劉彩霞, 顧文輝, 黃愛優(yōu), 3, 伍松翠, 張寶玉, 王廣策

?

兼養(yǎng)小球藻在不同濃度Fe3+培養(yǎng)下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

劉彩霞1, 2, 顧文輝1, 黃愛優(yōu)1, 3, 伍松翠1, 2, 張寶玉1, 王廣策1

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所實驗海洋生物學(xué)重點實驗室, 山東青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 ; 3. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋科學(xué)與技術(shù)研究發(fā)展中心, 江蘇南通 226006)

為研究小球藻()對不同濃度Fe3+的響應(yīng), 測定了自養(yǎng)和乙酸兼養(yǎng)小球藻在不同濃度Fe3+條件下的生長速率和油脂含量, 比較分析了兼養(yǎng)小球藻在不同濃度Fe3+下的蛋白質(zhì)組表達差異。結(jié)果表明, 兼養(yǎng)小球藻比自養(yǎng)小球藻生長速率快, 積累的生物量多, 在缺鐵條件下中性脂含量高。蛋白質(zhì)組分析顯示: 在缺鐵條件下光合作用相關(guān)蛋白含量最低; 在缺鐵和高濃度鐵條件下, 熱激蛋白、蛋白合成和糖代謝等過程相關(guān)蛋白表達都下調(diào), 表明缺鐵和高濃度鐵條件對小球藻的生長都是逆境條件; 在缺鐵條件下氨基酸代謝相關(guān)蛋白表達上調(diào), 這可能是由于NO3–同化下降, 氨基酸合成減少, 需要進行氮的回收利用。上述結(jié)果表明: 在兼養(yǎng)條件下缺鐵培養(yǎng)的小球藻可獲得較高生物量和中性脂含量; 而高濃度鐵能促進小球藻生長, 但不能提高中性脂含量, 對藻細胞也有一定的脅迫效應(yīng)。

小球藻(); 兼養(yǎng); 乙酸鹽; 鐵離子; 蛋白質(zhì)組

石化燃料的短缺和溫室氣體CO2排放的增多, 迫使人們尋找新的可替代能源。在眾多新能源中, 生物能源具有來源廣泛、污染小、可再生性等優(yōu)點, 應(yīng)用前景廣闊[1]。目前已發(fā)展作為生物能源的原料主要有谷物、菜油及微藻等。微藻具有生長周期短、產(chǎn)量大、油脂含量高等特點, 可以在遠離農(nóng)場和森林的地方(如池塘、發(fā)酵罐, 甚至廢水)進行培養(yǎng)[2], 不占用耕地, 對生態(tài)鏈和食物鏈的傷害小[3], 因而已逐漸成為生物燃油首選的原料。

微藻油脂含量是微藻生物柴油能否實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因子之一, 受營養(yǎng)鹽等生長條件的影響。已有報道, 氮缺乏[4-6]、磷限制[5-7]、高鹽[8]和重金屬脅迫[9]等條件均能促進微藻油脂積累。然而, 這些因子在提高油脂含量的同時也限制了生物量的積累, 并不能有效提高油脂產(chǎn)量。必須尋求其他調(diào)控因子, 在提高油脂含量的同時又不限制、甚至能促進生物量的積累。Behrenfeld等[10]證明鐵元素是影響浮游微藻生物量的關(guān)鍵因素; Liu等[11]發(fā)現(xiàn)在小球藻()指數(shù)生長后期補加鐵離子可提高細胞終密度, 在初始培養(yǎng)基中添加一定濃度鐵離子可以促進油脂積累。在此基礎(chǔ)上, 學(xué)者們對海洋微藻中的假微型海鏈藻[12]和某些淡水小球藻[13]、葡萄藻[14]、柵藻[15]等的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果, 說明鐵元素可以同時促進微藻的生長和油脂的積累。

