孔祥怡++杜建時(shí)++馬明++徐金玲++李水明++王勇++趙晴

摘要 采用個(gè)體樣品單獨(dú)分析的方式分析， 比較9個(gè)健康對(duì)照者、10個(gè)阿爾茲海默癥（Alzheimer′s disease， AD）患者和12個(gè)認(rèn)知功能障礙（Mild cognitive impairment， MCI）患者的血清多肽組分析結(jié)果， 以尋找潛在的AD病生物標(biāo)志物。結(jié)果表明， 高強(qiáng)度的α2巨球蛋白肽段VGFYEDVMGR與AD病晚期階段密切相關(guān)， 而載脂蛋白 CⅢ、組蛋白12和組蛋白14的大量降解， 則與中早期AD和認(rèn)知功能障礙相關(guān)聯(lián)；載脂蛋白 CⅢ和組蛋白1的降解肽段具有明顯的階梯序列特征， 但在不同樣本中的分布具有一定偶然性。AD病發(fā)展的晚期與中早期的血清多肽組特征不同， 這4種蛋白質(zhì)的降解有可能成為AD病潛在的生物標(biāo)志物。研究結(jié)果也證明了， 歸屬于纖維蛋白原α鏈、胸腺素β4和斑聯(lián)蛋白等蛋白質(zhì)的肽段是所有血清樣本中的優(yōu)勢肽段。本研究提出了利用血清多肽組學(xué)方法輔助診斷AD病的方法， 為臨床大規(guī)模驗(yàn)證提供了依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞 多肽組；生物標(biāo)志物；血清；阿爾茲海默癥；認(rèn)知功能障礙

1引 言

阿爾茲海默癥（Alzheimer′s disease， AD）是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病， AD病目前尚無法治愈和逆轉(zhuǎn)， 早期干預(yù)和診斷是延緩AD發(fā)生的重要途徑＼[1＼]。神經(jīng)心理學(xué)量表測試、影像學(xué)檢查和生物標(biāo)志物檢測是診斷AD病的3種主要方法＼[2＼]。生物標(biāo)志物是能夠預(yù)測或反映特定生物過程變化的物質(zhì)＼[3＼]， 目前公認(rèn)的AD病生物標(biāo)志物是腦脊液（CF）中淀粉樣蛋白Aβ42水平的下降和磷酸化tau蛋白水平的升高＼[4＼]。但是， 腦脊液檢測是有損分析， 作為一種常規(guī)性檢測很難普及， 而在血液、唾液和尿液等體液中尋找AD病的生物標(biāo)志物， 具有取樣方便和無創(chuàng)傷性的優(yōu)點(diǎn)， 其中以血液在臨床上最為常用。

Lista等＼[5＼]對(duì)基于質(zhì)譜的AD病血液生物標(biāo)志物進(jìn)行了綜述， 匯總了約20種蛋白質(zhì)的含量改變和氧化應(yīng)激可成為AD病的生物標(biāo)志物， 并強(qiáng)調(diào)AD等神經(jīng)退行性疾病的分子水平上的改變在出現(xiàn)臨床癥狀的20年以前就可能發(fā)生。血液中tau 蛋白和Aβ42的含量很低， 不是理想的AD標(biāo)志物， 但炎癥和免疫相關(guān)蛋白質(zhì)與AD病關(guān)系密切＼[6＼]。在前期工作中， 本研究組利用iRAQ定量標(biāo)簽技術(shù)對(duì)比AD病患者和年齡匹配對(duì)照組血清中的蛋白質(zhì)， 發(fā)現(xiàn)了100A8等25種差異表達(dá)蛋白， 有可能成為潛在的AD血液生物標(biāo)志物＼[7＼]。血液中磷脂類等小分子化合物也被用來預(yù)測AD?。躘8＼]。O′Bryant等＼[9＼]指出， 基于血液的AD生物標(biāo)志物在過去十余年取得了顯著進(jìn)展， 分析時(shí)間降低， 可接受性增強(qiáng)， 但重復(fù)性較差和缺少不同實(shí)驗(yàn)室之間的交叉驗(yàn)證制約了研究成果向醫(yī)學(xué)臨床的轉(zhuǎn)化。盡管血液中多種蛋白質(zhì)被認(rèn)為有望成為AD病生物標(biāo)志物， 但目前尚未見AD病多肽組生物標(biāo)志物的相關(guān)報(bào)道。

