楊鐵柱, 沈和定, 史艷梅, 劉 欣, 吳 欣, 李 杰

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瘤背石磺表皮生長因子基因的克隆、結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析

楊鐵柱, 沈和定, 史艷梅, 劉 欣, 吳 欣, 李 杰

(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

首次在瘤背石磺()中克隆得到一種新的表皮生長因子(EGF)的cDNA序列全長。EGF基因cDNA的全長為1158bp, 命名為1, 其中開放閱讀框長度為846 bp, 編碼一條包含281個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。根據(jù)氨基酸序列比對和結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含有2個(gè)保守的EGF結(jié)構(gòu)域和1個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域, 每個(gè)結(jié)構(gòu)域中均包含至少6個(gè)半胱氨酸殘基, 且形成CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C結(jié)構(gòu), 其結(jié)構(gòu)域由C1~C3、C2~C4和C5~C6之間形成的3個(gè)二硫鍵維持, 符合表皮生長因子家族及其相關(guān)蛋白的特征結(jié)構(gòu)域, 但其余氨基酸序列與現(xiàn)有相關(guān)基因差異較大, 推測可能是一種新的EGF-like基因。利用MEGA6.0軟件構(gòu)建1與EGF家族相關(guān)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹, 表明EGF家族蛋白具有一定的物種特異性。

瘤背石磺(); EGF; 基因克隆; 系統(tǒng)進(jìn)化分析

瘤背石磺()隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、肺螺亞綱(Pulmonata)、縮眼目(Systellommatophora)、石磺科(Onchidiidae), 是一種具有很高的食用和藥用價(jià)值的貝類[1-3]。其分布區(qū)域常見于我國的江蘇、上海、浙江、福建、廣東等地的淡水和咸水交匯處的高潮帶, 其溫度適應(yīng)性強(qiáng), 分布范圍廣, 資源量非常豐富。目前國內(nèi)外學(xué)者對石磺的研究主要集中在系統(tǒng)分類[4-5]、生物學(xué)特征、胚胎發(fā)育、營養(yǎng)價(jià)值、受精和繁殖機(jī)制以及活性物質(zhì)的分離提取等方面[6-8], 未涉及功能基因組的范疇, 本文對于瘤背石磺功能基因的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化進(jìn)行了較為深入的分析, 希望能為瘤背石磺的功能基因研究積累資料。

EGF(Epidermal growth factor)是由Cohen[9]博士在1962年一次實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)的, 也是最早發(fā)現(xiàn)并確立結(jié)構(gòu)的生長因子。隨后的研究表明, EGF廣泛存在于人類及其他動(dòng)物體內(nèi), 從低等到高等、單細(xì)胞到多細(xì)胞、海洋到陸地均能發(fā)現(xiàn)其存在。EGF并不是單一的生長因子, 而是一個(gè)有眾多生長因子所組成的大家族, 它包括轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor-α, TGF-α)、肝素結(jié)合性表皮生長因子(heparin binding EGF, HB-EGF)、雙調(diào)蛋白(amphiregulin, AR)、細(xì)胞素(betacellulin, BTC)、神經(jīng)調(diào)節(jié)素(neuregulin, NGR)與表皮素(epiregulin, EPR)等[10]。這些因子中都包含至少1個(gè)由3對二硫鍵所維持具有高度保守性的EGF-like結(jié)構(gòu)域[11]。在生物學(xué)過程中, EGF需要與EGF受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)相結(jié)合, 形成同源或異源二聚體, 以引發(fā)諸如ras-raf-MEK-erk/MAPK和P13K-PKC-IKK等下游信號通路, 介導(dǎo)細(xì)胞間的信號傳導(dǎo), 促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部相應(yīng)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成分泌, 從而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行增殖、遷移和分化等生物學(xué)過程[12-13]。

目前對于EGF的研究主要集中在人類等高等脊椎動(dòng)物上, 例如EGF在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平變化情況[14]、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要性[15]以及對燒傷創(chuàng)面修復(fù)的臨床應(yīng)用[16]等, 然而在無脊椎動(dòng)物, 尤其是海洋生物中涉及甚少。朱文杰等[17]從合浦珠母貝()中克隆得到EGF同源基因1, 并發(fā)現(xiàn)在腸道修復(fù)和幼蟲表態(tài)發(fā)育階段起著重要作用。Hermann等[18]從靜水椎實(shí)螺()中克隆得到EGF同源基因, 發(fā)現(xiàn)其在生長及損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。以及Hursh[19]和Bisgrove[20]在紫球海膽()、Woods[21]和Eri[22]從海鞘()中均克隆出EGF家族相關(guān)基因。