上述研究大多在自養(yǎng)條件下進行, 在兼養(yǎng)條件下能否得到類似的結(jié)果？有研究報道, 外加有機碳源(如乙酸鹽, 糖漿, 甘油等)兼養(yǎng)也可提高小球藻油脂含量[16-17]。那么, 兼養(yǎng)條件下提高培養(yǎng)基中Fe3+的濃度是否也會促進小球藻油脂合成？作者以小球藻()為研究對象, 分別在自養(yǎng)和乙酸兼養(yǎng)條件下測定了不同濃度Fe3+對小球藻生長和油脂含量的影響, 比較分析了不同濃度Fe3+兼養(yǎng)小球藻的蛋白質(zhì)組表達差異, 以期從蛋白質(zhì)組角度對兼養(yǎng)條件下小球藻油脂積累途徑進行解析, 為人工控制提高小球藻油脂含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種和培養(yǎng)條件

研究所用小球藻()由本實驗室保存。所用培養(yǎng)基為改良的BG-11培養(yǎng)基, 將原BG-11培養(yǎng)基[18]中的鐵用FeCl3代替檸檬酸鐵, 自養(yǎng)時所用碳源為Na2CO3, 兼養(yǎng)時所用碳源為乙酸鈉。所有培養(yǎng)均在光照培養(yǎng)箱中進行, 光強為100 μmol/(m2·s),溫度為30℃, 光暗周期為12 h︰12 h(白天︰黑夜)。藻種分別在不含鐵的自養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后, 2 000 g離心收集重新接種到不含鐵的新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5 d, 使其充分缺鐵。最后藻液離心收集后重新懸浮于5.4 L不含鐵的新鮮培養(yǎng)基中, 混勻, 初始接種濃度為 0.1 (682)。將混勻的藻液均分到9個1 L的三角瓶中, 根據(jù)Liu等[11]的Fe3+設(shè)置濃度和前期試驗, 將Fe3+濃度設(shè)置為0、10–6和10–5mol/L共3個處理, 每個處理3個重復(fù)。每天定時搖瓶3次。

1.2 生長測定

用紫外分光光度計(UV-1800)測定682 nm處的吸光度來確定其生長速率, 當(dāng)藻細胞處于生長對數(shù)后期時, 2 000 g離心收集。

1.3 中性脂相對含量測定

中性脂的測定采用尼羅紅(Nile Red)染色, 熒光分光光度計(HITACHI F-4500)測定的方法[19-20]。在培養(yǎng)過程中, 每天定時取10 mL藻液, 根據(jù)值進行濃縮或稀釋, 使其為0.1~0.8。取900 μL藻液, 加入100 μL二甲基亞砜(DMSO), 混勻, 30℃水浴處理10 min。取處理后的藻液980 μL, 加入20 μL尼羅紅染料(濃度為0.1 mg/mL丙酮), 染色1 min 30 s后測定570 nm處的熒光值, 激發(fā)光為480 nm。根據(jù)值與細胞數(shù)換算成百萬細胞相對熒光值[20]。

1.4 總可溶性蛋白的提取

蛋白提取方法參照Wang等[21]的方法。在對數(shù)生長后期以2 000 g離心收集藻液, 去除上清, 液氮速凍后取0.5 g鮮藻于研缽中研磨5 min, 研磨時加適量石英砂。加蛋白提取液15 mL, 4℃放置0.5~2 h, 每20 min搖晃一次; 8 000 g 4℃離心20 min, 去除沉淀, 上清加入4倍體積的10%(/)三氯乙酸(TCA)-丙酮, 內(nèi)含0.07%(/)β-巰基乙醇, 于–20℃靜置過夜。8 000 g 4℃離心20 min, 去除上清, 用丙酮沖洗蛋白沉淀4次以去除三氯乙酸, 放置在–20℃使殘留的丙酮揮發(fā)。蛋白粉末使用8 mol/L尿素(含125 mmol/L碳酸氫銨)在室溫下(約25℃)充分溶解。8 000 g 4℃離心10 min, 去除未溶解沉淀。上清使用3K超慮管(Amicon Ultra 0.5 mL, Milipore)在8 000 g 4℃離心20 min;添加8 mol/L尿素, 超濾3次。

1.5 蛋白質(zhì)定量和質(zhì)譜檢測

使用Solarbio BCA蛋白濃度測定試劑盒(Cat#PC0020)進行蛋白定量, 以8 mol/L尿素稀釋, 使各樣品蛋白終濃度為1 mg/mL。蛋白樣品在37℃下用10 mmol/L DTT (二硫蘇糖醇)還原1 h; 在黑暗條件下用50 mmol/L碘乙酰胺處理30 min, 進行烷基化; 最后在37℃下用胰酶消化(胰酶︰蛋白為1︰30), 消化后的多肽用1%的甲酸酸化并貯存在–80℃, 以備LC-MS/MS檢測使用。質(zhì)譜檢測參照顧文輝的參數(shù)[22]。

