Each point is an average of three successive measurements.圖5 提取時間條件優(yōu)化Fig.5 Extraction time condition optimization

2.1.5 提取料液比條件優(yōu)化

在提取料液比的條件優(yōu)化過程中，準(zhǔn)確稱取6份川佛手粉末各0.5 g，分別加入12.5 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇，先用微波提取，再在超聲功率800 W和60 ℃的條件下，提取1.5 h，重復(fù)2～3次，優(yōu)化提取料液比對川佛手中多酚類物質(zhì)提取效率的影響，其結(jié)果如圖6所示. 在所測定的提取料液比各組數(shù)據(jù)中，溶劑加入量較小時，多酚類物質(zhì)的提取效率較低；隨著溶劑加入量的增大，提取更充分，多酚類物質(zhì)的提取效率也不斷增加；溶劑加入量再增大，提取效率幾乎沒有變化. 為減少溶劑用量減低成本，因此確定川佛手多酚類物質(zhì)的最佳提取料液比為1∶20 (g/mL).

Each point is an average of three successive measurements.圖6 液料比條件優(yōu)化Fig.6 Solid-liquid ratio condition optimization

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素實驗條件優(yōu)化結(jié)果，微波提取功率800 W、提取時間40 min和超聲波提取功率800 W一定的條件下，對乙醇濃度、超聲波提取溫度、提取時間和料液比實驗條件進行L9(34)正交試驗，其試驗結(jié)果見表2所示. 在正交試驗中，極差R表示因素的影響大小，由R2>R1>R4>R3大小可以判斷，影響川佛手多酚類物質(zhì)提取效率的因素主次順序為：提取溫度>乙醇濃度>料液比>提取時間. 均值k表示各因素下不同水平實驗結(jié)果的平均值，由均值k得到川佛手多酚的最佳提取工藝參數(shù)為：A2B1C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取溫度為55 ℃，提取時間為1.0 h和料液比為1∶20 (g/mL).

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test L9(34)

2.3 驗證實驗

根據(jù)正交試驗結(jié)果，在川佛手多酚的最佳提取工藝參數(shù)條件下，進行三組平行實驗作為驗證實驗，其結(jié)果如表3所示. 在最佳提取工藝參數(shù)條件下，川佛手多酚類物質(zhì)的提取率約為20.79 mg/g.

表3 最佳提取工藝參數(shù)條件下的驗證實驗結(jié)果Table 3 Results of the optimum process conditions

3 結(jié)論

本研究以川佛手中的多酚類物質(zhì)為研究對象，采用微波和超聲波提取方法，對川佛手中的多酚類物質(zhì)進行了有效提?。徊捎酶Ａ址釉噭╋@色法和紫外分光光度法，實現(xiàn)了多酚類物質(zhì)的有效檢測；通過單因素實驗條件優(yōu)化和正交試驗研究，得到了川佛手中多酚類物質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)；通過驗證實驗，驗證了最佳工藝條件參數(shù). 在最佳提取工藝參數(shù)條件下，川佛手多酚類物質(zhì)的提取率約為20.79 mg/g.

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[責(zé)任編輯：劉紅玲]

Process optimization of microwave and ultrasonic extraction of polyphenols from Chuan Bergamot

DENG Xiang1,2*, HUANG Xiaomei1,2, WANG Fen1

(1.DepartmentofChemistryandChemicalEngineering,SichuanUniversityofArtsandScience,Dazhou635000,Sichuan,China; 2.KeyLaboratoryoftheResearchonCharacteristicPlantsofUniversitiesinSichuanProvince,Dazhou635000,Sichua,China)

Polyphenols were extracted from Chuan Bergamot by microwave and ultrasonic method. Under the condition of microwave power 800 W and microwave extraction time of 40 min, the effects of ultrasonic power, ethanol concentration, extraction temperature, ultrasonic time and extraction material/solvent ratio on extraction efficiency were studied by single factor experiment. The optimal conditions were determined as follows: ultrasonic power of 800 W, ethanol volume fraction of 60%, extraction temperature of 55 ℃, ultrasonic time of 1.0 h and extraction liquid ratio of 1∶20 g/mL. The results showed the extraction rate of polyphenols in Chuan Bergamot was about 20.79 mg/g.

chuan bergamot; polyphenols; microwave; ultrasonic

2017-01-17.

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2015JY0033)，四川省教育廳重點項目(16ZA0356).

鄧 祥(1974-)，男，副教授，主要研究方向為天然藥物化學(xué).*

,E-mail:dxw8066031@163.com.

TQ914.1

A

1008-1011(2017)03-0353-06