宋鳳，陸嘉惠，*，韓春，牛清東，陳超南，李學(xué)禹

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆 石河子832003；2石河子大學(xué)甘草研究所，新疆 石河子832003）

SCoT與EST-SSR標(biāo)記檢測甘草屬（GlycyrrhizaL.）植物遺傳多樣性的比較研究

宋鳳1，陸嘉惠1，2*，韓春1，牛清東1，陳超南1，李學(xué)禹2

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆 石河子832003；2石河子大學(xué)甘草研究所，新疆 石河子832003）

為探討SCoT、EST-SSR標(biāo)記技術(shù)在甘草屬植物遺傳多樣性研究的適用性，采用SCoT、EST-SSR分子標(biāo)記對甘草屬8自然居群的4種1變種共計14個個體進行基因組DNA的多態(tài)性檢測。實驗篩選出的18對SCoT通用引物共擴增出313條帶，其中312條為多態(tài)性條帶，平均多態(tài)率（PPB）為99.68%，平均有效等位基因數(shù)（Ne）和位點品均期望雜合度（He）等遺傳參數(shù)與EST-SSR標(biāo)記無顯著差異。多態(tài)性檢測效率高的標(biāo)記為SCoT，E=17.333，Ai=21.145，高于EST-SSR，E=6.909，Ai=8.719。SCoT與EST-SSR標(biāo)記聚類分析結(jié)果趨勢相似，均將14份材料劃分為3組，與基于形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致。2種標(biāo)記相比，EST-SSR（0.820）產(chǎn)生的平均相似系數(shù)范圍大于SCoT（0.785），EST-SSR標(biāo)記個體間遺傳差異檢測能力略高于SCoT。結(jié)果表明SCoT和EST-SSR兩種標(biāo)記均可揭示甘草屬種間與種內(nèi)的遺傳多樣性水平以及親緣關(guān)系，是進行甘草屬植物自然群體的遺傳結(jié)構(gòu)、種間基因漸滲等研究的有效分子標(biāo)記。其中，SCoT標(biāo)記多態(tài)性高，信息量大，更適于甘草屬植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析；個體間遺傳差異檢測上EST-SSR標(biāo)記效果更佳，更利于疑難種鑒定及親本分析。

甘草屬；SCoT；EST-SSR；遺傳多樣性

豆科（Leguminosae）甘草屬（GlycyrrhizaL.）植物在全世界分布有21種[1]，其中烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensisL.）、光果甘草（G.glabraL.）、脹果甘草（G.inflataBat.）作為藥用甘草植物收錄于《中國藥典(第一部)》[2]。然而野生環(huán)境下甘草屬植物群體間存在自然雜交現(xiàn)象，種內(nèi)、種間遺傳變異復(fù)雜[3-6]，給甘草屬植物野外物種識別、鑒定及種質(zhì)資源的利用和保護帶來很大的困擾，因此采用合理的分析方法研究野生甘草屬植物遺傳多樣性、種質(zhì)資源是非常重要的。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（Start codon targeted polymorphism，SCoT）標(biāo)記是 Collard 和 Mackill(2009)在水稻中提出的一種基于單引物擴增反應(yīng)(single primer amplification reaction，SPAR)的新型分子標(biāo)記方法，這種標(biāo)記能獲得與性狀聯(lián)系緊密的目的基因，并能對性狀進行跟蹤，具有操作簡單、多態(tài)性高、遺傳信息豐富、成本低廉、引物通用性強等優(yōu)點，其中以多態(tài)性檢測效率高，遺傳信息量豐富最為突出[7-10]。目前已廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、種質(zhì)鑒定、基因差異表達和分子遺傳圖譜等研究中，如鴨茅[11]、桃[12]、鷹嘴豆[13]、牛鞭草[14]、穿心蓮[15]和甜椒[16]等，但在甘草屬植物中的應(yīng)用還未見報道。表達序列標(biāo)簽的微衛(wèi)星標(biāo)記（expressed sequence tags-simple sequence repeats，EST-SSR）自開發(fā)以來，廣泛應(yīng)用于植物遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性、性狀關(guān)聯(lián)分析等研究[17-19]。目前EST-SSR標(biāo)記在甘草屬植物種間親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究顯示，該標(biāo)記具有較好的適用性 。

