盧傳禮 董麗華.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園園林園藝部，云南 勐臘 666303；.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)研究生部，北京 00049

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傣藥九翅豆蔻不同溶劑提取物的化學(xué)成分分析及其抗氧化、抗炎和降血糖活性研究

盧傳禮1董麗華2
1.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園園林園藝部，云南 勐臘 666303；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)研究生部，北京 100049

目的：研究九翅豆蔻根莖不同溶劑提取物的化學(xué)成分。方法：采用索氏提取法制備了其石油醚(PE)、三氯甲烷(CH)、甲醇(ME)和水(AQ)等四種不同極性溶劑提取物，利用顯色法分析了各提取物中總黃酮、總多酚和總萜類(lèi)的含量。并通過(guò)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺基)二銨鹽(ABTS)自由基清除法，α-葡萄糖苷酶活性抑制法和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞模型評(píng)價(jià)了各提取物的體外抗氧化、降血糖和抗炎活性。結(jié)果：四種提取物均對(duì)DPPH和ABTS顯示出不同程度的清除活力，其中ME清除自由基的能力最強(qiáng)；PE和ME能夠顯著抑制α-葡萄糖苷酶的活性(IC50 值分別為12.87和16.70μg/mL)，且作用強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖相當(dāng)(P>0.05)；PE和CH在12.5～25μg/mL以及ME在100μg/mL濃度水平，均能明顯地降低脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞釋放一氧化氮的水平，且對(duì)細(xì)胞的正常增殖無(wú)明顯影響；而AQ在本研究所測(cè)試模型中均不表現(xiàn)出明顯的活性。此外，CH中總黃酮的含量最高，PE中萜類(lèi)成分的含量最高，ME中多酚的含量最高，AQ中三類(lèi)成分的含量都是最低的。結(jié)論：九翅豆蔻的藥效物質(zhì)應(yīng)該屬于脂溶性成分而不是水溶性成分，對(duì)其臨床療效的有效成分和作用機(jī)制等方面科學(xué)內(nèi)涵還有待進(jìn)一步的研究。

九翅豆蔻；抗炎；清除自由基；α-葡萄糖苷酶；成分分析

九翅豆蔻(AmomummaximumRoxb.)屬于姜科豆蔻屬，廣泛分布于我國(guó)云南南部和東南亞熱帶地區(qū)[1]。在傣醫(yī)藥中，九翅豆蔻的果實(shí)或根莖入藥(傣語(yǔ)稱(chēng)作賀姑、郭姑等)，入土、風(fēng)塔，主治“短趕短接”(腹部脹痛)，“沙呃、短昏(呃逆、消化不良)”，“攏梅蘭申(肢體關(guān)節(jié)酸痛、屈伸不利)”[2]。在印度、越南等東南亞熱帶地區(qū)和國(guó)家，九翅豆蔻的花、果實(shí)和嫩桿被用作蔬菜食用，果實(shí)和根莖也被民間作為傳統(tǒng)藥物用來(lái)治療胃腸道疾患[3-5]。

然而目前對(duì)九翅豆蔻的生理活性、有效成分、作用機(jī)制及植物資源狀況等尚缺乏深入的研究與調(diào)查。有研究報(bào)道表明，九翅豆蔻根莖中含有半日花烷型二萜類(lèi)成分[3,6]，莖葉中揮發(fā)油的主要成分為和α-和β-pinene[5,7]。九翅豆蔻粗提取物能夠降低絳蟲(chóng)(Raillietinaechinobothrida)的運(yùn)動(dòng)能力和存活率，降低蠕蟲(chóng)體表磷酸酶、和腺苷三磷酸酶等關(guān)鍵酶的活性，具有潛在的驅(qū)蟲(chóng)藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值[4]。另外，從九翅豆蔻根莖中得到的二萜類(lèi)成分，Amomax C能夠明顯抑制MG-63細(xì)胞的增殖(IC50=3.3±0.8μg/mL)，而Amomaxin B 能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮的水平(IC50=31.33 μM)[3,6]。