2 結(jié)果

2.1 自養(yǎng)和兼養(yǎng)小球藻在不同鐵離子濃度下的生長速率

圖1顯示自養(yǎng)和兼養(yǎng)小球藻都是在高濃度鐵(1.2×10–5mol/L)條件下生長速率最快, 積累的生物量最多, 中濃度鐵時次之, 缺鐵(0 mol/L)時最慢。兼養(yǎng)條件下到達平臺期所需時間短, 積累的生物量多, 自養(yǎng)條件下到達平臺期所需時間長, 積累的生物量少。自養(yǎng)時, 在中濃度鐵和高濃度鐵條件下小球藻生長初期生長速率幾乎一致, 到生長后期高濃度鐵培養(yǎng)的小球藻生長速率比中濃度鐵濃度快, 20 d時缺鐵條件下小球藻生長接近平臺期,約為0.8, 中濃度和高濃度鐵則還在生長。兼養(yǎng)時, 小球藻的生長速率隨鐵離子濃度升高而加快, 缺鐵處理5 d到達平臺期,約為1.5, 高濃度鐵濃度培養(yǎng)條件下約9 d到達平臺期,約為3.0。與自養(yǎng)培養(yǎng)相比, 小球藻兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下在短時間內(nèi)積累了更多的生物量。

2.2 自養(yǎng)和兼養(yǎng)小球藻在不同F(xiàn)e3+濃度下中性脂百萬細胞熒光值

如圖2所示, 在缺鐵條件下, 自養(yǎng)和兼養(yǎng)小球藻隨著培養(yǎng)時間的推移中性脂百萬細胞相對熒光值逐漸上升, 隨后下降。自養(yǎng)時, 小球藻在第6天百萬細胞相對熒光值達到最高值, 兼養(yǎng)時一直處于較高水平, 在培養(yǎng)9 d后到最高值。中濃度鐵條件下, 自養(yǎng)時中性脂百萬細胞熒光值一直接近于0; 兼養(yǎng)時, 中性脂百萬細胞熒光值隨培養(yǎng)時間增加先上升后下降, 在第3 d到達最高值, 最后下降, 到第7天幾乎降為0。高濃度鐵條件下, 自養(yǎng)時中性脂百萬細胞熒光值一直接近于0, 兼養(yǎng)時小球藻的中性脂百萬細胞熒光值隨培養(yǎng)時間的增加急劇下降, 培養(yǎng)5 d后基本降為0。

2.3 兼養(yǎng)蛋白質(zhì)組結(jié)果分析

由生長速率和中性脂含量可以看出, 小球藻在兼養(yǎng)條件下能獲得較高的生物量和中性脂含量, 所以我們選取兼養(yǎng)的3組處理進行蛋白質(zhì)組分析。

由表1可以看出, PS Ⅱ相關(guān)蛋白(CP47、CP43、D2、D1和PsaA)在中濃度鐵條件下表達量最高, 在缺鐵和高濃度鐵條件下表達量都有所下降。PS Ⅰ相關(guān)蛋白(PsaA和PsaB)在缺鐵時含量最低, 中濃度鐵和高濃度鐵時均高于缺鐵時含量, 二者表達量相差不大。ATP酶的α和β亞基在中濃度鐵條件下含量最低, 缺鐵時含量高于高濃度鐵條件。大部分卡爾文循環(huán)相關(guān)的酶(果糖二磷酸醛縮酶和核酮糖-5-磷酸激酶)隨著鐵離子濃度的升高而表達量增加。PS Ⅰ鐵硫中心(PsaC)蛋白含量、放氧復(fù)合物相關(guān)蛋白和細胞色素b6/f復(fù)合體的b6和f蛋白含量都隨著鐵離子濃度的升高而升高。Fd-NADP氧化還原酶在缺鐵和高濃度鐵條件下含量較高, 缺鐵條件下的表達量高于高濃度鐵條件。儲鐵蛋白(ferrtin)在缺鐵和高濃度鐵時含量都較高。