在對野生植物種質(zhì)資源的研究中，研究目的對種質(zhì)材料的信息要求不同，如物種親緣關(guān)系分析中，樣本的組分、樣本間遺傳距離和相似系數(shù)十分重要；以遺傳多樣性評估和群體結(jié)構(gòu)分析為目的，則要求大量的遺傳信息；若以育種為目的則需要更多與性狀相關(guān)的信息。針對不同的研究目的，選擇適宜的標(biāo)記顯得十分重要。

因此，本實驗在前人開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記的基礎(chǔ)上，結(jié)合SCoT標(biāo)記對甘草屬8個自然居群的4個種1個變種共計14個個體，進行遺傳多樣性分析，通過比較兩種分子標(biāo)記的相關(guān)遺傳參數(shù)及聚類結(jié)果，探討2種標(biāo)記在甘草屬植物遺傳多樣性研究的適用性，進一步為甘草屬植自然群體的遺傳結(jié)構(gòu)及種間雜交基因漸滲等方向的研究提供新方法，避免單一標(biāo)記方法對研究結(jié)果造成偏差，更為全面合理的評估甘草屬的遺傳多樣性水平，更好的為我國甘草野生種質(zhì)資源保護及可持續(xù)開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

供試甘草于2015年10月采集自8個自然居群，共14個個體。材料及憑證標(biāo)本存放于石河子大學(xué)甘草標(biāo)本室。材料詳情見表1。每株采集其綠色葉片，使用變色硅膠室溫干燥后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗材料及其采集地Tab.1 Experimental materials and their collecting localities

1.2 儀器與試劑

ProFlexTMPCR System PCR熱循環(huán)儀（Applied Biosystems），MultifugeX1R 高速冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific），Gel DocTMEZ凝膠成像系統(tǒng)（BIORAD），JY600C型電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），Thermo Scientific Nano-Drop 2000 Spectrophotometers分光光度計（Thermo Fisher Scientific）。

EST-SSR、SCoT引物（上海生工生物工程有限公司）、D2000DNAMarker（北京天根）、植物全基因組DNA提取試劑盒（北京天根）、2×Taq PCR MasterMix（北京天根），溴化乙錠（EB）核酸染料（北京索萊寶）、瓊脂糖（Biowest）、其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 總DNA提取及檢測

使用天根植物全基因組DNA提取試劑盒提取甘草總DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計測定其濃度和純度，并稀釋至25 ng/μL，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SCoT-PCR擴增及檢測

SCoT引物采用Collard和Mackill開發(fā)的引物[7]，由上海生工生物工程有限公司合成，共計36條。選取5種甘草 DNA模板進行引物篩選，最終確定18條擴增產(chǎn)物條帶清晰、重復(fù)性高、穩(wěn)定性好、具有差異的引物用于后續(xù)實驗。具體引物信息見表2。

表2 EST-SSR、SCoT引物信息Tab.2 Information of EST-SSR、ScoT primers

SCoT-PCR 反應(yīng)體系：總體積 20 μL，內(nèi)含2×Taq PCR Master Mix 10 μL 引物（10 μmol/L）0.8 μL，模板 DNA（25 ng/μL）1.0 μL，ddH2O 補至 20 μL。擴增程序為94℃預(yù)變性3 min，然后進行36個循環(huán)：94℃變性 50 s，52℃退火 1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR結(jié)束后各取產(chǎn)物5 μL，在3.0%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測（1×TBE緩沖液，電壓100V，1 h）。電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照保存。