本研究對(duì)九翅豆蔻根莖不同極性溶劑提取物進(jìn)行了體外的抗氧化、抗炎和降血糖活性評(píng)價(jià)，并對(duì)各提取物中的總黃酮、多酚和萜類(lèi)成分含量進(jìn)行了分析，以期評(píng)價(jià)其臨床運(yùn)用的科學(xué)性，為進(jìn)一步的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料

脂多糖(LPS)、α-葡萄糖苷酶(來(lái)源于Bacillus stearothermophilus)、地塞米松、1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)、2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS)、(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT)和4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNPG)等均購(gòu)買(mǎi)自Sigma公司。 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)、磷酸鹽緩沖液 (PBS)、Gluta-Max (100x)和青-鏈霉素雙抗 (100×) 購(gòu)買(mǎi)自Thermo Scientific公司。胰酶購(gòu)買(mǎi)自Millipore (MA, USA)，Griess 試劑盒 (G2930)購(gòu)買(mǎi)自Promega (Madison, WI, USA)。維生素C和蘆丁購(gòu)買(mǎi)自成都曼斯特生物科技有限公司。

九翅豆蔻根莖采集自云南省勐臘縣勐侖鎮(zhèn)植物園野生姜園，樣品經(jīng)黃建平(中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園)鑒定。

2 方法

2.1 九翅豆蔻不同溶劑提取物的制備 取九翅豆蔻根莖洗凈切片，置陰涼處晾干，粉碎后過(guò)100目篩。取藥材粉末50 g，濾紙包裹好后放置于索氏提取器中，依次用石油醚、三氯甲烷和甲醇提取，減壓回收溶劑后分別得到石油醚提取物(PE, 0.91g)、三氯甲烷提取物(CH, 0.82g)和甲醇提取物(ME, 1.55g)。藥渣取出后在通風(fēng)處，充分揮去有機(jī)溶劑后，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入500mL去離子水，加熱回流提取1.5h。趁熱過(guò)濾，濾液經(jīng)冷凍干燥得到水提取物(AQ, 0.31g)。

2.2 總黃酮、總多酚、總萜類(lèi)成分的含量測(cè)定 樣品中總黃酮的含量測(cè)定參考文獻(xiàn)報(bào)道方法[8]，并作適當(dāng)調(diào)整。即100μL樣品溶液與10μL 5%的NaNO3溶液混合后室溫下放置6min后，加入10μL10%的Al(NO3)3溶液，充分混合后室溫下放置6min。最后加入80μL4%的NaOH溶液并在室溫下放置15min。使用酶標(biāo)儀(VarioSkan Flash, Thermo Scientifi)讀取反應(yīng)體系在510nm處的吸光度值(OD)，每個(gè)樣品設(shè)置三次平行試驗(yàn)。用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品按照上述步驟建立反應(yīng)體系吸光度值與蘆丁濃度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并由此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出個(gè)樣品中總黃酮的相對(duì)含量(單位為mg蘆丁當(dāng)量/g藥材))。

樣品中總多酚含量測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法[9]，并作適當(dāng)調(diào)整。即100μL 樣品溶液與 40μL Folin-Ciocalteu 試劑 (0.2M)混合后室溫下放置5min，然后加入60μL Na2CO3溶液(15%)，并在30℃水浴上反應(yīng)60min。用酶標(biāo)儀記錄各反應(yīng)體系在755nm處的吸光度值。使用沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品按照上述步驟建立反應(yīng)體系吸光度值與沒(méi)食子酸濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并由此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣品中總多酚的相對(duì)含量(單位為mg沒(méi)食子酸當(dāng)量/g藥材)。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組平行。

