唐偉偉, 肖 堯, 汪 輝, 劉天中, 羅國強, 曾 娟, 吳曉娟, 張朝暉

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利用多層薄層貼壁光生物反應器室外培養(yǎng)螺旋藻的研究

唐偉偉1, 肖 堯2, 汪 輝3, 劉天中3, 羅國強2, 曾 娟2, 吳曉娟2, 張朝暉1

(1. 中國海洋大學食品科學與工程學院, 山東青島 266003; 2. 成都通威水產(chǎn)科技有限公司, 四川成都 610081; 3. 中國科學院青島生物能源與過程研究所, 中國科學院生物燃料重點實驗室, 山東青島 266101)

設計開發(fā)一套新型多層薄層貼壁光生物反應器裝置, 利用其在室外進行螺旋藻(sp.)的高密度培養(yǎng), 對適合螺旋藻的工業(yè)貼壁介質材料及光稀釋倍數(shù)進行初步考察和評價。實驗結果表明: 附著在超細纖維毛巾上的螺旋藻生物量產(chǎn)率(30~60 g/(m2·d))要高于附著在植絨材料上的螺旋藻生物量產(chǎn)率(10~40 g/(m2·d)); 在實驗期間, 當光稀釋倍數(shù)達到10×時, 螺旋藻的生物量產(chǎn)率可達到45~60 g/(m2·d),明顯高于2.5×及5×光稀釋倍數(shù)下的生物量產(chǎn)率; 連續(xù)培養(yǎng)8 d的螺旋藻平均生物量產(chǎn)率達到30.3 g/(m2·d),且其營養(yǎng)成分與傳統(tǒng)液體培養(yǎng)的螺旋藻營養(yǎng)成分一致。上述結果為該反應器的規(guī)?；瘧锰峁┲С?。

螺旋藻(sp.); 貼壁培養(yǎng); 光生物反應器; 生物量產(chǎn)率

螺旋藻(sp.)是一類常見的絲狀多細胞微藻, 其蛋白質含量高達60%~70%[1], 氨基酸組成平衡, 含有豐富的類胡蘿卜素、礦物質元素及不飽和脂肪酸, 且含有多種生物活性物質[2]。另外, 螺旋藻細胞壁的構成主要為蛋白質, 纖維素含量少, 極易消化吸收, 因此被認為是優(yōu)良的飼料添加劑或魚粉的潛在替代物[3-4]。然而, 要實現(xiàn)螺旋藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的廣泛應用, 保證螺旋藻資源量以可接受的價格穩(wěn)定供應是前提條件。

光能利用是室外規(guī)模培養(yǎng)時影響微藻生長效率的最主要的因素[5-8]。開放式跑道池或光反應器培養(yǎng)是目前微藻培養(yǎng)比較成熟的系統(tǒng), 但這兩種培養(yǎng)方式對光能的利用率都不高。本實驗室曾經(jīng)構建“微藻半干貼壁培養(yǎng)”的單層反應器, 此種培養(yǎng)模式能夠使單位面積的光利用效率得到大幅度提高[9]。目前也已有相關實驗證實, 單層貼壁培養(yǎng)單位面積藻體生物量與液體懸浮培養(yǎng)下的藻生物量相比持平或稍高, 如程鵬飛[10]分別采用單層貼壁和液體懸浮法對葡萄藻()進行培養(yǎng), 結果發(fā)現(xiàn)其生物量產(chǎn)率分別為4.78g/m2/d和4.43g/m2/d, 表明單層貼壁培養(yǎng)下葡萄藻的生物產(chǎn)率略高于液體懸浮培養(yǎng)。研究表明在采用多層貼壁培養(yǎng)時, 微藻的生物量較單層培養(yǎng)有極大提高。劉金麗等[11]采用多層插板光生物反應器培養(yǎng)柵藻(sp.), 最高生物量產(chǎn)率達到80.75g/m2/d, 遠遠高于柵藻在跑道池中的生物量產(chǎn)率(7~10 g/(m2·d))。Cheng等[12]利用插板式陣列貼壁培養(yǎng)反應器對進行貼壁培養(yǎng), 結果表明在光稀釋倍數(shù)為10×的條件下, 其生物量產(chǎn)率與光合作用效率最高, 分別達到49.1 g/(m2·d)和14.9%。