1.5 EST-SSR PCR擴增及檢測

EST-SSR引物采用李曉嵐[20]設(shè)計引物（表2），分析使用 PCR反應(yīng)總體積為20體積 20 μL，內(nèi)含2×TaqPCRMasterMix10 μL正 反 向 引 物（10 μmol/L）0.8 μL，模板 DNA （25 ng/μL）1.0 μL，ddH2O補至20 μL。反應(yīng)程序94℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，35個循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR結(jié)束后各取產(chǎn)物5 μL，在5.0%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測（1×TBE緩沖液，電壓100 V，1 h）。電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照保存。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用軟件Image Lab（BIO-RAD）分析膠片，統(tǒng)計每個處理擴增得到的DNA條帶數(shù)，經(jīng)人工校正后以D2000 DNA Marker作為參照標(biāo)準(zhǔn)分子量，對擴增條帶進行分子量預(yù)測，將分子量在±3 bp范圍內(nèi)視為同一位置，后根據(jù)每個樣品的擴增片段大小和位點進行統(tǒng)計，同一位點出現(xiàn)的為“1”，同一位置無條帶或不易分辨的弱帶計為“0”，建立原始“0，1”矩陣。采用GenAlEx6.502軟件計算參數(shù)包括多態(tài)位點百分率（PPB）、平均有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon’s多樣性信息指數(shù)（I）和位點品均期望雜合度（He），ANOVA方差分析比較兩種標(biāo)記位點多態(tài)性揭示效果。依據(jù)Belaj[22]的方法計算標(biāo)記指數(shù)（MI）和有效復(fù)合比（E）樣本間遺傳相似系數(shù)分析使用NTSYS-pc2.1，并按非加權(quán)算數(shù)平均數(shù)聚類（UPGMA）方法構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR與SCoT多態(tài)性分析

篩選出的18條SCoT引物共擴增313條清晰條帶，312條多態(tài)性條帶，平均多態(tài)率為99.68%，擴增片段長度變化范圍在2000 bp到500 bp之間。11對EST-SSR引物多態(tài)性檢測共得到76條清晰條帶，其中76條多態(tài)性條帶，擴增多態(tài)性比率為100%，擴增片段長度在100-250 bp以內(nèi)。2種標(biāo)記在5種甘草樣本間均能產(chǎn)生有效的多態(tài)性條帶，多態(tài)位點百分率(PPB)值十分接近。

2.2 遺傳信息比較

利用GenAlEx6.502軟件計算了基于兩種分子標(biāo)分析樣本所得相關(guān)遺傳參數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 SCoT和EST-SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析比較Tab.3 Comparison of genetic diversity based on SCoT and EST-SSR

EST-SSR和SCoT標(biāo)記檢測出的平均有效等位基因數(shù)（Ne）分別為 1.262和 1.216、Shannon’s多樣性信息指數(shù)（I）分別為0.240和0.210，所揭示的位點平均期望雜合度（He）分別為0.136和0.159。其中Ne和He的ANOVA方差分析（表4）顯示 2種標(biāo)記無顯著差異（PNe=0.1579，>0.05;PHe=0.2632，>0.05）。這表明2種標(biāo)記揭示位點多態(tài)性的效果相似，即評估物種遺傳多樣性水平的能力沒有顯著差異（表4）。

表4 Ne和He的ANOVA方差分析Tab.4 ANOVA analysis ofNeandHe

2.3 標(biāo)記效率分析

有效復(fù)合比（E）和功效指數(shù)（Ai）能夠評價標(biāo)記多態(tài)位點產(chǎn)生效率和位點多態(tài)性效率，2種標(biāo)記中，ScoT的 E和 Ai（17.333，21.145） 均高于 EST-SSR（6.909，8.719），相比之下SCoT標(biāo)記具有更高的多態(tài)性檢測效率。標(biāo)記指數(shù)（MI）能夠綜合的反映位點平均的預(yù)期雜合度和有效復(fù)合比，SCoT標(biāo)記為2.357，高于 EST-SSR 的 1.099。

圖1 基于SCoT(a)和EST-SSR(b)標(biāo)記的5種甘草屬植物UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram of fiveGlycyrrhizaspecies based on SCoT(a)and EST-SSR(b)markers