總萜類(lèi)成分含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[10]，并作適當(dāng)調(diào)整。即1.0mL樣品溶液，1.0mL冰醋酸 (含5%香蘭素)和1.0mL硫酸依次加入5 mL容量瓶中，充分混合后置于65℃水浴中反應(yīng)20min。反應(yīng)結(jié)束后用流水冷卻至室溫，并用冰醋酸補(bǔ)足至5mL。使用分光光度計(jì)測(cè)反應(yīng)體系在545nm處的吸光度值。用千金子二萜醇(lathyrol)按照上述方法建立反應(yīng)體系吸光度值與千金子二萜醇濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并由此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算個(gè)樣品中總萜類(lèi)成分的含量(單位為mg千金子二萜醇當(dāng)量/g藥材)。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組平行。

2.3 自由基清除試驗(yàn) 樣品的抗氧化活性通過(guò)其清除DPPH和ABTS自由基的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。DPPH自由基清除能力測(cè)試參照文獻(xiàn)描述的方法進(jìn)行[11]。即100μL不同濃度的樣品溶液與等體積的DPPH溶液(0.10mg/mL溶解于甲醇)混合后室溫下暗處放置30min。用酶標(biāo)儀記錄反應(yīng)體系在517nm處的吸光度值。等體積的甲醇代替樣品溶液作為空白組，維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組平行。DPPH 自由基的清除率按照下式計(jì)算。

(1)

As為樣品組吸光度值，Ac為空白組吸光度值。

ABTS自由基清除能力測(cè)試按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[12]。7.4mM 的ABTS溶液與2.6mM 的過(guò)硫酸鉀溶液充分混合后置于暗處放置12h以上，制成ABTS自由基儲(chǔ)備液。臨用前，儲(chǔ)備液用乙醇稀釋至在734nm處的吸光度值為0.7± 0.02成為工作液用于實(shí)驗(yàn)。100μL不同濃度的樣品溶液與等體積的ABTS工作液混合后室溫下暗處放置10min。用酶標(biāo)儀記錄反應(yīng)體系在734nm處的吸光度值。等體積的乙醇代替樣品溶液作為空白組，維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組平行。ABTS自由基的清除率按照下式計(jì)算。

(2)

As為樣品組吸光度值，Ac為空白組吸光度值。

2.4 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性評(píng)價(jià) 九翅豆蔻根莖四種不同溶劑提取物的降血糖活性通過(guò)其抑制α-葡萄糖苷酶的作用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，試驗(yàn)參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[13]，并作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。30 μL a-葡萄糖苷酶溶液(0.5U/mL，溶解于10mM pH 6.8磷酸鹽緩沖液) 和 10μL不同濃度的樣品溶液(6.25-100μg/mL)混合后，室溫下孵育20 min。加入30μL PNPG溶液(5.0mM, 溶解于10mM pH 6.8磷酸鹽緩沖液中)，37℃水浴中反應(yīng)40min，加入100μL Na2CO3溶液(1M)終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀記錄各反應(yīng)體系在405nm處的吸光度值。等體積的蒸餾水代替樣品溶液作為空白組，等體積的磷酸鹽緩沖液代替酶溶液作為樣品背景組，阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次平行。樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率按照下式進(jìn)行計(jì)算。

(3)