基于此, 本研究設計開發(fā)了一套新型多層薄層貼壁光生物反應器的裝置, 并采用此裝置在室外進行螺旋藻的培養(yǎng)。對適合螺旋藻高密度生長的貼壁材料進行篩選, 并研究了不同光稀釋倍數(shù)下螺旋藻的生物量積累情況以及連續(xù)培養(yǎng)下螺旋藻的生物量產(chǎn)率。研究結果為該反應器在螺旋藻規(guī)模培養(yǎng)中的推廣應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

本實驗所用螺旋藻來自中國海洋大學藻種保藏中心, 所用培養(yǎng)基為Zarrouk培養(yǎng)基。

1.2 反應器設計

本實驗所用反應器為多層薄層貼壁光生物反應器, 反應器長1 m, 寬0.3 m, 高0.3 m, 整個裝置置于0.3 m高的支架上。為了能夠更好的吸收太陽光能, 該裝置的底部和四周全部采用玻璃制成, 頂部敞開便于實驗操作。如圖1所示, 貼壁材料上方布有直徑為5 mm的塑料通水管, 每隔2 cm設有一個滴水口, 培養(yǎng)基可經(jīng)此口流至貼壁材料表層。反應器底部開有直徑為1 cm的一個小孔, 流經(jīng)材料表層的培養(yǎng)基在此匯集流入置于小孔下層的盛有培養(yǎng)基的塑料桶中, 而后經(jīng)水泵運輸至材料上端的通水管中, 形成培養(yǎng)基的循環(huán)。該裝置具有較高的光稀釋能力, 根據(jù)稀釋倍數(shù)=2/(為高度、為懸掛的貼壁材料之間的距離), 可根據(jù)光照強度將強光進行不同倍數(shù)的稀釋, 使之不會產(chǎn)生較強的光抑制現(xiàn)象。

1.3 螺旋藻的接種及培養(yǎng)條件

實驗于2015年6月至2015年8月在青島室外進行, 溫度約為19~31℃。

利用傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)獲得足量的處于對數(shù)生長期的螺旋藻藻液, 適當濃縮藻液, 將濃縮后的藻液按照10 g/m2的接種量仔細傾倒在多層薄層貼壁光生物反應器內(nèi)事先懸掛好的貼壁材料上, 盡量使藻液能夠均勻附著在貼壁材料表層。將10 L Zarrouk培養(yǎng)基經(jīng)水泵輸入至貼壁培養(yǎng)材料上端的通水管中, 培養(yǎng)基流速以不沖刷下螺旋藻藻細胞為準。

1.4 不同貼壁材料對螺旋藻生長的影響

實驗室以往研究表明微藻細胞在超細纖維毛巾和植絨材料上的粘附性能較好, 因此本實驗選用這兩種材料做為測試材料。根據(jù)10×的光稀釋倍數(shù)計算好貼壁材料之間的間距, 分別將超細纖維毛巾及植絨材料懸掛好。采用如1.3所示的方式將螺旋藻細胞接種至材料上, 通入培養(yǎng)基正常培養(yǎng)1~3 d, 使藻細胞能夠均勻的附著在貼壁材料上。然后采用輕刮方式, 將材料表層的螺旋藻細胞刮下而只留表面一層作為下批次培養(yǎng)的種子液, 待螺旋藻細胞生長1 d后, 再將其刮下且也只留表面一層做為下批次培養(yǎng)的種子液, 連續(xù)操作3 d, 測試螺旋藻每天的生物量產(chǎn)率。

1.5 不同光稀釋倍數(shù)下螺旋藻的生物量產(chǎn)率

選用最適貼壁材料, 根據(jù)2.5×、5×和10×的稀釋倍數(shù)來計算間距并懸掛好材料, 接種、培養(yǎng)以及測試方法如1.4所示。

1.6 螺旋藻在新型多層薄層光生物反應器中的連續(xù)高密度培養(yǎng)

根據(jù)上述試驗結果, 選用最適貼壁材料以及最佳光稀釋倍數(shù)。螺旋藻的接種方法如1.3所述一致。將接種完畢的螺旋藻培養(yǎng)1~3 d后, 同樣采取輕刮方式, 將材料表層的螺旋藻細胞刮下而只留表面一層做為下批次培養(yǎng)的種子液。連續(xù)培養(yǎng)8 d后, 將每天所收集的藻細胞進行稱重并計算其產(chǎn)率。