2.4 聚類分析比較

按非加權(quán)算數(shù)平均數(shù)聚類（UPGMA）方法構(gòu)建聚類圖，結(jié)果顯示2種標(biāo)記聚類趨勢大致相同，結(jié)合線為L時，14份材料均被劃分為 3組（圖1a，b）：烏拉爾甘草組（1~3），組內(nèi)相似系數(shù)范圍分別為；光果、蜜腺甘草組（4~7）；脹、黃甘草組（8~14）。不同物種分支，說明基于SCoT、EST-SSR分子標(biāo)記的五種甘草屬植物遺傳分化結(jié)果與基于形態(tài)學(xué)分類結(jié)果是一致的，兩種標(biāo)記均可用來分析甘草屬植物親緣關(guān)系分析。此外，基于SCoT標(biāo)記建樹（圖1a）的相似系數(shù)范圍為0.690-0.800，平均相似系數(shù)0.785；基于EST-SSR標(biāo)記建樹（圖1b）的相似系數(shù)范圍為0.760-0.880，平均相似系數(shù)0.820。2種標(biāo)記相比，EST-SSR產(chǎn)生的平均相似系數(shù)范圍最大，因此該標(biāo)記比SCoT可檢測到更高的個體間遺傳差異。

3 討論

甘草屬植物存在自然雜交現(xiàn)象[3-6]野生環(huán)境下的雜交種及種內(nèi)不同變異型的存在使得根據(jù)形態(tài)學(xué)的分類鑒定變得復(fù)雜。有的野生甘草的莢果形態(tài)是介于2種或幾種甘草間的過度類型，或偏向于某一種，如黃甘草類群，物種分類鑒定較為困難，因此通過分子標(biāo)記手段對物種進行分類鑒定是十分必要的。

本實驗首次將SCoT分子標(biāo)記應(yīng)用到甘草屬植物種質(zhì)資源研究中，篩選的18對引物共擴增312條多態(tài)性條帶，多態(tài)率為99.68%，高于該標(biāo)記在重樓[23]、杜仲[24]、桃兒七[25]、川續(xù)斷[26]等中的多態(tài)性百分率。EST-SSR標(biāo)記11對引物多態(tài)性為100%，而RAPD[27]和AFLP[28-29]標(biāo)記在甘草屬植物中的多態(tài)性百分率僅別為81.7%和69.43%，說明SCoT、EST-SSR標(biāo)記能夠為甘草屬植物研究提供更為豐富的多態(tài)信息。ANOVA方差分析（表 4）顯示2種標(biāo)記的有效等位基因數(shù)（Ne）和位點平均期望雜合度（He）沒有顯著差異，但 SCoT標(biāo)記的標(biāo)記指數(shù)（MI）為 2.357大于EST-SSR標(biāo)記（1.099），說明 SCoT標(biāo)記多態(tài)性檢測效率高于EST-SSR標(biāo)記，這與以上2種標(biāo)記應(yīng)用于鴨茅銹病的遺傳多樣性研究的結(jié)果相同[30]。此外，Hajibarat等[10]應(yīng)用SSR、SCoT及CDDP標(biāo)記分析鷹嘴豆遺傳多樣性時表明SCoT和CDDP標(biāo)記較SSR標(biāo)記具有更多的多態(tài)引物及更高的多態(tài)性。因而，SCoT標(biāo)記可能更適合用于評估群體遺傳多樣性，或指紋圖譜分析[31-32]。