碳代謝相關(guān)蛋白(主要是糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑的幾種酶)包括磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶等的含量都是在中濃度鐵時最高。

氨基酸代謝相關(guān)酶和聚泛素在缺鐵時含量最高, 均高于中濃度鐵和高濃度鐵水平; 微管蛋白和組蛋白都是在缺鐵和高濃度鐵條件下含量高, 且缺鐵時含量比高濃度鐵時要高, 中濃度鐵時最低。HSP70B、超氧化物歧化酶和硫氧還蛋白樣蛋白在高濃度鐵時都含量最高。

3 討論

3.1 缺鐵限制小球藻生長

由生長曲線(圖1)可以看出缺鐵限制了小球藻的生長。鐵元素是浮游植物生長的必需元素, 存在于光合生物色素合成的相關(guān)酶中, 是光合作用和呼吸作用電子傳遞鏈的主要組成成分, 也作為氮素同化的輔助因子[23]。光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)因為含鐵量高(3個4Fe-4S, 12Fe/PSⅠ), 成為鐵元素缺乏的主要靶標(biāo)[24], 同時, 鐵作為PSⅡ和細胞色素b6/f等電子傳遞系統(tǒng)組分的輔助因子, 缺鐵也會引起其含量下降[25]。蛋白質(zhì)組結(jié)果顯示, 缺鐵條件下PSⅠ和PSⅡ的光合元件含量較低, 可能已經(jīng)降解, 光合電子傳遞受到影響, 光反應(yīng)在缺鐵條件下受到抑制。植物體內(nèi)硝酸鹽和亞硝酸鹽的還原需要鐵元素作為輔助因子[26], 缺鐵會抑制植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成[27], 氨基酸和蛋白代謝相關(guān)蛋白在缺鐵時表達量高于中濃度鐵組和高濃度鐵組, 可能是在缺鐵條件下NO3–同化下降, 氨基酸合成減少; 同時, 蛋白的降解加快, 利于氨基酸的重新利用。微管蛋白和組蛋白在細胞分裂過程中起重要作用[28], 在缺鐵和高濃度鐵條件下含量都較高, 并且缺鐵時高于高濃度鐵的含量, 說明在缺鐵條件下細胞合成更多的骨架蛋白和組蛋白以備在條件適宜時進行細胞分裂和生長。

表1 通過LC-MS/MS鑒定的不同濃度鐵離子下的總可溶性蛋白的質(zhì)譜分析

Tab.1 Summary of the total soluble proteins identified by LC-MS/MS under different iron concentrations

3.2 兼養(yǎng)和缺鐵共同作用下獲得較高生物量和高油脂含量

有研究表明小球藻在兼養(yǎng)條件下, 生物量增加, 油脂含量提高[29]。小球藻在乙酸鹽兼養(yǎng)條件下生長速率快, 到達平臺期時間短, 生物量高。

中性脂測定結(jié)果(圖2)顯示缺鐵條件下小球藻積累中性脂。藻細胞通過卡爾文循環(huán)固定CO2, 核酮糖-1, 5-二磷酸羧化/加氧酶是碳固定的限速酶, 雖然該酶不直接需要鐵元素, 但碳同化過程消耗來自光反應(yīng)的ATP和NADPH, 這些物質(zhì)的供應(yīng)受到鐵缺乏的影響, 在缺鐵條件下表達下調(diào)[25, 30], 導(dǎo)致光合固碳減少, 光合作用生成的有機物減少。鐵元素是硝酸還原酶和亞硝酸還原酶的輔助因子, 在氮素的同化過程中有重要作用[26], 缺鐵時無法為植物生長提供足夠的氮源, 而藻細胞仍可直接吸收乙酸鹽形成乙酰CoA, 多余的碳將進行重新分配, 合成中性脂。中濃度鐵和高濃度鐵時, 細胞有足夠的鐵合成各種含鐵元件, 此時細胞同化的碳多用于合成細胞必需的蛋白和多糖, 細胞生長迅速, 合成中性脂的量少。