1.7 生物量測定及生物量產(chǎn)率計算

將刮取收獲的螺旋藻藻泥稀釋至特定體積, 取其中一定體積的藻液抽濾至事先稱重過的醋酸硝酸纖維素膜(0), 并用3倍體積的去離子水沖洗3次, 以去掉附著在細胞表面的鹽分, 105℃烘干至恒重后再次稱重1, 則生物量干重的計算方法[13]為

D=(1－0)/(1)

生物量產(chǎn)率的計算方法如下, 第天的生物量為W, 初始接種量為0, 那么第天的生物量產(chǎn)率為

P= (W－0)/(2)

1.8 營養(yǎng)成分分析

稱取螺旋藻干粉0.5 g, 加入蒸餾水, 冰浴中研磨0.5 h, 凍融3次, 定容至250 mL, 4℃冷藏過夜, 采用考馬斯亮藍法[14]測定螺旋藻的蛋白含量。取一定體積的藻液, 離心獲得藻細胞, 凍融3次, 離心后收集凍融的上清液, 采用苯酚-硫酸[15]法測定樣品提中多糖含量。稱取螺旋藻干粉0.05 g, 在研磨過程中, 加入一定量氯仿-甲醇(1/2,/)進行油脂的提取, 振蕩過夜后, 加入一定量的三氯甲烷和蒸餾水, 離心分層, 氮吹有機相, 稱重測量油脂含量[16]。

1.9 統(tǒng)計分析

使用spss10.0對實驗組與對照組做檢驗, 當<0.05時認為兩者存在顯著差異。圖中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值±標準差。

2 結果

2.1 螺旋藻在不同貼壁材料上的生物量產(chǎn)率

為了保證其他培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基流速、光照、溫度)的一致性, 本研究將要試驗用的的兩種貼壁材料懸掛在同一個反應器內(nèi)。試驗期間反應器外部的光照強度由圖2列出, 其中6月24日和25日是晴天, 光照比較充足, 6月26日多云轉陰, 光照強度比較弱。

光照強度的變化直接體現(xiàn)在螺旋藻的生物量產(chǎn)率上。如圖3所示, 6月24日與25日(晴天), 接種在超細纖維毛巾上的螺旋藻的占地產(chǎn)率能夠達到60~ 70 g/(m2·d), 接種在植絨上的螺旋藻占地產(chǎn)率約為40 g/(m2·d); 6月26日(多云轉陰)接種在超細纖維毛巾上的螺旋藻占地產(chǎn)率約為30 g/(m2·d), 而接種在植絨上的螺旋藻占地產(chǎn)率僅為12 g/(m2·d)。從結果中可知螺旋藻在超細纖維毛巾上的生物量產(chǎn)率比在植絨上的生物量產(chǎn)率要高, 因此在以后的實驗中作者采用超細纖維毛巾做為反應器的貼壁材料。

2.2 不同光稀釋倍數(shù)下螺旋藻的生物量產(chǎn)率

圖4所示的是測試不同光稀釋倍數(shù)下螺旋藻生物量產(chǎn)率試驗期間青島室外光照強度變化情況, 由圖中可知, 試驗期間每日光照強度之前變化不大。7月7日至7月10日的試驗結果如圖5所示, 隨著稀釋倍數(shù)的增加, 螺旋藻的生物量產(chǎn)率也逐漸增加。當稀釋倍數(shù)為2.5×, 生物量產(chǎn)率約為30~40 g/(m2·d); 當稀釋倍數(shù)為5×時, 螺旋藻生物量產(chǎn)率為35~50 g/(m2·d); 當光稀釋倍數(shù)達到10×時, 螺旋藻的生物量產(chǎn)率可達到45~60 g/(m2·d)。這說明一定空間內(nèi), 總體接種量越大, 即光稀釋倍數(shù)越高, 培養(yǎng)期間增加的藻的絕對生物量也會越多。