氧化石墨烯磷酸鑭納米磁性復(fù)合材料（LaGM）由石墨烯、LaPO4納米棒和Fe3O4納米粒子構(gòu)成， 可快速富集生物樣品中的低豐度多肽＼[10＼]。在前期研究中， 本研究組利用該材料分離多肽， 建立了納升液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜分析的血清多肽組鑒定方法＼[11＼]。本研究采用單個(gè)樣本逐一分析的方式， 通過對(duì)比AD組、認(rèn)知功能障礙組（Mild congnitive impairment， MCI）和健康對(duì)照組血清多肽組結(jié)果的差異， 從蛋白質(zhì)異常降解的角度尋找潛在的AD病標(biāo)志物， 為臨床診斷和藥效跟蹤等提供參考。

2實(shí)驗(yàn)部分

21儀器與試劑

Eksigent nanoLCUltraM 2D 納升液相色譜系統(tǒng)、riple OF 5600 plus高分辨質(zhì)譜儀、Protein Pilot 45軟件（美國AB CIEX公司）；真空冷凍干燥機(jī)（美國hermo avant公司）。

納升液相色譜流動(dòng)相 A為01% 甲酸2% 乙腈， 流動(dòng)相 B為01% 甲酸98%（V/V）乙腈；C18反相色譜捕集柱（100 μm × 3 cm， 3 μm， 150 ）、C18反相色譜分析柱（75 μm ×15 cm， 3 μm， 120 ， ChromXP Eksigent， 美國ciex公司）。所用試劑均為分析純或質(zhì)譜純， 購于美國hermo公司。氧化石墨烯磷酸鑭納米磁性復(fù)合材料（LaGM）根據(jù)文獻(xiàn)＼[10＼]自行合成。所有臨床樣品來自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院， 符合人體樣品使用要求， 患者知情同意。

22多肽的分離和富集

血清樣本共31例， 每例取80 μL人血清樣品， 加入 500 μL去離子水， 與20 μL 30 mg/mL LaGM 復(fù)合材料混合， 1000 r/min振蕩10 min， 磁分離， 在沉淀中加入500 μL 水， 渦旋1 min， 振蕩5 min， 磁分離去掉上清液。在沉淀中加入20 μL 80% 乙腈+1% FA（V/V）的洗脫液， 渦旋1 min， 振蕩5 min， 磁分離， 收集上清液， 冷凍干燥。

23反相色譜riple OF質(zhì)譜分析

將分離凍干的多肽樣品溶解于流動(dòng)相A中， 在Eksigent nanoLCUltraM 2D系統(tǒng)上進(jìn)行色譜分析。樣品溶液以2 μL/min的流速上樣到C18預(yù)柱（100 μm × 3 cm， 3 μm， 150 ）， 然后保持流速?zèng)_洗脫鹽10 min。分析柱是C18反相色譜柱（75 μm × 15 cm， 3 μm， 120 ， ChromXP Eksigent）， 梯度洗脫： 70 min內(nèi)流動(dòng)相B由5%升高至80% （V/V）。質(zhì)譜分析采用ripleOF 5600系統(tǒng)結(jié)合納升噴霧Ⅲ離子源（AB CIEX， UA）， 噴霧電壓為24 kV， 氣簾氣壓為02 Mpa， 霧化氣壓為34 kPa， 加熱溫度為150℃， 質(zhì)譜掃描方式為數(shù)據(jù)依賴采集模式。

24數(shù)據(jù)分析條件

質(zhì)譜采集到的原始wiff圖譜文件， 采用Protein Pilot oftware v 45（AB CIEX， UA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)加工處理和檢索分析， 數(shù)據(jù)庫為Uniprot庫中的omo sapiens人種專一數(shù)據(jù)庫（包含20210條蛋白質(zhì)序列， 2015年1月2日下載）， 檢索參數(shù)設(shè)置為非酶切， 檢索方式為徹底分析， 假陽性率控制為1% FDR。

3結(jié)果與討論

31血清多肽組的個(gè)體差異及共同特征

相比于串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)， 高分辨的四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜的碰撞能更高， 更易于鑒定非特異性酶切的肽段序列。例如， 纖維蛋白原α鏈的肽段FEKYKMADEAGEADEGKRGA由29個(gè)氨基酸構(gòu)成， 但在本實(shí)驗(yàn)中得到了幾乎互補(bǔ)連續(xù)的y、b離子序列， 還觀察到了苯丙氨酸、組氨酸和谷氨酸的亞胺離子m/z 12008， m/z 11007和m/z 10208（圖1）。

