翟逸，劉欽松，石黨委，吳永坤，張念強(qiáng)，祁慶生

（1.重組蛋白基因檢測(cè)技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，山東博奧克生物科技有限公司，山東聊城252000；2.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100）

擬南芥4-香豆酰-CoA連接酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析

翟逸1，劉欽松1，石黨委1，吳永坤1，張念強(qiáng)1，祁慶生2

（1.重組蛋白基因檢測(cè)技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，山東博奧克生物科技有限公司，山東聊城252000；2.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100）

以擬南芥總RNA為模板，利用RT-PCR的方法從擬南芥中擴(kuò)增獲得一條4-香豆酰-CoA連接酶基因完整的cDNA序列，命名為4CL1。利用生物信息學(xué)生物軟件對(duì)其核酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該序列長(zhǎng)1 686bp，與已報(bào)道的擬南芥4-香豆酰-CoA連接酶基因的序列相似性達(dá)到98%～100%，氨基酸序列相似性為99%～100%；4CL1基因編碼561個(gè)氨基酸，該氨基酸序列具有典型的4-香豆酰-CoA連接酶AMP-binding保守結(jié)構(gòu)域LPYSSGTTGLPK，同時(shí)含有該蛋白家族的催化活性中心GEICIRG序列；預(yù)測(cè)的分子量為61.05kDa，理論等電點(diǎn)為5.25，不穩(wěn)定參數(shù)為35.93，在分類上屬于穩(wěn)定性蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則蜷曲、α-螺旋、延伸鏈及β轉(zhuǎn)角為主，其含量分別為34.22%、30.30%、24.06%和11.41%。

擬南芥；4-香豆酰-CoA連接酶；基因克??；序列分析

白藜蘆醇（Resveratrol，Rs），一種具有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，主要存在于葡萄、花生、桑椹和虎杖等植物中[1]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抗衰老、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病，抗神經(jīng)性病變及可提高機(jī)體免疫力等多種生物活性，在食品、保健品、化妝品及生物制藥等行業(yè)中具有很大的應(yīng)用潛力和廣闊的發(fā)展前景[2-5]。在植物體中，白藜蘆醇通過(guò)苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H），4-香豆酸-CoA連接酶（4CL）和白藜蘆醇合酶（RS）4種酶來(lái)合成，其中4CL是合成途徑中的關(guān)鍵酶，其催化一分子的4-香豆酸和一分子的丙二酰-CoA生成一分子的4-香豆酰CoA，作為下一步合成白藜蘆醇的底物[6，7]。

近年來(lái)，隨著合成生物學(xué)與代謝工程的迅速發(fā)展，利用微生物合成具有重要應(yīng)用價(jià)值的植物源代謝產(chǎn)物越來(lái)越受到研究者的重視[8]。已有研究表明，在微生物中以4-香豆酸為底物，僅表達(dá)4-香豆酰CoA連接酶和白藜蘆醇合酶就能夠合成白藜蘆醇[9-12]。本研究以擬南芥總RNA為模板，利用RT-PCR擴(kuò)增獲得4-香豆酰CoA連接酶的基因，并對(duì)其進(jìn)行了序列比對(duì)及生物信息學(xué)等相關(guān)分析，為下一步利用基因工程技術(shù)進(jìn)行白藜蘆醇的生物合成提供了基因資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥種子（Arabidopsis thaliana）由聊城大學(xué)曹雪松教授饋贈(zèng)；DP432植物總RNA提取試劑盒、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞、分子量標(biāo)準(zhǔn)D15000+2 000 DNA Marker為天跟生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；PrimeScript? ⅠⅠ 1st Strand cDNA Synthesis Kit；TaKaRa LA Taq?；Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0；Takara pMD?18-T Vector Cloning Kit；TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0；T4 DNA Ligase為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；蛋白胨，酵母膏，NaCl等試劑均為分析純，購(gòu)于青島浩賽科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TECHNE PC儀（TC-512）購(gòu)于英國(guó)Bibby Scientific Ltd；水平電泳儀（DYCP）購(gòu)于北京六一儀器廠；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon 1600R）購(gòu)于上海天能科技有限公司；多功能臺(tái)式高速離心機(jī)（5430R）購(gòu)于上海艾本德生物技術(shù)國(guó)際貿(mào)易有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50A）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（BGZ-240）等購(gòu)于上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；智能恒溫循環(huán)器（DTY-5A）購(gòu)于北京德天佑科技發(fā)展有限公司；電子天平（JE203）購(gòu)于上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；pH計(jì)（PHS-3C）購(gòu)于上海虹益儀器儀表有限公司；超凈工作臺(tái)（DTY-900）購(gòu)于蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法和步驟