A1為樣品組吸光度值，A2為樣品背景組吸光度值，A3為空白組吸光度值。

2.5 抗炎活性測(cè)試 按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[14]。RAW 246.7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)液中，孵育在37℃含5% CO2的生化培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106 /mL，接種于96孔培養(yǎng)板中(100μL /孔)，37 ℃孵育過(guò)夜。細(xì)胞用LPS進(jìn)行刺激24h，同時(shí)加入不同濃度的樣品進(jìn)行干預(yù)。使用Griess反應(yīng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)液中的亞硝酸根濃度以此反映NO的釋放水平，即50 μl 細(xì)胞培養(yǎng)液與等體積Griess 試劑 A (1% sulfanilamide in 5% 磷酸)混合后室溫下置于暗處反應(yīng)10 min，再加入50μL的Griess試劑 B[0.1%N-(1-Naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride in water] 室溫下繼續(xù)反應(yīng)10min，酶標(biāo)儀記錄反應(yīng)體系在535nm處的吸光度值。由亞硝酸鈉按照上述步驟建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并由此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各細(xì)胞培養(yǎng)液中的亞硝酸根濃度。同時(shí)利用MTT法測(cè)各種的細(xì)胞存活率。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以(x行統(tǒng)表示，各組間的數(shù)據(jù)滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)的條件下進(jìn)行方差分析，兩兩組間比較采用Dunnet t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 九翅豆蔻根莖四種提取物中總黃酮、總多酚和總萜類(lèi)成分的含量 在四種不同溶劑提取物中，CH的總黃酮含量最高，PE和ME中分別是萜類(lèi)和總多酚的含量最高。但是AQ中三種成分的含量都是最低。詳見(jiàn)表1。

表1 九翅豆蔻根莖四種不同溶劑提取物中總黃酮、多酚和萜類(lèi)的含量

注：：表示同列數(shù)據(jù)相比較a,b,cP<0.05[1]。

3.2 九翅豆蔻根莖四種不同提取物的抗氧化活性 九翅豆蔻根莖四種不同溶劑提取物對(duì)DPPH和ABTS兩種自由基都顯示出不同程度清除效果，且對(duì)自由基的清除效果具有濃度依賴(lài)性(圖1)。其中，ME清除自由基的能力最強(qiáng)，而PE的能力最弱。但是所有樣品對(duì)自由基的清除效果都低于陽(yáng)性對(duì)照維生素C。

此外，樣品中總多酚的濃度與其清除DPPH自由基的能力具有顯著的相關(guān)性(R2=0.98，P<0.05)，與ABTS自由基的清除能力也存在一定的相關(guān)性(R2=0.91，P=0.09)。而樣品中總黃酮或萜類(lèi)的含量與清除兩種自由基的效果都沒(méi)有明顯的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道現(xiàn)象一致，即抗氧化活性與多酚的含量存在明顯的關(guān)聯(lián)，而與黃酮含量之間的關(guān)聯(lián)較弱[15]。

3.3 降血糖活性 α-葡萄糖苷酶淀粉和多糖重要的消化酶之一，抑制該酶的活性能夠有效延緩多糖消化的效率，進(jìn)而降低小腸對(duì)葡萄糖的吸收速率，這樣可以抑制餐后血糖水平大幅波動(dòng)，對(duì)于控制糖尿病具有重要意義[16-17]。

研究結(jié)果表明，PE和ME能夠顯著地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，抑制強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的相當(dāng)(P>0.05)；CH顯示出中等程度的α-葡萄糖苷酶抑制作用，而AQ無(wú)明顯的抑制活性(IC50值>100mg/mL)(表2)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)同屬植物草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)的研究結(jié)果相似[18-19]，即有機(jī)溶劑提取物具有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制效果，而水溶性成分無(wú)α-葡萄糖苷酶抑制活性。

表2 九翅豆蔻根莖四種不同提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 (IC50, μg/mL)

注：與陽(yáng)性對(duì)照組比較，**P<0.01。

3.4 抗炎活性 利用LPS-誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型評(píng)價(jià)了九翅豆蔻四種不同溶劑提取物的抗炎活性。結(jié)果表明PE (25～100μg/mL)和CH (12.5～100μg/mL)均能夠明顯地抑制NO的過(guò)度釋放，且抑制效果具有濃度依賴(lài)性。ME在最高測(cè)試濃度時(shí)也能夠降低NO的釋放水平，但是AQ對(duì)NO的釋放水平無(wú)明顯的效果。詳見(jiàn)表3。同時(shí)檢測(cè)四種提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響，ME和AQ對(duì)細(xì)胞正常增殖沒(méi)有明顯的影響，但是PE和 CH在 50和100μg/mL濃度時(shí)會(huì)顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。綜合考慮，PE，CH和ME具有潛在的抗炎活性，但是AQ無(wú)明顯的抗炎活性。