本研究共對(duì)9例健康對(duì)照者、10例AD病患者和12例認(rèn)知功能障礙患者（MCI）的血清樣品進(jìn)行了多肽組成分分析， 結(jié)果如表1所示。對(duì)照組中肽段數(shù)目最少為212條， 歸屬于40個(gè)蛋白質(zhì)， 最多則為歸屬于130個(gè)蛋白質(zhì)的1195條肽段；在AD和MCI組中鑒定到的肽段數(shù)目最少分別為261和406條， 蛋白質(zhì)數(shù)目最少分別為48和65個(gè)蛋白質(zhì)。而在AD組樣品中， 鑒定到的肽段數(shù)目最多為956條， 蛋白質(zhì)數(shù)目最多為96個(gè)， 在MCI組中， 肽段和蛋白質(zhì)數(shù)目最多分別為1095和123個(gè)?？傮w上， AD組和MCI組中的最高肽段數(shù)目約為最低數(shù)目的2倍， 而在9例健康對(duì)照組樣品中， 鑒定到的肽段數(shù)目和蛋白質(zhì)數(shù)目則分別相差6倍和3倍。這些結(jié)果說明， 血清多肽組的個(gè)體差異很大， 如果利用混合樣品進(jìn)行分析則不能發(fā)現(xiàn)這些差異。盡管如此， 來自于纖維蛋白原α鏈、胸腺素β4和斑聯(lián)蛋白等蛋白質(zhì)的肽段在所有個(gè)體血清樣品中都為優(yōu)勢肽段， 與前期研究結(jié)果一致＼[10＼]， 例如， 纖維蛋白原α鏈在全部31個(gè)血清樣本的28樣本個(gè)中鑒定分值排在第一位， 在另外3個(gè)樣本中排在第二位， 其特異性肽段的100條以上， 約占總檢出肽段數(shù)目的15%～40%。

總體而言， 在血清樣品中檢測到的肽段數(shù)目與其所歸屬的蛋白質(zhì)數(shù)目具有正相關(guān)性， 但個(gè)體差異仍然較大。例如， 在對(duì)照組樣品6中鑒定到歸屬于86個(gè)蛋白質(zhì)的593個(gè)肽段， 而在樣本4中， 測到了760個(gè)肽段， 但對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)僅有69個(gè)； 在MCI和AD組樣品中也都存在蛋白質(zhì)數(shù)目和肽段數(shù)目不是嚴(yán)格正相關(guān)的情況。健康對(duì)照組和AD組所檢出的平均肽段數(shù)目約為550條， 對(duì)應(yīng)75種蛋白質(zhì)， 而在MCI組中， 平均肽段和蛋白質(zhì)數(shù)目則分別為710和88。以上結(jié)果表明， 無論是疾病組， 還是健康對(duì)照組樣品， 血清多肽組的鑒定數(shù)目都存在一定差異， 這是因?yàn)榧词共豢紤]相同序列肽段的強(qiáng)度差異， 在定性分析的結(jié)果上也必然存在差異。既然在兩個(gè)對(duì)照組結(jié)果之間都存在差異， 可以推測， 不是一組對(duì)照組和疾病組樣品之間所有的多肽組差異都可作為潛在的生物標(biāo)志物。例如， 存在大量階梯序列是血清多肽組的一個(gè)顯著特征， 這些肽段的結(jié)構(gòu)具有相似性， 但它們在不同個(gè)體樣本中的分布具有隨機(jī)性。例如， 在對(duì)照組樣品1和2中， 含有序列KMADEAGEADEGKRGA的相同肽段有43條， 而含有該序列的不同肽段在樣品1中有6個(gè)， 在樣品2中有7個(gè)。同理， 隨機(jī)比較對(duì)照樣本1和AD樣本6的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 兩個(gè)樣本中也有10條共同肽段含有序列KMADEAGEADEGKRGA。因此， 比較兩個(gè)不同樣本的正常多肽組分析結(jié)果， 通常能找到一些相同肽段和不同肽段， 相同肽段在纖維蛋白原α鏈、胸腺素β4和斑聯(lián)蛋白等優(yōu)勢蛋白中出現(xiàn)幾率更高。另一方面， 此結(jié)果也提示在尋找多肽組生物標(biāo)志物時(shí)， 應(yīng)盡量降低偶然因素的影響。在以上31個(gè)樣本中， 歸屬于纖維蛋白原α鏈的肽段在單個(gè)樣本中可測定到50條以上， 最多則接近300條。Noguchi等＼[12＼]從30例AD病患者和30例健康對(duì)照樣本血清中檢測到了157條總肽段， 根據(jù)離子強(qiáng)度分析， 發(fā)現(xiàn)其中60個(gè)肽段有強(qiáng)度差異， 但只鑒定了包括10條歸屬于纖維蛋白原α鏈的肽段在內(nèi)的16條肽段的序列， 并據(jù)此認(rèn)為一些定量強(qiáng)度在13倍以內(nèi)的纖維蛋白原α鏈可以作為AD病生物標(biāo)志物。但該研究未考慮其分析方法的局限性。

