張曉丹+趙書雅+李蘊(yùn)琳+朱大嶺+張茹+盛潔靜+王淑靜

[摘要] 探討?；撬幔╰aurine，Tau）通過p-p38通路對(duì)牛肺主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（PAECs）中ICAM-1，VCAM-1的影響及其作用機(jī)制。原代培養(yǎng)PAECs取4～12代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。分為5組：對(duì)照（control）組、缺氧（hyp）組、抑制劑（SB203580）組、給藥（Tau）組、抑制劑+給藥（SB+Tau）組，Tau的給藥濃度為100 mmol·L^-1，p38抑制劑SB203580濃度為20 μmol·L^-1，給藥時(shí)間為12 h。MTT檢測(cè)不同濃度Tau對(duì)PAECs的抑制。使用Western blot及Real-time PCR方法檢測(cè)p38通路蛋白及炎癥因子ICAM-1，VCAM-1的表達(dá)情況。使用免疫熒光檢測(cè)p38核位移情況。MTT結(jié)果顯示隨著Tau濃度增加，對(duì)PAECs增殖抑制增強(qiáng)。Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示在蛋白水平及基因水平Tau都抑制ICAM-1，VCAM-1的表達(dá)。Western blot的結(jié)果和免疫熒光的結(jié)果均顯示Tau可以抑制p38蛋白的活化。Tau可能通過p38 MAPK通路抑制由缺氧引起的牛肺主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1，VCAM-1的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] ?；撬?； p38通路； ICAM-1； VCAM-1

[Abstract] To investigate the effect of taurine（Tau） on ICAM-1， VCAM-1 by p-p38 pathway in bovine pulmonary artery endothelial cells（PAECs） and explore its mechanism of action. Generation 4-12 cells in primary cultures of PAECs were used in experiments and divided into five groups： control group， hypoxia（hyp） group， inhibitor（SB203580） group， treatment（Tau） group， and treatment+inhibitor（SB+Tau） group. The concentration of Tau：100 mmol·L^-1； p38 inhibitor SB203580： 20 μmol·L^-1； and the treatment time was 12 h. MTT assay was used to detect the inhibitory effect of different concentrations of Tau on PAECs. Western blot and Real-time PCR method were used to detect the p38 pathway proteins and ICAM-1， VCAM-1 expression levels. Immunofluorescence was used to investigate p38 nuclear displacement situation. The results of MTT showed that the inhibitory effect was gradually increased with increasing concentrations of Tau. Western blot and RT-PCR revealed that the protein and mRNA expression levels of ICAM-1， VCAM-1 were reduced by Tau. Western blot and immunofluorescence showed Tau can inhibit p38 activation. Tau may decrease the expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 in endothelial cells induced by hypoxia through MAPK p38 pathway.

[Key words] taurine； p38 pathway； ICAM-1； VCAM-1

?；撬嵋杂坞x狀態(tài)存在于人體體液和細(xì)胞中，但含量較低，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道通過體外攝取?；撬徇_(dá)到較高水平時(shí)對(duì)心血管疾病、糖尿病等具有治療作用。其還與缺血性心臟病的死亡率呈負(fù)相關(guān)，具有內(nèi)皮保護(hù)、抗氧化、抗內(nèi)源性損傷、降低高膽固醇血癥、抗平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡等作用，并可抑制血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）的釋放，但關(guān)于?；撬峥寡紫嚓P(guān)作用的文獻(xiàn)卻鮮少報(bào)道[1-2]。

p38屬于分裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）家族是一種非常保守的絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中一組主要的信號(hào)分子，p38通路的激活可促進(jìn)多種促炎因子的表達(dá)和釋放，是調(diào)整炎癥反應(yīng)的重要通路之一[3]。細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）是2種重要黏附分子，同屬于黏附分子的免疫球蛋白超家族。存在于內(nèi)皮細(xì)胞中，受致炎因子刺激時(shí)表達(dá)增加，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[4]。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 新鮮牛肺取自哈爾濱雙城屠宰場(chǎng)，p38，p-p38抗體購(gòu)于碧云天公司，ICAM-1，VCAM-1，二抗辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔和辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗鼠購(gòu)于Santa Cruz公司。

1.2 原代培養(yǎng) 取新鮮胎牛肺分離肺動(dòng)脈，至于緩沖鹽溶液中（HEPEs，1%青/鏈霉素），在超凈臺(tái)內(nèi)縱向剪開血管。使用無(wú)菌刀片從血管內(nèi)表面刮取細(xì)胞，然后移入膠原酶溶液（3 mL/血管，盛于35 mm培養(yǎng)皿）。刮取細(xì)胞完畢后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL EP管。25 ℃溫育細(xì)胞8～9 min后1 500 r·min^-1離心10 min沉淀細(xì)胞。棄上清，洗細(xì)胞3次。離心細(xì)胞棄上清。重懸細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中48 h后清除非黏附細(xì)胞和雜質(zhì)。