本實(shí)驗(yàn)采用瘤背石磺作為研究對象, 主要是由于其作為棲息于灘涂半咸水區(qū)域的兩棲性生物方便采集。另外, 在采集后的暫養(yǎng)工作在本實(shí)驗(yàn)室已趨于成熟。而在攝食和運(yùn)動(dòng)過程中, 瘤背石磺直接與外界接觸的表皮有大量損耗, 也相應(yīng)刺激表皮生長因子的表達(dá)。故在本實(shí)驗(yàn)中選取瘤背石磺作為研究客體。

作者首次從瘤背石磺的背部表皮中克隆并鑒定出一個(gè)EGF-like基因, 并從結(jié)構(gòu)和進(jìn)化兩方面進(jìn)行深入分析, 發(fā)現(xiàn)EGF-like基因具有一定的物種特異性, 為進(jìn)一步研究1基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用的瘤背石磺采自上海市東海大橋沿岸的蘆葦蕩, 并放置于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)箱中暫養(yǎng), 定時(shí)向箱內(nèi)投放玉米粉、添加清水、清理排泄物, 及時(shí)清除掉死亡個(gè)體。實(shí)驗(yàn)前選取健康活力強(qiáng)、體長50 mm左右的個(gè)體, 并用清水洗凈其身體表面的附著物。

實(shí)驗(yàn)所用的RNA提取試劑盒、2*Taq PCR Mix、DH5-α感受態(tài)細(xì)胞購自天根(北京)生化科技有限公司; LA-Taq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser)、RACE試劑盒(含5′和3′)購自TAKARA公司; 瓊脂糖、LB培養(yǎng)基、DNA片段純化試劑盒、三氯甲烷、異丙醇等購自生工生物工程(上海)有限公司; pGEM-easy vector購自Promega公司; 核酸電泳緩沖液購自萊峰生物公司。實(shí)驗(yàn)中所用到的引物合成及序列測定工作均由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2 RNA提取與cDNA合成

取瘤背石磺的背部皮膚, 按照RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA, 使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性并使用超微量分光光度計(jì)(Nano Drop ND-2000/2000C, Thermo Fisher Scientific, USA)測其核酸濃度和260/280后置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆肹23]。利用RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA第一鏈; 利用TaKaRa 3′Full RACE Kit合成3RACE-cDNA, 用5′Full RACE Kit合成5RACE-cDNA,于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 EGF-like的基因克隆

根據(jù)瘤背石磺轉(zhuǎn)錄組序列中得到的EGF-like基因片段, 利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出引物F1、R1擴(kuò)增目的片段(表1)。利用引物已知的Tm值, 設(shè)計(jì)溫度梯度實(shí)驗(yàn), 確定最適退火溫度61.7℃。50 μL PCR反應(yīng)體系為2*Taq PCR Mix 25 μL, ddH2O 20 μL, 上下游引物(F/R)(10μmol/L)各1.5 μL, cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 61.7℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 循環(huán)35次; 72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳后使用DNA膠回收試劑盒純化目的片段, 并將目的片段連接到pGEM-easy vector載體上, 轉(zhuǎn)化進(jìn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞.DH5-α, 在LB/AMP固體平板上37℃培養(yǎng), 經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測后將陽性克隆送生工測序, 并將所得序列結(jié)果與已知序列進(jìn)行比對。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用到的引物序列

Tab.1 Sequences of primers used in this study

根據(jù)測序得到的目的片段, 分別設(shè)計(jì)5′和3′RACE特異性引物(表1), 以3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA為模板, 按照TAKARA RACE說明書中步驟分別進(jìn)行3′RACE和5′RACE反應(yīng), 所得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳、割膠回收、連接轉(zhuǎn)化后, 通過藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測后將陽性克隆送生工測序。使用DNAMAN6.0軟件將3次測序結(jié)果進(jìn)行拼接, 獲得基因的cDNA全長序列。

1.4 序列特征和結(jié)果分析

使用NCBI中ORF Finder(http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html)查找基因的開放閱讀框(ORF); 使用BioEdit和DNAstar軟件預(yù)測氨基酸序列; 使用ProtParam(Http: //web.expasy.org/protparam/)來預(yù)測所編碼蛋白的理化性質(zhì); 使用SignalP4.1(http: //www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)來預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽序列; 使用TMHMM services 2.0(http: //www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/)來預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域; 使用NetPhos2.0 Serber(http: //www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/)來預(yù)測蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn); 使用Subloc v1.0(http: //www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/)對蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位; 使用SMART(http: //smart. embl-heidelberg.de/)分析蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域; 使用Mega6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGF-like基因的基因克隆

通過對瘤背石磺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的綜合分析比對, 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的S_Unigene427_c2_seq6基因被描述為epidermal growth factor-like, 且與NCBI數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)其與multiple epidermal growth factor-like domains protein 10 ()相識度最為接近。

