王耀，徐軍

（1.晉中職業(yè)技術學院，山西晉中030600；2.山西大學，山西太原030006）

三四齡中華稻蝗消化道菌群分離及主要特性研究

王耀，徐軍

（1.晉中職業(yè)技術學院，山西晉中030600；2.山西大學，山西太原030006）

本文采用平板稀釋分離、斜面純化培養(yǎng)等方法，對三四齡的中華稻蝗消化道內(nèi)菌群進行分離，并應用多種培養(yǎng)基對分離出的菌群做初步生理生化代謝試驗。結果表明：其消化道內(nèi)菌群以革蘭氏陰性桿菌為多。這些菌種在體外氮源利用率很低，對無機碳源的利用率較有機碳源高；可產(chǎn)生纖維素酶的菌種較少；絕大多數(shù)菌種可發(fā)酵多種糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣；明顯有酵母菌存在，且其活力很強。

中華稻蝗；消化道微生物；同化碳（氮）源試驗；糖發(fā)酵試驗

中華稻蝗Oxya chinensist (Thunberg)，屬直翅目、斑腿蝗科、稻蝗屬[1]，是稻區(qū)土蝗中的優(yōu)勢種之一，國內(nèi)分布幾乎遍及所有稻區(qū)，國外分布于朝鮮、日本、馬來西亞、菲律賓和斯里蘭卡等國。該蟲取食禾本科農(nóng)作物、稗草、蘆葦?shù)入s草以及莎草科植物，尤喜食水稻葉片。中華稻蝗若蟲孵化后，3齡前多在雜草上取食，以后遷移到田內(nèi)危害水稻。

中華稻蝗的消化系統(tǒng)分為前腸、中腸和后腸[2]。前腸功能主要是取食、食物的機械研磨、貯存和初步消化。中腸分泌消化酶，對食物進行消化和吸收，常形成盲囊、腺體等進一步加強消化吸收。后腸可以對一些離子及水分重新吸收。消化系統(tǒng)是蝗蟲賴以生存的最重要器官之一，消化道中的微生物數(shù)量和種類多十分龐雜，并構成了一個具有一定功能的微生態(tài)系統(tǒng)，該系統(tǒng)中微生物與微生物間、微生物與宿主間都存在著十分密切又復雜的關系，其對宿主的健康有著重要影響。對其的研究有利于觀察昆蟲共生微生物與宿主的相互作用。許多重要的農(nóng)業(yè)或衛(wèi)生昆蟲是依靠共生微生物生長和繁殖的，利用某些微生物可達到以菌治蟲的目的。

對中華稻蝗消化道的研究集中在顯微解剖結構方面，如Wagan等[3]對蝗總科的前腸進行過研究；張小民等[4]對中華稻蝗全消化道內(nèi)壁顯微結構進行了觀察研究。因消化道正常菌群絕大多數(shù)都是厭氧或兼性厭氧菌，很難用普通培養(yǎng)基直接培養(yǎng)出來，大多數(shù)菌種僅依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定是一項費時而繁瑣的工作，故現(xiàn)階段微生物菌群分離、鑒定的系統(tǒng)方法多在分子水平上，以微生物鑒定系統(tǒng)和PCR技術為主，對中華稻蝗消化道內(nèi)菌群的分離及對其生理生化特性的研究報道甚少。本次試驗完全采用微生物實驗方法，對中華稻蝗消化道微生物進行初步的定性研究。

1 材料與方法

1.1 蟲種

3齡和4齡的中華稻蝗，。

1.2 主要儀器

超凈臺、高壓蒸氣滅菌鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱和光學顯微鏡OLYMPUS BX41。剪刀、鑷子、絲線、接種環(huán)、解剖針、涂布玻璃棒、pH試紙、培養(yǎng)基分裝器、分析天平、藥匙、量筒、試管、錐形瓶、燒杯、酒精燈、載玻片和蓋玻片等。