聚類分析顯示，2種標(biāo)記相比，EST-SSR（0.820）產(chǎn)生的平均相似系數(shù)范圍大于 SCoT（0.785），EST-SSR標(biāo)記個體間遺傳差異檢測能力略高于SCoT。而在群體劃分上，2種標(biāo)記的趨勢相近，在結(jié)合線為L時14份材料劃分為3組，其中4、5號蜜腺甘草與6、7號光果甘草聚為一支，符合經(jīng)典分類中將蜜腺甘草作為光果甘草變種的處理。而黃甘草類群莢果形態(tài)復(fù)雜多變，于1960年首次提出時，便認為是脹果甘草與烏拉爾甘草的雜交種[1]，本實驗中兩種標(biāo)記均將11-14號黃甘草與脹果甘草聚為一組，表明黃甘草與與脹果甘草親緣關(guān)系較近，脹果甘草為黃甘草的雜交親本之一，這與陸嘉惠等[27]以及李曉嵐等[20]的研究結(jié)果相同。此外，根據(jù)EST-SSR標(biāo)記聚類結(jié)果可知，光果、蜜腺甘草組與脹、黃甘草組聚為一支，四者之間親緣關(guān)系較近，且這幾種甘草采集地重疊，根據(jù)李曉嵐等[20]提出黃甘草遺傳特性可能會因同域分布親本種不同的觀點，可以推測本實驗中黃甘草的另一可能雜交親本為光果甘草或者蜜腺甘草。以上結(jié)果表明2種標(biāo)記均能夠揭示甘草屬植物種間、種內(nèi)親緣關(guān)系，而在個體間遺傳差異檢測上EST-SSR標(biāo)記效果更佳，更利于疑難種鑒定及親本分析。

4 結(jié)論

SCoT分子標(biāo)記初步應(yīng)用于甘草屬植物的研究中，引物多態(tài)性及聚類分析均顯示出該分子標(biāo)記在甘草屬植物遺傳多樣性研究中的巨大潛能。在與EST-SSR標(biāo)記比較中，發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)均能作為遺傳標(biāo)記，用于甘草屬遺傳多樣性分析。其中，SCoT標(biāo)記多態(tài)性高于EST-SSR，能夠提供豐富的遺傳信息，更適于甘草屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。而EST-SSR標(biāo)記更有利于疑難種鑒定及親本分析。因此結(jié)合兩種標(biāo)記能夠?qū)Ω什輰僦参镒龀龈尤婧侠淼姆治?，為我國甘草野生種質(zhì)資源保護及可持續(xù)開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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Comparison between SCoT and EST-SSR markers in detection of genetic diversity of wildGlycyrrhizaL.species

Song Feng1，Lu Jiahui1，2*，Han Chun1，Niu Qingdong1，Chen Chaonan1，Li Xueyu2
(1 College of Life Science,Shihezi University/The Key Oasis Eco-Agriculture Laboratory of Xinjiang Production and Construction Group,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 Institute of Licorice in Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

To applied researches in germplasm resources and genetic diversity of medicinal plant inGlycyrrhizawere carried out based on SCoT and EST-SSR molecular markers.Genomic DNA polymorphic comparative analysis by SCoT and EST-SSR markers in,a total of 14 individuals,are collected from 8 natural populations,including four species and one variant of Glycyrrhiza.The results showed that total of 313 bands were detected using 18 pairs of primers,among which 312 were polymorphic bands.The average percentage of polymorphic bands was 99.68%,and there were no significant difference in the average effective number of alleles(Ne)and the expected heterozygosity(He)between EST-SSR and SCoT markers.SCoT marker(E=17.333,Ai=21.145)was higher than EST-SSR (E=6.909,Ai=8.719)in assay efficiency.The systematic diagram of genetic relationship indicated that SCoT and EST-SSR markers grouped the 14 individuals into three major groups of the same.This cluster was in accord with the classical taxonomy,indicating that both methods were efficient in revealing interspecific or intraspecific genetic difference and relationship.These results indicates that SCoT markers bring a rich in polymorphism and informativeness and it would be applied more efficient than EST-SSR to germplasm analysis of the genetic diversty for Glycyrrhiza L..Meanwhile,EST-SSR is good at detecting differences among individuals,and better for identification and parentage analysis.

GlycyrrhizaL.;SCoT;EST-SSR;Genetic diversity

Q949.4

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.014

1007-7383(2017)02-0213-07

2016-11-30

國家自然科學(xué)基金項目(31260042)

宋鳳（1991-），女，碩士研究生，專業(yè)方向為植物分類與多樣性。

*通信作者：陸嘉惠（1974-），女，副教授，從事藥用植物分類與資源研究，e-mail:jiahuil@shzu.edu.cn。