根據(jù)該核苷酸序列在其保守區(qū)設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物, 獲得802 bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用BioEdit進(jìn)行雙序列比對結(jié)果顯示, 該片段與待驗(yàn)證核苷酸序列中被擴(kuò)引物之間的序列99%的一致, 覆蓋度達(dá)到67.57%, 一方面證明該序列的正確性, 可以應(yīng)用于cDNA全長的克隆; 另一方面也發(fā)現(xiàn)原預(yù)測的核苷酸序列存在一定的缺失, 或是基因測序拼接的不完整性造成的[24]。

3′RACE擴(kuò)增得到一條569 bp的片段, 包含加尾信號(AACAAA)和poly(A)尾巴。5′RACE擴(kuò)增得到一條301bp的片段。將上述序列片段進(jìn)行拼接后, 得到一條全長為1158bp的cDNA序列(GenBank登錄號: KU556757), 通過blastx比對分析, 確定該基因?qū)儆贓GF大家族。其中開放閱讀框長846 bp, 編碼一條長為281個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈, 終止密碼子為TGA, 加尾信號位于1129~1134, 后面緊跟著poly(A)尾巴。5′UTR長度為166 bp, 3′UTR長度為130 bp(圖3)。

2.2 EGF-like基因的cDNA序列分析

通過RACE克隆技術(shù)獲得的瘤背石磺表皮生長因子(EGF-like)基因命名為1。ProtParam軟件預(yù)測其分子量為30.51 ku, 理論等電點(diǎn)(PI)是5.41。SignalP4.1信號肽預(yù)測1沒有信號肽序列, 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件TMHMM services 2.0顯示該基因存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(膜內(nèi)1~16aa, 膜上17~39aa, 膜外40~281aa)。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測軟件NetPhos2.0 Serber顯示1基因含有6個(gè)Ser、3個(gè)Thr、3個(gè)Tyr, 可能為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。細(xì)胞定位預(yù)測表明1基因定位在細(xì)胞外, 是分泌性蛋白的可能性較大。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件SMART顯示1基因含有2個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域(46~77aa、139~170aa)和一個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域(92~137aa), 每個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域均包含6個(gè)半胱氨酸殘基, 結(jié)構(gòu)域內(nèi)部各自形成3個(gè)二硫鍵, EGF-like結(jié)構(gòu)域包含8個(gè)半胱氨酸殘基。使用SWISSmodel軟件對1氨基酸序列進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測, 結(jié)果如圖1。

將1的氨基酸序列在NCBI中Blast同源性比對得知, 與其匹配度最高的是腹足綱生物中的multiple epidermal growth factor-like domains protein 10蛋白序列(XP_013086610.1),匹配度達(dá)到51%。相似度較低一點(diǎn)的是, 同樣是multiple epidermal growth factor-like domains protein 10的蛋白序列(XP_011433900.1), 同源性為43%。將兩者的氨基酸序列同1進(jìn)行多重序列比對后, 結(jié)果如圖2所示。

瘤背石磺1基因cDNA序列及其編碼的氨基酸序列如圖3所示。

使用BioEdit軟件將瘤背石磺1基因的3個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域同EGF家族及其相關(guān)蛋白的EGF-like結(jié)構(gòu)域做比較, 結(jié)果表明1與EGF家族及相關(guān)蛋白的6個(gè)半胱氨酸殘基是高度保守的, 且均符合CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C結(jié)構(gòu), 如圖4。

使用Mega6.0軟件, 對瘤背石磺1及EGF家族其他成員的氨基酸序列進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹圖5。結(jié)果表明, 大體上EGF家族每個(gè)成員的不同物種基因相應(yīng)的聚為群組。的TGF-α蛋白單獨(dú)聚為一支, 小家鼠()和人類()的相關(guān)蛋白聚為一支,1單獨(dú)聚為一支, 剩余4種的EGF相關(guān)蛋白形成兩分支又聚為一支。

圖中藍(lán)色字體為起始密碼子和終止密碼子, 黑色加粗字體為加尾信號; 陰影部分是保守的EGF-like結(jié)構(gòu)域, 紅色字體為6個(gè)典型的半胱氨酸殘基

Blue indicates the initiation codon and stop codon; bold black indicates polyadenylation signals; shadow indicates the conserved EGF-like domain; red indicates six typical cysteine residues

3 討論

表皮生長因子(EGF)家族的研究報(bào)道在脊椎動(dòng)物中比較豐富。本文利用瘤背石磺轉(zhuǎn)錄組, 首次在該物種中克隆得到EGF-like基因1, 通過功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)其包含1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(17~39aa)、2個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域(46~77aa、139~170aa)和一個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域(92~137aa), 將其與家族中其他成員及其相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)域比較, 發(fā)現(xiàn)1和他們有著相同的EGF-like結(jié)構(gòu)特征, 包含典型的6個(gè)半胱氨酸殘基, 且符合CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C結(jié)構(gòu), 其中完全保守的6個(gè)半胱氨酸殘基C1~C3、C2~C4和C5~C6之間形成的3個(gè)二硫鍵, 使得這些多肽鏈能夠形成相似的空間結(jié)構(gòu), 因而可以與EGF受體結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞間的信號傳遞。