1.3 MTT法檢測(cè)Tau對(duì)PAECs增殖的影響 將0.25%胰蛋白酶置于細(xì)胞瓶中消化細(xì)胞，10 s后將細(xì)胞收集到1個(gè)EP管中混勻，均勻接種于96孔板，每孔都加入混勻的細(xì)胞懸液200 μL，置于37 ℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育。貼壁后，按照：H（不加藥），TL（25 mmol·L^-1），TM（50 mmol·L^-1），TH（100 mmol·L^-1）加藥缺氧細(xì)胞箱孵育12 h。取出96孔培養(yǎng)板，每孔加MTT溶液（5 g·L^-1）20 μL，37 ℃正常細(xì)胞培養(yǎng)箱，繼續(xù)孵育，4 h后，棄上清，再每孔加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀上振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處A。

1.4 Western blot 檢測(cè)ICAM-1，VCAM-及p38通路蛋白表達(dá) 收集蛋白以每泳道20 μL蛋白上樣，

經(jīng)120 min電泳后，電轉(zhuǎn)膜至NC膜，分別加入p-p38（1∶1 000），p38（1∶1 000），ICAM-1（1∶400），VCAM-1（1∶400）及β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃封閉過夜后用TBST洗滌，分別搖洗5，15，5，5，5，5 min，分別室溫孵育二抗1 h，暗室顯影，分析條帶。

1.5 Real-time PCR 檢測(cè)ICAM-1，VCAM-1 mRNA表達(dá) 提取RNA，將處理好的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞去除培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞3次，棄盡PBS后加1 mL TRIzol裂解5 min， 提取細(xì)胞總RNA。轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，在EP管中加入0.2 mL氯仿。渦旋混勻室溫靜置15 min。4 ℃，13 500 r·min^-1離心15 min。離心管溶液分3層，吸取最上層溶液400 μL，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻4 ℃，13 500 r·min^-1離心10 min。小心棄去上清，用現(xiàn)配的75%乙醇溶液（用DEPC水配制）清洗懸浮沉淀，4 ℃，10 600 r·min^-1離心5 min。盡棄上清，晾干管底沉淀，加入ddH₂O 20 μL溶解沉淀。測(cè)定RNA濃度及純度。按照cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列ICAM-1 sense：5′-ACCACAGGAGCAACTTCT-3′，antisense：5′-CGTTCAGGACCACTTCAC-3′，VCAM-1 sense：5′-ACTTCTGGTTGCTCTATTGTG-3′，antisense：5′-CAGTCATCTCAGTGGTAGTG-3′，β-actin sense：5′-TCCGTGACATCAAGGAGAAGC-3′，antisense：5′-GCACCGTGTTGGCGTAGAG-3′。

1.6 免疫熒光檢測(cè)p38核位移情況 六孔板中加入經(jīng)滅菌處理后的蓋玻片，細(xì)胞消化后均勻鋪于六孔板中蓋玻片上，培養(yǎng)24 h后分組給藥結(jié)束后，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定15 min后PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，0.5%Triton透化10 min，PBS溶液沖洗3次，每次5 min，3%BSA，37 ℃封閉30 min，PBS沖洗后加入p38一抗（1∶200）4 ℃過夜，第2天回收一抗，PBS沖洗3次，每次5 min，六孔板每孔中的玻片上滴蓋100 μL二抗Cy3熒光二抗，37 ℃避光孵育2 h，PBS沖洗3次，每次5 min，每孔加入100 μL DAPI 孵育15 min，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅劑，封片，置于鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為±s，采用SPSS軟件進(jìn)行分析，進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度?；撬釋?duì)PAECs增殖的影響 通過MTT法測(cè)定細(xì)胞活力能夠間接反映細(xì)胞增殖活力，在缺氧條件下比較各濃度Tau對(duì)PAECs增殖的抑制程度，結(jié)果顯示，缺氧條件下當(dāng)濃度達(dá)到100 mmol·L^-1時(shí)Tau可顯著抑制PAECs增殖（P<0.01），見圖1。

2.2 炎癥因子受缺氧刺激表達(dá)增加 實(shí)驗(yàn)通過Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)缺氧ICAM-1及VCAM-1的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果表明，與空白組對(duì)照，缺氧12 h PAECs中ICAM-1及VCAM-1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均明顯增加，并且，其增加趨勢(shì)呈時(shí)間依賴性。說明隨著缺氧時(shí)間增加炎癥因子也在某種刺激下表達(dá)增加，見圖2。

2.3 ?；撬釢舛葘?duì)炎癥因子表達(dá)影響 根據(jù)PCR及免疫蛋白印記法對(duì)ICAM-1，VCAM-1蛋白及mRNA水平的檢測(cè)，缺氧時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子與常氧比顯著增加，Tau對(duì)炎癥因子的抑制能力隨著Tau濃度增加而增強(qiáng)，說明缺氧誘導(dǎo)的黏附因子表達(dá)被Tau所抑制，當(dāng)濃度達(dá)到100 mmol·L^-1時(shí)抑制作用最強(qiáng)，見圖3。