2.3 不同培養(yǎng)時間下黃絲藻的生物量產(chǎn)率

根據(jù)10×的光稀釋倍數(shù)事先懸掛好超細纖維毛巾, 隨后將液體懸浮培養(yǎng)的螺旋藻細胞適當濃縮后按照約10g/m2的接種密度接種至其表層, 培養(yǎng)1~3 d后, 將表層藻細胞輕刮下, 然后將螺旋藻細胞連續(xù)培養(yǎng)8 d。培養(yǎng)期間每天取樣, 測試不同培養(yǎng)時間下的螺旋藻生物量及生物量產(chǎn)率。

試驗期間的光照強度變化如圖6所示, 可知試驗期間每日的光照強度大不相同, 勢必造成螺旋藻每日的生物量產(chǎn)率的差異。由圖7可知, 試驗期間, 螺旋藻的生物量在持續(xù)增加, 但其每天的生物量產(chǎn)率卻不一樣, 最低時約23 g/m2/d, 最高時可達到70 g/m2/d。培養(yǎng)8 d的螺旋藻的平均占地生物量產(chǎn)率約30 g/m2/d, 高于已報道的各種傳統(tǒng)式開放跑道池和各種相對封閉式光生物反應器[17-18]。

2.4 不同培養(yǎng)時間下螺旋藻的營養(yǎng)成分

表1所示的是在連續(xù)培養(yǎng)8 d內(nèi), 不同培養(yǎng)時間下取樣的螺旋藻的營養(yǎng)成分比較。由表中可以看出, 不同培養(yǎng)時間下螺旋藻的蛋白質含量隨培養(yǎng)時間的增加總體上呈現(xiàn)遞增趨勢。培養(yǎng)1 d的螺旋藻蛋白質含量占干重比例為46.93%, 而最高的為53.4%。而螺旋藻總脂和多糖的含量變化不大, 分別占細胞干重的約9%和10%左右。根據(jù)報道, 柱狀光生物反應器內(nèi)液體培養(yǎng)的螺旋藻的蛋白含量約占干重的51%[19], 因此在該反應器下以半干貼壁培養(yǎng)方式培養(yǎng)出來的螺旋藻的營養(yǎng)成分與液體培養(yǎng)的營養(yǎng)成分是一樣的。

3 討論

隨著微藻產(chǎn)業(yè)的興起, 藻類光生物反應器的設計研制已成為藻類生物技術的一個重要研究內(nèi)容。長期以來, 傳統(tǒng)的跑道式開放池和封閉式光生物反應器培養(yǎng)所需的水分是巨大的, 超過所需的過量的水分會增加微藻培養(yǎng)中的能耗, 物耗, 增大投資成本。近年來, 許多學者轉變思路, 將藻細胞進行固定化培養(yǎng)研究。如Johnson等[20]在泡沫塑料上培養(yǎng)小球藻; Bailiez等[21]將布朗葡萄藻細胞固定在海藻酸鈣凝膠上進行培養(yǎng); Altan Ozkan等[22]將葡萄藻附著在載有生物膜的水泥板上進行培養(yǎng)等。雖然這些研究并沒有顯著提高微藻的生物產(chǎn)率, 然而卻證明微藻在濕潤固體介質上培養(yǎng)的可能性。因此本實驗室提出了“貼壁培養(yǎng)法”這一概念。貼壁培養(yǎng)介質是微藻貼壁培養(yǎng)技術的關鍵。一方面介質影響藻細胞的生長, 另一方面介質構成了反應器培養(yǎng)的主要成本。因此選擇一種與微藻具有良好的生物相容性[23]、耐用性、經(jīng)濟性和可循環(huán)使用等特征的介質材料尤其重要。Zhang 等[19]采用單層貼壁培養(yǎng)模式考察微藻在4種工業(yè)材料(靜電植絨、海綿泡沫、地毯纖維和超細纖維毛巾)上的生長狀況。本研究在此基礎上, 選用其中兩種工業(yè)材料(植絨和超細纖維毛巾)作為研究對象, 進一步考察其中適合螺旋藻生長且經(jīng)濟的支撐材料, 為螺旋藻貼壁培養(yǎng)的規(guī)模化提供可行性實驗依據(jù)。需要指出的是, 每一種微藻因形態(tài)、大小、細胞表面親疏水性大不相同, 因此最適合其生長的介質材料也不盡相同。

表1 不同培養(yǎng)時間下螺旋藻的營養(yǎng)成分(%)