32蛋白質(zhì)水平上血清多肽組標(biāo)志物

前期結(jié)果表明， 如果不同樣品中同一蛋白或肽段的離子強(qiáng)度相差超過3 倍， 則可認(rèn)為其含量具有差異＼[13＼]， 本研究綜合考慮相對(duì)定量和定性分析結(jié)果的差異， 利用離子強(qiáng)度和檢出肽段數(shù)目兩種指標(biāo)衡量不同樣本血清多肽組結(jié)果的差異， 尋找潛在的AD病和認(rèn)知功能障礙（MCI）生物標(biāo)志物。結(jié)果表明， 載脂蛋白 CⅢ、α2巨球（A2M）蛋白、組蛋白12和組蛋白14在對(duì)照組和疾病組之間具有明顯差異， 它們的相對(duì)含量（離子強(qiáng)度）和肽段檢出數(shù)目的增加有可能成為潛在的生物標(biāo)志物， 結(jié)果如表2所示。為了說明個(gè)體差異對(duì)結(jié)果的影響， 表2還列出了各個(gè)體樣本的血清多肽組的總離子強(qiáng)度和這4種蛋白質(zhì)的肽段檢出數(shù)目。健康對(duì)照組、AD組和MCI組的總離子強(qiáng)度平均值分別為14×106， 24×106和24×106。在9個(gè)對(duì)照組血清樣本中， 載脂蛋白CⅢ等四種蛋白質(zhì)的總離子強(qiáng)度普遍偏低， 總離子強(qiáng)度大多低于10×104， 例外的是對(duì)照5樣本中組蛋白14的總離子強(qiáng)度為21×104， 可能是因?yàn)閭€(gè)體差異所致。

α2巨球（A2M）蛋白在AD病理學(xué)中具有重要作用， 與AD相關(guān)的A2M基因的DNA多態(tài)性導(dǎo)致AD腦中淀粉樣斑塊的積累顯著增加＼[14＼]；也有研究表明， 血液中的A2M濃度與腦脊液中神經(jīng)元損傷標(biāo)志物的濃度相關(guān)， 較高的基線血清A2M濃度增加了男性患AD病的幾率＼[15＼]。在10例AD病人的血清樣本中， 有6例α2巨球蛋白的離子強(qiáng)度顯著增加， 而其它3種蛋白質(zhì)的強(qiáng)度無明顯變化。值得注意的是， 以上6例AD病人的發(fā)病時(shí)間均超過4年， 智力減退癥狀和情感障礙已很明顯， 臨床上已不難診斷。因此， 尋找早期的認(rèn)知功能障礙（MCI）階段的生物標(biāo)志物更有意義。在其余的4例AD病和13例MCI血清樣本中， 有10例樣本的載脂蛋白CⅢ的總離子強(qiáng)度和肽段檢出數(shù)目顯著增加， 有14例伴隨著組蛋白12和組蛋白14的肽段檢出數(shù)目和離子強(qiáng)度的顯著增加。有研究指出， 血漿中低水平的載脂蛋白CⅢ會(huì)增加AD病風(fēng)險(xiǎn)， 是AD病的早期標(biāo)志物， 認(rèn)為該蛋白因結(jié)合β淀粉樣蛋白Aβ結(jié)合蛋白而含量降低＼[16＼]。但本研究結(jié)果表明， 載脂蛋白CⅢ蛋白質(zhì)水平上含量的降低也可能由于其降解所致。組蛋白的去乙酰化與AD病發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)， 但組蛋白的降解與AD通過何種方式聯(lián)系目前尚不知曉。盡管如此， 本研究結(jié)果表明， 組蛋白12和14的降解是伴隨MCI和發(fā)病時(shí)間較短的AD病的大概率事件， 可能與AD病的發(fā)生發(fā)展過程相聯(lián)系， 但是在晚期AD病血清中很少能檢測到， 推測該蛋白的降解是人體的應(yīng)激反應(yīng)， 發(fā)病時(shí)間過長， 組蛋白降解的應(yīng)激反應(yīng)減弱， 但與α2巨球蛋白降解相關(guān)的應(yīng)激反應(yīng)加強(qiáng)增加。