2.4 Tau對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響 體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，使用Western blot和Real-time PCR檢測(cè)炎癥因子蛋白和mRNA的表達(dá)。缺氧加p38通路抑制劑SB203580處理后及給予100 mmol·L^-1 Tau炎癥因子表達(dá)均有降低，并且在用抑制劑處理后再加入Tau后炎癥因子表達(dá)更低，表明Tau可能通過p38通路抑制炎癥因子表達(dá)，并且與p38通路抑制劑有協(xié)同作用，見圖4。

2.5 Tau對(duì)p38通路的影響 根據(jù)Western blot檢測(cè)p38，p-p38蛋白的表達(dá)，缺氧加p38通路抑制劑SB203580處理后及給予100 mmol·L^-1Tau炎癥因子表達(dá)均有降低，并且在用抑制劑處理后再加入Tau后p-p38蛋白表達(dá)更低，表明Tau可能有抑制p38通路的作用，并且與p38通路抑制劑有協(xié)同作用。免疫熒光結(jié)果顯示常氧及缺氧給藥后與缺氧培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞相比呈核空染狀態(tài)，說明Tau具有抑制p38通路激活的作用，見圖5。

3 結(jié)論

從MTT結(jié)果可以看出，Tau能顯著抑制由缺氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并且具有劑量依賴性，隨著Tau的濃度增加，內(nèi)皮細(xì)胞的抑制效果越明顯。根據(jù)此結(jié)果，本試驗(yàn)認(rèn)為在缺氧條件下Tau能有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，最佳給藥濃度為100 mmol·L^-1。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時(shí)間增加，炎癥因子表達(dá)逐漸增加，姑且推斷缺氧可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1，VCAM-1，而在炎癥因子表達(dá)高峰時(shí)給予不同濃度Tau時(shí)，炎癥因子會(huì)隨著給藥濃度增加而降低，在缺氧12 h給藥濃度為100 mmol·L^-1時(shí)效果最佳。目前認(rèn)為在血管內(nèi)由于內(nèi)皮功能受損或氧化應(yīng)激等因素都可以導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，炎癥反應(yīng)又可以引起其他病變，因?yàn)镮CAM-1，VCAM-1是反映局部和全身炎癥的主要炎癥標(biāo)志物，所以通過觀察ICAM-1和VCAM-1水平的變化本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為Tau可能具有抑制缺氧引起的炎癥的功能。

Western blot和免疫熒光的結(jié)果顯示，Tau能有效抑制p38通路的激活，明顯一直降低p-p38的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)推斷Tau可能通過抑制p38通路的激活以降低內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子的表達(dá)從而達(dá)到抗炎作用。

雖然肺動(dòng)脈高壓成因復(fù)雜，現(xiàn)在尚未完全研究透徹其致病機(jī)制，但其發(fā)生發(fā)展始終伴隨炎癥過程[5]，炎癥因子在炎癥細(xì)胞募集、炎癥的維持及進(jìn)展方面有重要作用[6]，肺動(dòng)脈高壓炎癥作為PAH早期診斷標(biāo)準(zhǔn)也逐漸被認(rèn)可。并且其血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)會(huì)引發(fā)肺血管重構(gòu)等相關(guān)病變，這也是肺動(dòng)脈高壓初始的重要特征，并且是肺動(dòng)脈高壓的基本病理特征[7]。p38 MAPK則是絲裂原活化蛋白激酶家族的成員，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種生理及病理過程[8-9]。p38 MAPK主要通過被 MKK3，4，6磷酸化后發(fā)生激活，進(jìn)而磷酸化下游的通路蛋白[10-11]。 因此，檢測(cè)p38 MAPK可以反映該通路的活化狀態(tài)。所以，通過p38通路抑制肺動(dòng)脈炎癥的發(fā)展進(jìn)而達(dá)到逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈內(nèi)皮層增殖，將很可能成為治療肺動(dòng)脈高壓新的關(guān)鍵入手點(diǎn)。ICAM-1，VCAM-1的表達(dá)一方面內(nèi)皮細(xì)胞增殖密切相關(guān)，另一方面，其也是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志蛋白，其表達(dá)的增高將可能成為肺動(dòng)脈高壓炎癥早期診斷的標(biāo)志物和治療的關(guān)鍵?？寡字委煂⒊蔀橐粭l治療肺動(dòng)脈高壓新的途徑，從穩(wěn)定內(nèi)皮功能、減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制肺血管炎癥，達(dá)到抑制血管增生、減輕血管重構(gòu)的目的。

通過實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)Tau抑制p38通路的激活，這可能是Tau抗炎作用的一個(gè)方面。因此本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，p38通路在肺動(dòng)脈高壓中發(fā)揮了一定的作用，Tau或可能通過其抗炎作用抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖來(lái)緩解肺動(dòng)脈高壓，但其長(zhǎng)期作用還有待進(jìn)一步觀察。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]