Tab.1 Nutrients of Spirulina sp. harvested on different days(%)

微藻的生長依賴于光照, 但任何微藻的生長都需要一個合理的介于微藻補償光強(Ic)和飽和光強(Is)之間的光強范圍[24]。由于微藻貼壁培養(yǎng)不同于傳統(tǒng)的懸浮培養(yǎng), 光照幾乎直接照到細胞表面而很少有光的衰減。微藻單層貼壁培養(yǎng)下的飽和光強為100~150μmol/m2/s, 但室外太陽光強可達400~ 2 000 μmol/m2/s, 遠高于其飽和光強。結果是一方面微藻生長受到光抑制, 一方面, 高于微藻飽和光強的光不能為微藻所利用, 造成光能利用率低、生物質產(chǎn)率低。為解決強光抑制和光能利用率的問題, 本文利用光強稀釋的反應器設計原理, 即在反應器設計中將高強太陽光通過一定的工程技術手段稀釋到微藻的補償光強和飽和光強之間, 以便讓強光盡可能的為微藻所吸收利用。這種光強稀釋的直接表現(xiàn)就是將一定入射光面積(占地面積)上的自然太陽光分散到更大的表面上, 即微藻培養(yǎng)面積遠大于入射光面面積(占地面積)[9]?；谶@種原理, 本文設置了3個光稀釋倍數(shù)(2.5×、5×和10×)并根據(jù)此光稀釋倍數(shù)調整貼壁介質之間的間距, 在相同的占地面積上形成三種不同規(guī)模的微藻培養(yǎng)面積。本研究中可知隨著稀釋倍數(shù)的增加, 螺旋藻的占地面積上的總體生物量產(chǎn)率也逐漸增加, 10×的光稀釋倍數(shù)下螺旋藻的生物產(chǎn)率最高, 表明: 在一定接種密度時, 采用較高稀釋倍數(shù)的反應器即擴大微藻的培養(yǎng)面積可獲得較大的生物量。此結論也可用于空間一定的微藻規(guī)?；囵B(yǎng), 低接種量時, 密集放置增大培養(yǎng)面積可使利用太陽光進行光合作用并進行生物量積累的藻細胞比例增大, 導致細胞群整體對陽光的利用率高, 進而表現(xiàn)出整體高產(chǎn)優(yōu)勢。這是微藻貼壁培養(yǎng)能夠實現(xiàn)高產(chǎn)率的重要原因之一。

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(本文編輯: 梁德海)

Cultivation ofsp. in a photobioreactor attached with thin multilayers

TANG Wei-wei1, XIAO Yao2, WANG Hui3, LIU Tian-zhong3, LUO Guo-qiang2, ZENG Juan2, WU Xiao-juan2, ZHANG Zhao-hui1

(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Tongwei Aquatic Science and Technology Co., Ltd, Chengdu 610081, China; 3. CAS Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China)

A new cultivation device attached with thin multilayers was designed for the outdoor cultivation ofsp. This study aimed to determine a suitable substratum for attachment and the light dilution rate forsp. cultivation. The results showed that the biomass productivity ofsp. attached onto a superfine fiber towel (30–60 g/(m2·d)) was higher than that ofsp. attached onto a flocking cloth (10–40 g/m2/day). In addition, the cells ofsp. were cultivated in a device with different light dilution rates (2.5×, 5×, and 10×), and the highest biomass productivity (45–60 g/(m2·d)) after daily harvesting was observed at the dilution rate of 10×. The average biomass productivity ofsp. reached approximately 30.3 g/(m2·d) on the eighth day of cultivation, and the nutrients in the cells ofsp. were similar to those in cells cultivated in the conventional suspended medium. Thus, the results supported the idea of improving the production scale of the reactor.

sp.; attached cultivation; PBRs; biomass productivity

Jul. 13, 2016

[enterprise cooperation project (TW2014D009)]

Q945.1

A

1000-3096(2017)03-0026-06

10.11759/hykx20160307003

2016-07-13;

2016-09-22

企業(yè)合作項目(TW2014D009)

唐偉偉(1990-), 女, 碩士研究生, 主要從事微藻生理學方面的研究, 電話: 0532-80662737, E-mail:970094210@qq.com; 汪輝, 通信作者, E-mail:wanghui@qibebt.ac.cn