Amomaxins B是YinH等[6]從九翅豆蔻根莖乙醇提取物的二氯甲烷萃取部位分離得的一個(gè)二萜類(lèi)成分，能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO水平(IC50值為31.33μM)，且在濃度高達(dá)100 μM時(shí)對(duì)細(xì)胞的正常增殖仍無(wú)明顯的影響，但是同時(shí)分離得到的另外兩個(gè)該類(lèi)成分無(wú)次活性。

表3 九翅豆蔻根莖四種不同提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的抑制作用

注：與對(duì)照組比較，###P<0.001；與LPS組比較，***、**和*表示P值分別<0.001、0.01和0.05。

4 結(jié)論

研究表明ME提取物具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性、抗氧化活性和較弱的抗炎活性，PE和CH提取物顯示出明顯的α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗炎活性。但是AQ提取物在本研究所使用的三種活性測(cè)試中均沒(méi)有顯示出明顯的作用效果。而且總黃酮、多酚和萜類(lèi)在有機(jī)溶劑中的含量都明顯高于水溶性部位，表明九翅豆蔻的有效成分應(yīng)該屬于脂溶性化合物，而不是水溶性化合物。因此在今后對(duì)九翅豆蔻的進(jìn)一步研究中應(yīng)該把更多注意力集中在有機(jī)溶劑部位。

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Studies on Chemical Composition as well as Antioxidant, Anti-inflammatory and Hypoglycemic Activities of Different Solvent Extracts from the Rhizome ofAmomummaximumRoxb., a Dai Traditional Medicine Material

LU Chuanli1DONG Lihua2

1.Horticulture & Gardening Department, Xishuangbanna Tropical Botanical Garden,Chinese Academy of Sciences, Mengla 666303, China；2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Objective To evaluate the chemical profile and in vitro antioxidant, anti-inflammatory and hypoglycemic activities of different extracts of Amomum maximum rhizome.Methods Four different solvent extracts of A. maximum rhizome were prepared using a Soxthlet extractor, and their total flavonoids, phenolics and diterpenoids contents were analyzed. In additional, radicals scavenging (DPPH and ABTS), α-glucosidase inhibitory, lipypolysaccharide-induced RAW264.7 cells assays were carried out to evaluate their antioxidant, anti-inflammatory, hypoglycemic activities. Results indicated that all four extracts possessed a scavenging capacity for both DPPH and ABTS radicals in different degree, and ME was in the highest degree. PE (IC50=12.87μg/mL) and ME (IC50=16.70μg/mL) showed the an equally α-glucosidase inhibitory activity as that of positive control, acarbose (P>0.05). PE and CH (at concentration 12.5～25μg/mL),as well as ME (at 100μg/mL),displayed a significant inhibitory effect on NO production in LPS-induced RAW(264.7) cells, but no obvious effect on cell proliferation. However, AQ exhibited no significant activity in any assay. In addition, CH, PE, and ME had respectively the highest total flavonoids, diterpenoidsand phenol contents, but AQ had the lowest contents. Conclusion Our findings show that the organic solvent extracts, but not water soluble fraction, should be the active fraction ofA.maximumrhizome. And more researches needed to carry out to further reveal its effective ingredients and underlying mechanism.

AmomummaximumRoxb; Anti-inflammatory;Radical Scavenging; α-glucosidase;Chemical Composition

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81602991)、中國(guó)科學(xué)院西部之光項(xiàng)目。

盧傳禮(1983-)，男，漢族，博士研究生，副研究員，研究方向?yàn)樗幱弥参镉行С煞峙c作用機(jī)制。E-mail: luchuanli@xtbg.ac.cn

R29

A

1007-8517(2017)12-0031-06

2017-04-24 編輯：穆麗華)