1.3.1 擬南芥總RNA的提取

將擬南芥幼苗從無(wú)菌玻璃培養(yǎng)瓶中取出，用剪刀去掉根部后放入預(yù)先以DEPC水浸泡并高溫處理過(guò)的研缽中，加入適量液氮迅速研磨至粉末狀，取適量轉(zhuǎn)至無(wú)核酶的1.5mL EP管中，根據(jù)植物總RNA提取試劑盒操作使用說(shuō)明書提取擬南芥總RNA，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 4-香豆酰-CoA連接酶基因RT-PCR擴(kuò)增

以1.3.1中提取的擬南芥總RNA為模板，按照PrimeScript? ⅠⅠ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以合成的第一鏈cDNA為模板，4CL1-F：5'-ATGGCGCCACAAGAACAAG-3'、4CL1-R：5'-TCACAATCCATTTGCTAGT-3'為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為50.0μL，包括5.0μL緩沖Buffer，8.0μL的dNTPs，各5.0μL的4CL1-F、4CL1-R，5.0μL的cDNA模板，21.5μL滅菌ddH2O和0.5μL的LA Taq酶；PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，56℃退火40s，72℃延伸120s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；反應(yīng)完畢，取適量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.3.3 PCR擴(kuò)增片段的TA克隆與測(cè)序

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，以瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的片段并與pMD?18-T克隆載體進(jìn)行連接，其反應(yīng)體系為：pMD?18-T Vector 1.0 μL，純化目的片段4.0μL，Solution Ⅰ連接反應(yīng)液5μL。將上述反應(yīng)體系緩慢混合均勻，在4℃條件下過(guò)夜連接。將10μL的連接產(chǎn)物加入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)熱擊轉(zhuǎn)化后涂布氨芐抗性平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑取白色單克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)、質(zhì)粒提取，經(jīng)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證重組質(zhì)粒中插入片段大小正確后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 擬南芥4CL1基因序列生物信息學(xué)分析

在NCBⅠ中利用BLAST與保守結(jié)構(gòu)域查詢（Conserved Domain Search，CD Search）在線程序等對(duì)4CL1基因進(jìn)行序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域查詢；DNAMAN 5.22與Clustal X等生物學(xué)軟件進(jìn)行多序列比等分析；4CL1蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)等預(yù)測(cè)通過(guò)ExPASY ProtParam Server在線服務(wù)器進(jìn)行，三級(jí)結(jié)預(yù)測(cè)采用自動(dòng)建模的方式在SWⅠSSMODEL服務(wù)器上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥總RNA的提取檢測(cè)

提取的擬南芥總RNA電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，從上往下依次為28S、18S和5S的RNA。從圖1可以看出，28S、18S條帶完整、清晰，5S條帶則非常暗淡。這表明提取的擬南芥總RNA無(wú)降解，質(zhì)量較高，可滿足下一步目的基因擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 擬南芥總RNA電泳檢測(cè)

2.2 擬南芥4-香豆酰-CoA連接酶基因4CL1的克隆

將提取的擬南芥總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，然后以cDNA為模板，4CL1-F和4CL1-R為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得一條約1 700bp的特異性電泳條帶，如圖2所示，其大小與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物（1 686bp）相符。

圖2 4-香豆酰-CoA連接酶基因4CL1的PCR擴(kuò)增

2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與篩選

在凝膠成像系統(tǒng)下將2.2中的特異性擴(kuò)增電泳條帶切下，純化回收后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α并涂布在含有ⅠPTG、X-gal和氨芐青霉素抗性的篩選平板上。培養(yǎng)后從平板上挑取白色單克隆轉(zhuǎn)接于含氨芐青霉素抗性的液體LB中過(guò)夜培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒為模板，4CL1-F和4CL1-R為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得一條與圖2中特異性條帶大小一致的電泳條帶，如圖3所示。這表明，目的片段已成功插入到克隆載體中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證

2.4 4CL1基因的序列分析

陽(yáng)性重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果表明，插入片段包含一個(gè)完整的開放閱讀框，片段的大小為1 686bp，將其命名為4CL1。在NCBⅠ中BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）的序列比對(duì)結(jié)果表明，該序列與NCBⅠ中已報(bào)道的擬南芥4-香豆酰-CoA連接酶基因的序列相似性達(dá)到98%～100%，其中與NM_104046.3、AY376729.1、AY099747.1、U18675.1序列完全相同；翻譯的氨基酸序列相似性為99%～100%。這表明所克隆片段為擬南芥4-香豆酰-CoA連接酶基因，其核酸與翻譯的氨基酸序列如圖4所示。