在缺鐵的培養(yǎng)條件下, 自養(yǎng)和兼養(yǎng)的小球藻都積累中性脂, 但兼養(yǎng)時中性脂含量比自養(yǎng)時高很多, 生物量也比自養(yǎng)時高。所以, 兼養(yǎng)和缺鐵共同作用下可獲得較高的生物量和油脂含量。

3.3 高濃度鐵促進生長, 但對細胞有一定的脅迫作用

高濃度鐵條件下生長速率最大。高濃度鐵下, 藻體合成大量光合相關(guān)蛋白和酶, 光反應(yīng)加快, 生成的ATP和NADPH增多, 卡爾文循環(huán)相關(guān)酶表達量隨著鐵離子濃度升高而上升, 加速了碳固定速率。鐵元素是很多生物過程的必需組分, 但鐵離子濃度過高會產(chǎn)生大量活性氧[31], 對細胞光合膜造成氧化傷害[32], 蛋白質(zhì)指結(jié)果顯示PS Ⅱ光合蛋白含量下降, 說明高濃度鐵離子對PS Ⅱ光合膜影響顯著, 但PS Ⅰ對此似乎并不敏感, 無明顯下降。生物有多種降低活性氧, 保護自身免受毒害的方式, 包括形成抗氧化分子(如谷胱甘肽、抗壞血酸、生育酚和類胡蘿卜素)和抗氧化酶(SOD、CAT和APOX)以保護植物免受氧化傷害[33]。高濃度鐵條件下, 與抗氧化相關(guān)的蛋白(熱激蛋白和超氧化物歧化酶)表達量最高, 說明高濃度鐵對小球藻造成氧化脅迫, 藻體合成更多抗氧化物質(zhì)進行自我保護, 免受氧化傷害。葉綠素本身不含鐵, 但合成葉綠素的部分酶需要鐵元素作為輔助因子[34], 葉綠素合成的相關(guān)酶(谷氨酸半醛氨基轉(zhuǎn)移酶)變化趨勢與光系統(tǒng)的變化趨勢一致, 在缺鐵時表達最低, 在中濃度鐵時表達最高, 高濃度鐵時比中濃度鐵時略有下調(diào), 說明葉綠素的合成與光系統(tǒng)蛋白含量是正相關(guān)的。

[1] Hill J, Nelson E, Tilman D, et al. Environmental, economic, and energetic costs and benefits of biodiesel and ethanol biofuels[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, 103(30): 11206-11210.

[2] Valderrama L T, Del Campo C M, Rodriguez C M, et al. Treatment of recalcitrant wastewater from ethanol and citric acid production using the microalga Chlorella vulgaris and the macrophyte Lemna minuscula[J]. Water Research, 2002, 36(17): 4185-4192.

[3] Chisti Y, Biodiesel from microalgae[J]. Biotechnology Advances, 2007, 25(3): 294-306.

[4] Illman A, Scragg A, hales S. Increase in Chlorella strains calorific values when grown in low nitrogen medium[J]. Enzyme and microbial technology, 2000, 27(8): 631-635.

[5] Li Y, Han F, Xu H, et al. Potential lipid accumulation and growth characteristic of the green alga Chlorella with combination cultivation mode of nitrogen (N) and phosphorus (P). [J]. Bioresource Technology, 2014, 174(1): 24-32.

[6] 王瑤華, 吳洪喜, 黃振華, 等. 氮磷硅對咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻繁殖速度和油脂積累的影響[J]. 海洋科學(xué), 2015, 38(4): 48-55. Wang Yaohua, Wu Hongxi, Huang Zhenghua, et al. Influence of nitrogen, phosphorous and silicon on reproduciing rate and lipid accumulation ofand[J]. Marine Sceiences, 2015, 38(4): 48-55.

[7] Reitan K I, Rainuzzo J R, Olsen Y. Effect of nutrient limitation on fatty acid and lipid content of marine microalgaeM1[J]. Journal of Phycology, 1994, 30(6): 972-979.

[8] Rao A R, Dayananda C, Sarada R, et al. Effect of salinity on growth of green alga Botryococcus braunii and its constituents[J]. Bioresource technology, 2007, 98(3): 560-564.

[9] Guschina I A, Harwood J L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae[J]. Progress in Lipid Research, 2006, 45(2): 160-186.