33肽段水平上血清多肽組標(biāo)志物的多樣性

通常， 根據(jù)不同樣品中相同肽段的強(qiáng)度差異或者有和無的區(qū)別可以確定潛在的肽段標(biāo)志物， 但是在實(shí)際樣品中情況較為復(fù)雜。分別以載脂蛋白CⅢ和α2巨球蛋白為例進(jìn)行說明。在多肽組分析結(jié)果中， 蛋白質(zhì)總離子強(qiáng)度增加常伴隨檢出肽段數(shù)目的顯著增加。例如，在第10例AD病血清樣本中， 檢測到了36條歸屬于載脂蛋白CⅢ的肽段， 其中17條肽段列于表3， 這17條肽段可視為以肽段PEVRPAVAA和EAEDALLFMQGYMKAKA為基礎(chǔ)延伸出的兩類階梯序列。在一些對(duì)照組樣品中， 能檢測到肽段PEVRPAVAA或EAEDALLFMQGYMKA的類似階梯肽段， 但肽段數(shù)目通常較少， 而強(qiáng)度差別有時(shí)并不明顯， 即疾病組中載脂蛋白CⅢ強(qiáng)度的增加部分來自于檢出肽段的增加。實(shí)際上， 肽段的出現(xiàn)具有偶然性， 例如在有些AD樣本中檢測到的該系列的最短肽段為EAEDALLF， 而最長肽段為EAEDALLFMQGYMKAKAKDALVQEQVAQQA， 因此， 由于個(gè)體差異和肽段的多樣性， 以載脂蛋白CⅢ的降解增加做為生物標(biāo)志物， 比某一特定肽段為潛在生物標(biāo)志物更為穩(wěn)健。

相比之下， α2巨球蛋白的肽段分布情況簡單得多。盡管其是血漿中分子量最大的蛋白質(zhì)， 但檢出的肽段數(shù)目最多5條， 很多情況下為1條（結(jié)果見表2）， 并且均為VGFYEDVMGR， 而其它肽段均與該肽段大部分序列相同， 包括VGFYEDVM （oxidation）GR、FYEDVMGR、GPEGLRVGFYEDVMG、GFYEDVMGR和GPEGLRVGFYE等， 但它們的檢出數(shù)目較少， 并且離子強(qiáng)度低于該肽段一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。因此， 可以認(rèn)為α2巨球蛋白的最主要肽段是VGFYEDVMGR， 6名晚期AD患者α2巨球蛋白的總離子強(qiáng)度較高， 均是因?yàn)樵撾亩螐?qiáng)度高所致。組蛋白12和14的肽段分布情況也較為復(fù)雜， 不像α2巨球蛋白一樣具有很強(qiáng)的規(guī)律性。組蛋白12和14在健康對(duì)照組血清樣本中的強(qiáng)度普遍較低， 而在所有MCI樣本和2例AD病血清中離子強(qiáng)度很高， 這可能與組蛋白1的功能相關(guān)。文獻(xiàn)＼[17＼]表明， 成年人大腦損傷后， 會(huì)向細(xì)胞外釋放組蛋白1， 而組蛋白1可通過線粒體損傷和凋亡來殺死神經(jīng)元， 進(jìn)而造成進(jìn)一步的腦損傷和智力行為變化， 釋放出的組蛋白在體內(nèi)降解后釋放入血液從而被檢測。由于組蛋白的釋放屬于腦損傷的應(yīng)激反應(yīng)， 因此， 在正常人血液中組蛋白肽段含量較低。 AD病的一個(gè)明顯特征是腦內(nèi)能量代謝的障礙， 在晚期AD病人體內(nèi)與組蛋白釋放相關(guān)的應(yīng)激反應(yīng)減弱， 幾乎檢測不到組蛋白1的降解肽段。因此， 組蛋白12和14有可能將MCI和晚期AD相區(qū)別， 并結(jié)合其它指標(biāo)用于AD病的臨床前診斷。

4結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)α2巨球蛋白肽段VGFYEDVMGR與AD病的晚期階段密切相關(guān)， 而載脂蛋白CⅢ、組蛋白12和組蛋白14的大量降解與早期AD和認(rèn)知功能障礙存在關(guān)聯(lián)。個(gè)體樣品的分析結(jié)果表明， 生物標(biāo)志物的多肽組特征與臨床診斷結(jié)果之間可能并不完全一致， 例如， 部分AD病人的血漿多肽組學(xué)特征更接近MCI， 這可能是由于病人的智力表現(xiàn)與病理生理變化不完全同步所致。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了個(gè)體血清多肽組結(jié)果的差異性和共性， 證明纖維蛋白原α鏈、斑聯(lián)蛋白和胸腺素等蛋白質(zhì)的肽段為血清中的優(yōu)勢肽段。

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