字體C表示6個(gè)保守的半胱氨酸殘基

C indicates six conserved cysteine residues

EGF家族蛋白在高等哺乳類動(dòng)物中已能夠廣泛獲取, 同時(shí), 在海洋軟體動(dòng)物、兩棲類生物甚至病毒細(xì)菌中均發(fā)現(xiàn)有EGF-like結(jié)構(gòu)域, 可說明在物種的進(jìn)化過程中EGF-like結(jié)構(gòu)域是相對保守的。目前在貝類中研究報(bào)道的EGF家族及其相關(guān)蛋白基因有16種之多, 例如太平洋牡蠣()的EGF-like基因[25]、光滑雙臍螺()的EGF想關(guān)基因[26]、新西蘭青蠔()的EGF相關(guān)基因[27]、九孔鮑()的HdEGF1基因[28]、紫貽貝()的EGF相關(guān)基因[29]、菲律賓蛤仔()的EGF_CA相關(guān)基因[30]、合浦珠母貝的1基因。將1和上述基因的序列比對, 結(jié)果表明除了EGF-like結(jié)構(gòu)域之外(圖4), 其余氨基酸序列并沒有表現(xiàn)出相似性。而根據(jù)在NCBI上BLAST結(jié)果及多重序列比對顯示,1同其他物種的EGF-like基因同源性并不高, 最高僅為51%, 這也符合海洋生物之間基因差異較大的規(guī)律。以此推測1基因是EGF家族及其相關(guān)蛋白基因的新成員。

EGF家族蛋白在人類高等生物中的分布和表達(dá)十分豐富, 而且對其的研究也比較深入。S Kumar發(fā)現(xiàn), 長期吸煙的人群會誘導(dǎo)EGF家族的肝素結(jié)和性表皮生長因子HB-EGF在巨噬細(xì)胞中過量表達(dá), 使人患胰腺癌的幾率變大數(shù)倍[31]。Hoda I發(fā)現(xiàn)通過藥物降低EGF和EGFR基因的表達(dá)量可以顯著抑制艾氏腹水瘤生長[32]。另外, Ito J的研究發(fā)現(xiàn)呼吸道上皮損傷可以通過HBEGF和TGF-α來誘導(dǎo)TGF-β1和TGF-β2的表達(dá)量增加來達(dá)到修復(fù)效果, 這同EGF家族細(xì)胞成員細(xì)胞素(BTC)在人體中的腸道等表皮易損傷的部位表達(dá)量較高時(shí)想吻合的[33-34]。

本研究首次在瘤背石磺中克隆得到表皮生長因子類似(EGF-like)基因1的cDNA全長序列, 并對其從結(jié)構(gòu)和進(jìn)化兩方面進(jìn)行了生物學(xué)信息分析, 分析結(jié)果表明1可能是一個(gè)新的EGF-like基因。本研究為進(jìn)一步研究1的功能奠定基礎(chǔ)。

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(本文編輯: 梁德海)

Molecular cloning and characterization of EGF-like gene in

YANG Tie-zhu, SHEN He-ding, SHI Yan-mei, LIU Xin, WU Xin, LI Jie

(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The complete cDNA sequence of the EGF-like gene was cloned fromfor the first time. cDNA of the EGF-like gene was named1; it consisted of 1158 bp containing a 846-bp ORF that encoded a peptide of 281 amino acids. Multiple alignment and conserved domain analysis indicated that this peptide chain contained two conserved EGF domains and one EGF-like domain. Each domain contained at least six cysteine residues (CX7 CX4–5 CX10–13 CXCX8 C) that can form three disulfide bonds between C1 and C3, C2 and C4, and C5 and C6. These characteristics are consistent with the EGF protein family. However, the remaining sequences of1 were considerably different from other members of the EGF family. Thus, we proposed that1 is a novel EGF-like gene. A phylogenetic tree was built using MEGA6.0 to investigate the relationship between1 and proteins belonging to the EGF family. The study also suggested that proteins belonging to the EGF family are species-specific.

; EGF; gene cloning; phylogenetic analysis

Jun. 19, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No. 41276157; Shanghai Fisheries College discipline construction project]

S917.4

A

1000-3096(2017)03-0008-09

10.11759/hykx 20160121002

2016-06-19;

2016-11-18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41276157); 上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目

楊鐵柱(1990-), 男, 河南周口人, 碩士研究生, 主要從事海洋貝類功能基因研究, E-mail: yangtiezhu1234@163.com; 沈和定, 通信作者, 教授, 電話: 021-61900446, E-mail: hdshen@shou.edu.cn