圖4 4CL1基因的核酸序列和翻譯的氨基酸序列

2.5 4CL1基因的生物信息學(xué)分析

2.5.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

擬南芥4-香豆酰CoA連接酶4CL1基因編碼的4CL1蛋白由561個(gè)氨基酸殘基組成，預(yù)測(cè)的分子量為61.05kDa，理論等電點(diǎn)為5.25。該蛋白計(jì)算的不穩(wěn)定參數(shù)為35.93，屬于穩(wěn)定性蛋白，這有利于后續(xù)的蛋白表達(dá)、純化等研究工作。

2.5.2 4CL1基因結(jié)構(gòu)域分析

4-香豆酰-CoA連接酶屬于AMP結(jié)合超家族蛋白，通過(guò)NCBⅠ在線軟件對(duì)4CL1基因氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖4所示。如圖4所示，該氨基酸序列具有典型的4-香豆酰-CoA連接酶的AMP-binding保守結(jié)構(gòu)域LPYSSGTTGLPK，同時(shí)含有該蛋白家族的催化活性中心GEⅠCⅠRG序列[13，14]。這進(jìn)一步說(shuō)明所克隆基因?yàn)?-香豆酰-CoA連接酶基因。

2.5.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

ExPASY ProtParam Server在線服務(wù)器對(duì)4CL1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，該4CL1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則蜷曲、α-螺旋、延伸鏈及β轉(zhuǎn)角為主，其中無(wú)規(guī)則蜷曲含量為34.22%，α-螺旋含量為30.30%，延伸鏈含量為24.06%，β轉(zhuǎn)角含量為11.41%。

圖5 4CL1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5.4 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

將4CL1蛋白序列在SWⅠSS-MODEL服務(wù)器中經(jīng)BLAST比對(duì)搜索，獲得了一條序列相似性為73.33%的模板5bsr.1.A，如圖6所示。采用自動(dòng)建模方式，以5bsr.1.A為模板預(yù)測(cè)4CL1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖7所示。從圖6、7中可以看出，在該結(jié)構(gòu)中含有較多的無(wú)規(guī)則蜷曲和α-螺旋和，這也與圖5中4CL1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符合。

圖6 模板5bsr.1.A三級(jí)結(jié)構(gòu)

圖7 預(yù)測(cè)的4CL1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

在前期的工作中，已成功獲得了白藜蘆醇合酶的基因。本研究通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增從擬南芥總RNA中獲得一條長(zhǎng)度為1 686bp的基因片段，命名為4CL1，其在GenBank中的登錄號(hào)為KX817185。該基因片段的核酸和翻譯的氨基酸序列與NCBⅠ中已報(bào)道的擬南芥來(lái)源的4-香豆酰CoA連接酶相似性分別達(dá)到98%～100%和99%～100%，并且具有典型的4CL蛋白中保守的特征序列SSGTTGLPKGV和GEⅠCⅠRG，這些結(jié)果表明本文分離的4CL1基因?yàn)閿M南芥的4-香豆酰CoA連接酶基因。這為下一步利用基因工程的方 法進(jìn)行生物合成白藜蘆醇奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequence Analysis of a 4-coumaryl: CoA ligase Gene from Arabidopsis thaliana

Zhai Yi1,Liu Qin-song1,Shi Dang-wei1,Wu Yong-kun1,Zhang Nian-qiang1,Qi Qing-sheng2
(1.State and Local Joint Engineering Laboratory of Recombinant Protein and Gene Detection Technology,Shandong Boaoke Biotechnology Co.,Ltd.,Shandong Liaocheng 252000;2.State Key Laboratory of Microbial Technology,College of Life Science,Shandong University,Shandong Jinan 250100)

A complete cDNA sequence of 4-coumaryl:CoA ligase1 gene was obtained from Arabidopsis thaliana total RNA by RT-PCR method,named 4CL1.The results of multiple sequence alignment showed that 4CL1 was of 1 686 bp with 98%～100% nucleic acid sequence similarity and 99%～100% amino acid sequence similarity to the reported Arabidopsis thaliana 4-coumaryl: CoA ligase1.Domain analysis results revealed that the AMP-binding characteristics sequences of LPYSSGTTGLPKGVLFGPGLT and the active site sequences GEICIRG of 4-coumaryl:CoA ligase protein family were found in cloned 4CL1 amino acids sequence.The predicted molecular weight was 61.05 kDa and the theoretical isoelectric point was 5.25.The calculated instability parameter was 35.93,which indicated that this protein was stable in classification.The secondary structure of resveratrol synthase mainly contained random curling,α-helix,extended strand and β-turn,which content was 34.22%,30.30% ,24.06% and 17.66%,respectively.

Arabidopsis thaliana;4-coumaryl: CoA ligase;Gene clone;Sequence analysis

Q943.2

A

2096-0387（2017）03-0001-05

翟逸（1980-），男，博士，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程。