[10] Behrenfeld M J, Worthington K, Sherrell R M, et al. Controls on tropical Pacific Ocean productivity revealed through nutrient stress diagnostics[J]. Nature, 2006, 442(7106): 1025-1028.

[11] Liu Z Y, Wang G C, Zhou B C. Effect of iron on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(11): 4717-4722.

[12] 蔣瑜, 嚴(yán)小軍, 朱鵬, 等. Fe3+脅迫對假微型海鏈藻中性脂累積及DGAT表達的影響[J]. 海洋科學(xué), 2013, 36(3): 87-94. Jiang Yu, Yan Xiaojun, Zhu Peng, et al. Influence of iron stress on neural lipid accumulation and DGAT expression in[J]. Marine Sciences, 2013, 36(3): 87-94.

[13] Concas A, Steriti A, Pisu M, et al. Comprehensive modeling and investigation of the effect of iron on the growth rate and lipid accumulation of Chlorella vulgaris cultured in batch photobioreactors[J]. Bioresource Technology, 2014, 153: 340-350.

[14] Ruangsomboon S. Effect of light, nutrient, cultivation time and salinity on lipid production of newly isolated strain of the green microalga, Botryococcus braunii KMITL 2[J]. Bioresource Technology, 2012. 109(1): 261-265.

[15] Ruangsomboon S, Ganmanee M, Choochote S. Effects of different nitrogen, phosphorus, and iron concentrations and salinity on lipid production in newly isolated strain of the tropical green microalga, Scenedesmus dimorphus KMITL[J]. Journal of Applied Phycology, 2013, 25(3): 867-874.

[16] Najafabadi H A, Malekzadeh M, Jalilian F, et al. Effect of various carbon sources on biomass and lipid production of Chlorella vulgaris during nutrient sufficient and nitrogen starvation conditions[J]. Bioresource Technology, 2015, 180: 311-317.

[17] Rai M P, Nigam S, Sharma R. Response of growth and fatty acid compositions of Chlorella pyrenoidosa under mixotrophic cultivation with acetate and glycerol for bioenergy application[J]. Biomass & Bioenergy, 2013, 58: 251-257.

[18] Stanier R, Kunisawa R, Mandel M, et al. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales)[J]. Bacteriological Reviews, 1971, 35(2): 171.

[19] Fowler S D, Brown W J, Warfel J, et al. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms[J]. Journal of Lipid Research, 1987, 28(10): 1225-1232.

[20] 劉志媛. 鐵對幾種不同代謝類型微藻的生長和油脂積累的影響[D]. 青島: 中國科學(xué)院海洋研究所, 2008. Liu Zhiyuan, Effect of iron on growth and lipid accumulation in several microalgae with different metabolic type[D]. Qingdao: Insititute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences. 2008.

[21] Wang S B, Hu Q, Sommerfeld M, et al. An optimized protocol for isolation of soluble proteins from microalgae for two-dimensional gel electrophoresis analysis[J]. Journal of Applied Phycology, 2003, 15(6): 485-496.

[22] 顧文輝. 積累類胡蘿卜素的綠藻類囊體膜蛋白組學(xué)研究[D]. 青島: 中國科學(xué)院海洋研究所, 2014. Gu Wenhui. Quantitative proteomics of thylakoid membranes in carotenoids accumulating Chlorophytes[D]. Qingdao: Insititute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, 2014.

[23] Geider R J, La Roche J. The role of iron in phytoplankton photosynthesis, and the potential for iron-limitation of primary productivity in the sea[J]. Photosynthesis Research, 1994, 39(3): 275-301.

[24] Straus N A. Iron Deprivation: Physiology and Gene Regulation, in[M]. Rryan D B. Springer Netherlands: Dordrecht, 1994: 731-750.

[25] Singh A K, McIntyre L M, Sherman L A. Microarray analysis of the genome-wide response to iron deficiencyand iron reconstitution in the cyanobacteriumsp.[J]. PCC 6803. Plant Physiology, 2003, 132(4): 1825-1839.

[26] Salisbury F, Ross C. Plant physiology[M]. Wadsworth: Wadsworth Publishing Company Inc, 1978.