1.3 主要試劑

孔雀綠、結晶紫、番紅復染液、碘液、NaOH、5%乙醇、75%乙醇和5%硫代硫酸鈉。消毒藥水，泡騰片半片（有效氯含量=500mg/片，茂康牌）加100mL自來水，完全溶解后備用。無菌水，在121℃下滅菌20min備用。

1.4 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂（牛肉膏蛋白胨）培養(yǎng)基，馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA），酵母菌子囊孢子形態(tài)觀察用培養(yǎng)基——麥氏瓊脂培養(yǎng)基[5]；同化碳源試驗——無碳培養(yǎng)基，同化氮源試驗——無氮培養(yǎng)基，糖、醇發(fā)酵培養(yǎng)基，纖維素水解試驗——試管測試法[6]，酵母菌糖發(fā)酵培養(yǎng)基，酵母菌同化碳源培養(yǎng)基，馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，葡萄糖-酵母膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基[7]。

1.5 蟲體表面消毒方法

將中華稻蝗的口和肛門用絲線扎住，在無菌操作的條件下，浸入75%乙醇約1min，用鑷子取出后轉(zhuǎn)至無菌水中洗滌一遍，再浸入消毒藥水中3～5min，轉(zhuǎn)入5%硫代硫酸鈉溶液中浸泡3～5min，取出后轉(zhuǎn)至無菌水中，洗滌5遍。

1.6 制備消化道稀釋液方法

表面消毒后的中華稻蝗，肛門部分用無菌剪刀剪去，將其消化道液擠入盛有9mL無菌冷卻水并帶有數(shù)粒玻璃珠的已滅菌的三角燒瓶中（稀釋倍數(shù)10），振蕩平搖約10min。無菌操作移取1mL菌懸液加入盛有9mL無菌水的試管中（稀釋倍數(shù)102），吹吸3次，充分混勻；另取一無菌移液管從此試管中吸取1mL加入另一盛有9mL無菌水的試管中（稀釋倍數(shù)103），吹吸3次，充分混勻；以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4不同稀釋度的消化道菌懸液。

1.7 平板涂布方法

將上述的營養(yǎng)培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基的平板底面分別用記號筆寫上稀釋度，然后無菌操作分別由對應的土壤稀釋液中各吸取0.2mL菌懸液滴在對應位置，做平板涂布。室溫下靜置5～10min，使菌液吸附進培養(yǎng)基。

營養(yǎng)培養(yǎng)基平板，稀釋度為10-2、10-3、10-4的平板各3個，用于分離細菌；馬鈴薯培養(yǎng)基平板，稀釋度為10-2、10-3、10-4的平板各3個，用于分離真菌。涂布好的平板全部放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩三天。

1.8 菌落計數(shù)及菌種純化

培養(yǎng)結束后，統(tǒng)計不同的培養(yǎng)基平板上相關類群的微生物菌落。

從不同的培養(yǎng)基平板上，選取菌種編號標記，記錄其菌落形態(tài)，分別轉(zhuǎn)接到相應的培養(yǎng)基斜面中，置于28℃培養(yǎng)箱進行純化培養(yǎng)，備用。

1.9 細菌的革蘭氏染色和形態(tài)觀察

對選出的細菌分別做革蘭氏染色，觀察記錄其染色結果和個體形態(tài)。

1.10 細菌的主要生理代謝試驗

將純化培養(yǎng)結束后的菌種各加入4～5mL無菌水做成菌懸液，用其分別做同化碳源、氮源試驗、糖（醇）發(fā)酵試驗、纖維素水解試驗，記錄試驗結果。

1.11 同化碳（氮）源試驗

倒無碳培養(yǎng)基平板并做好標記，待其冷卻后，在背面輻射狀平均分成六格，標號。拿一支滅過菌的1mL移液管，將某一菌種的菌懸液取0.2mL滴在平板上，均勻涂布后，再用接種環(huán)將各種碳源取約小米粒大小的量放在編號相對應的位置，依次放好幾種碳源之后，將平板倒置，放入28℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3～7d后取出觀察，記錄結果。同化氮源方法相同。