[27] 鄒春琴, 張福鎖, 毛達如. 鐵對玉米體內(nèi)氮代謝的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1998, 5: 45-49. Zou Chunqin, Zhang Fusuo, Mao Daru. Effect of iron supply on nitrogen metabolism of corn[J]. Journal of China Agricultural University, 1998, 5: 45-49.

[28] Yoshikawa M, Yang G, Kawaguchi K, et al. Expression analyses of β-tubulin isotype genes in rice[J]. Plant and Cell Physiology, 2003, 44(11): 1202-1207.

[29] Heredia-Arroyo T, Wei W, Ruan R, et alMixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris and its potential application for the oil accumulation from non-sugar materials[J]. Biomass and Bioenergy, 2011, 35(5): 2245-2253.

[30] Winder T L, Nishio J N. Early iron deficiency stress response in leaves of sugar beet[J]. Plant Physiology, 1995, 108(4): 1487-1494.

[31] Kampfenkel K, Van Montagu M, Inzé D. Effects of iron excess onplants (implications to oxidative stress)[J]. Plant Physiology, 1995, 107(3): 725-735.

[32] Gallego S M, Benavides M P, Tomaro M L. Effect of heavy metal ion excess on sunflower leaves: evidence for involvement of oxidative stress[J]. Plant Science, 1996, 121(2): 151-159.

[33] Asada K. Ascorbate peroxidase–a hydrogen peroxide- scavenging enzyme in plants[J]. Physiologia Plantarum, 1992, 85(2): 235-241.

[34] Marsh J H, Evans H, Matrone G. Investigations of the role of iron in chlorophyll metabolism. I. Effect of iron deficiency on chlorophyll synthesis I[J]. Plant Physiology, 1963, 38(6): 638.

(本文編輯: 梁德海)

Proteomic analysis of mixotrophic cultivation ofexposed to different iron concentrations

LIU Cai-xia1, 2, GU Wen-hui1, HUANG Ai-you1, 3, WU Song-cui1, 2, ZHANG Bao-yu1, WANG Guang-ce1

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3.Nantong Branch, Institute of Oceanology, Chinese, Academy of Sciences, Nantong 226006, China)

Here, we investigated the effect of different iron concentrations on the growth rate and lipid content of autotrophic and mixotrophic cultivations of. Differential expression of proteins in mixotrophicexposed to different iron concentrations was analyzed. The results showed that mixotrophic cultivation demonstrated a faster growth rate and improved biomass than autotrophic cultivation. Iron deficiency may result in an increase in the lipid content. Proteomics analysis showed that the concentration of iron-containing proteins involved in photosynthesis was low in an iron-deficient culture condition. Hot shock proteins as well as proteins involved in translation and glycolysis were downregulated under both low and high iron concentrations, indicating that these growth conditions were stressful for. The concentration of proteins involved in amino acid metabolism increased under iron-deficient conditions, possibly due to downregulation of NO3?assimilation and amino acid synthesis. These results showed that both the growth rate and lipid content in mixotrophicwere higher under iron-deficient conditions. The growth ofwas accelerated under conditions of high iron concentrations, without affecting its lipid content. These results imply that high iron concentrations lead to a stress effect on the cells of.

; mixotrophic; acetate; Fe3+; proteomics

Jun. 11, 2016

[International S & T Cooperation Program of China (2015DFG32160), Ministry of Science and Technology of PRC fundamental research work (2012FY112900-01); Nantong Science and Technology Planning Project 2014 (AS2014007); Postdoctoral Innovation Project Special Funds of Shandong Province (2014)]

Q949.21

A

1000-3096(2017)03-0001-07

10.11759/hykx20160330001

2016-06-11;

2016-10-03-08

科技部國際合作專項(2015DFG32160); 科技部國家科技基礎(chǔ)性工作專項(2012FY112900-01); 南通市2014年科技計劃項目(AS2014007); 山東省博士后創(chuàng)新計劃項目(2014)

劉彩霞(1989-), 女, 山東青島人, 碩士研究生, 從事藻類分子生理學(xué)與發(fā)育調(diào)控研究, 電話: 0523-82898575, E-mail: caixliu@126.com; 張寶玉, 通信作者, 副研究員, 電話: 0532-82898923, E-mail: by-zhang@163.com; 王廣策, 通信作者, 研究員, 電話: 0532-82898574, E-mail: gcwang@qdio.ac.cn