本次試驗所用碳源依次為葡萄糖、蔗糖、α乳糖、D+木糖（五碳糖）、甘露醇和可溶性淀粉。氮源依次為硫酸銨、硝酸銨、尿素、蛋白胨。

1.12 糖（醇）發(fā)酵試驗

無菌操作下，用接種環(huán)挑取少許純化的菌種放入糖（醇）發(fā)酵試驗用液體培養(yǎng)基中，放入28℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2～4d后取出觀察，記錄結果。此次試驗所用糖類分別為葡萄糖、蔗糖、α乳糖、D半乳糖、D果糖、D+棉子糖和D+木糖。

1.13 纖維素水解試驗

無菌操作下，用接種環(huán)挑取少許純化的菌種放入纖維素水解試驗用液體培養(yǎng)基中，放入28℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4周后取出觀察，記錄結果。

1.14 酵母菌主要特性試驗

酵母菌糖發(fā)酵試驗、酵母菌同化碳源試驗方法如糖（醇）發(fā)酵試驗。試驗所用糖類分別為葡萄糖、蔗糖、α乳糖、D半乳糖、可溶性淀粉和甘露醇。

酵母菌子囊孢子形態(tài)觀察試驗是將酵母菌轉(zhuǎn)借到麥氏培養(yǎng)基后，培養(yǎng)3～5d，用接種環(huán)挑取稍許做常規(guī)涂片，酵母菌子囊孢子專用染色后鏡檢，拍照紀錄。

酵母菌假菌絲觀察試驗用培養(yǎng)基倒平板，用接種環(huán)挑取菌種在其上平行的劃幾條線，并在線上覆蓋一滅過菌的蓋玻片。28℃培養(yǎng)2～4d后取出鏡檢，拍照。

酵母菌細胞形態(tài)觀察試驗方法如糖（醇）發(fā)酵試驗。28℃培養(yǎng)2～4d后取出觀察，記錄結果。挑取少許菌懸液做常規(guī)涂片，1%美蘭染色后鏡檢，拍照。

2 結果分析

2.1 平板稀釋分離菌落計數(shù)結果

3齡蟲平板稀釋分離菌落計數(shù)結果見表1，4齡蟲平板稀釋分離菌落計數(shù)結果見表2。

表1 3齡蟲平板稀釋分離菌落計數(shù)結果

表2 4齡蟲平板稀釋分離菌落計數(shù)結果

由表1、2可知，隨著菌液濃度從高到低，菌落數(shù)量由多到少變化。總體而言，馬鈴薯平板上的菌落數(shù)量少于營養(yǎng)平板上的。

2.2 分離純化菌株的革蘭氏染色顯微觀察結果

分離純化菌株的革蘭氏染色顯微觀察結果見表3。由表3可以看出，分離出的細菌種類較少，菌種基本以革蘭氏陰性的桿菌為多，球菌為少，也有芽孢的菌種；偶見有酵母菌，其活力較強。

2.3 同化碳源、氮源利用結果

同化碳源、氮源利用結果見表4。由表4可知，分離出的細菌菌種在體外對氮源，無論無機還是有機氮源的利用率都很低。對無機碳源的利用率較有機碳源為高，尤其表現(xiàn)在對α-乳糖的利用上。值得注意的是，木糖是一種五碳糖。

2.4 糖發(fā)酵試驗結果

糖發(fā)酵試驗結果見表5。由表5可知，絕大多數(shù)分離得到的細菌菌種可發(fā)酵多種糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。其中，D+木糖是一種五碳糖，D+棉子糖是一種三糖，對其的發(fā)酵能力顯然較弱，只有少數(shù)菌種可發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)都不能分解這種糖。對α-乳糖的發(fā)酵能力偏弱，但此與碳源利用試驗所得結果不太一致，初步推測是較長時間后菌種活力降低所致。

表3 分離純化菌株的革蘭氏染色及顯微觀察結果

2.5 纖維素試驗結果

除ZHY三-6、ZHY三-11、ZHT三-10（酵母菌）可看到在濾紙上生長外，其余各菌種所在濾紙皆無明顯變化。

2.6 酵母菌試驗結果

酵母菌發(fā)酵試驗結果見表6，酵母菌碳源同化試驗結果見表7和圖1～4。酵母菌斜面培養(yǎng)結果見圖1，酵母菌ZHT三-10平板劃線結果見圖2，酵母菌ZHT三-10細胞形態(tài)觀察結果見圖3，酵母菌ZHT三-10子囊孢子觀察結果見圖4。

表6 酵母菌糖發(fā)酵試驗

由表6可知，此酵母菌顯然能利用大多數(shù)的糖類，但沒發(fā)現(xiàn)能被其發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣的糖類。圖1、2為酵母菌形態(tài)照片，可清楚地看到其菌落形態(tài)。

表4 同化碳、氮源試驗結果

表5 糖發(fā)酵試驗結果

圖1 酵母菌斜面培養(yǎng)結果（菌種呈粉紅色）

圖2 酵母菌ZHT三-10平板劃線結果

從圖3可以清楚地看到酵母菌的個體形態(tài)及其出芽生殖；圖4只能看到酵母菌菌體，看不到綠色的子囊孢子，據(jù)此初步推測次酵母菌不產(chǎn)子囊孢子。

圖4 酵母菌ZHT三-10子囊孢子觀察

酵母菌的假菌絲觀察時沒有發(fā)現(xiàn)假菌絲，故認為此菌種不是假菌絲屬。

3 結論

本試驗對中華稻蝗消化道內(nèi)菌群做了初步性研究，對中華稻蝗三齡、四齡蟲消化道的菌群做出了較完整的分離，并對其主要生理生化反應進行了多種類的研究，得到了較明顯的實驗結果，但相較于3齡的蟲體，4齡蟲顯然缺乏多樣性，推測可能由于4齡蟲消化道內(nèi)的菌群對環(huán)境的適應性提高，優(yōu)勢種群生長旺盛所致。

本試驗提出了分離消化道菌群的切實可行的操作過程，建立了其內(nèi)部菌群主要特性研究的較簡便、直觀的試驗方法，可為往后的同類試驗提供一些基礎性參照。

[1]吳?；?楊美玲,郭亞平,等.中華稻蝗若蟲不同齡期酯酶的特性[J].昆蟲知識,2006,43(3):336.

[2]許崇任,程紅.動物生物學[M].北京:高等教育出版社,2003.

[3]MS Wagan.Anatomy and histology of the alimentary canal of Chrotogonus trachypterus (Blanchard)[J].Pakistan Journal of Zoology,1986,18(4):411-416.

[4]張小民,郭亞平,許晶,等.中華稻蝗全消化道內(nèi)壁顯微結構觀察[J].昆蟲學報,2006,49(2):219-229.

[5]沈萍,范秀容,李光武.微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社,2004.

[6]趙斌,何紹江.微生物學實驗[M].北京:科學出版社,2002.

[7]中國科學院微生物研究所《常見與常用真菌》編寫組.常見與常用真菌[M].北京:科學出版社,1978.

Study on Isolation and Main Characteristics of Digestive Tract Bacteria of Three or Four Year Old Oxya chinensist

Wang Yao,Xu Jun
(1.Jinzhong Vocational &Technical College,Shanxi Jinzhong 030600;2.Shanxi University,Shanxi Taiyuan 030006)

In this paper,by using the method of plate dilution separation,slant surface purification and culture,digestive tract bacteria of three or four age old Oxya chinensist were isolated,and the physiological and biochemical metabolic tests were carried out by using various media.The results showed that the bacteria in the digestive tract were gram negative bacilli.These strains in vitro nitrogen utilization rate was low,utilization of inorganic carbon source was the organic carbon source;Less bacteria could produce cellulase;The vast majority of bacteria could ferment a variety of sugar and acid production gas;Yeast obviously exist,and its vitality was very strong.

Oxya chinensist;Digestive tract microorganism;Assimilation carbon (nitrogen) source test;Sugar fermentation test

Q966

A

2096-0387（2017）03-0056-06

王耀（1984-），女，山西晉中人，碩士，助教，研究方向：生物學。