徐紅貞　萬(wàn)萍　單蘭君

摘要：候鳥(niǎo)分子生物學(xué)研究的前提是獲得質(zhì)量好的基因組DNA，采用標(biāo)準(zhǔn)血液DNA提取試劑盒和苯酚-氯仿法分別對(duì)采自鄱陽(yáng)湖的部分候鳥(niǎo)血液進(jìn)行基因組DNA提取。結(jié)果表明，這2種標(biāo)準(zhǔn)方法所獲得DNA質(zhì)量均不合要求，因此在苯酚-氯仿法基礎(chǔ)上開(kāi)展優(yōu)化試驗(yàn)，得到優(yōu)化后的苯酚-氯仿法提取條件為組織裂解液500 μL、血液樣品20 μL、蛋白酶K 10 μL和酶解時(shí)間8 h，在此條件下能分離到高質(zhì)量的基因組DNA。

關(guān)鍵詞：候鳥(niǎo)基因組；分離；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：Q959.7；Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）11-2145-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.038

Abstract： The premise of migratory bird molecular biology is to obtain high purity and good quality genomic DNA， and the DNA extraction method of common species is not suitable for the isolation and extraction of DNA from migratory birds. The first uses standard blood DNA extraction kit and classical phenol chloroform method genomic DNA blood migratory birds in Poyang Lake were extracted. The results showed that the two standard methods for the quality of DNA are undesirable. Therefore， the optimization test in the classical phenol chloroform method carried out， found that the optimized phenol chloroform method（tissue lysates 500 μL， blood samples 20 μL， proteinase K 10 μL and enzyme hydrolysis time 8 hours），the high quality genomic DNA could obtain under the condition.

Key words： birds genome； separation； optimization

候鳥(niǎo)分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵是獲取高質(zhì)量和完整的基因組DNA，目前提取基因組DNA的方法較多，實(shí)驗(yàn)室提取DNA的方法主要包括苯酚-氯仿法和試劑盒法。試劑盒法是利用核酸在一定濃度溶液條件下吸附固相介質(zhì)（二氧化硅膜）的原理，在實(shí)際操作中采用優(yōu)化的緩沖體系使裂解液中的DNA高效特異地結(jié)合在硅基質(zhì)離心吸附柱上，通過(guò)幾次洗滌除去雜質(zhì)，最后采用低鹽緩沖液洗脫獲得高純度DNA。試驗(yàn)中不使用苯酚和氯仿等有毒溶劑，也無(wú)需乙醇沉淀等步驟。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，但其存在離子殘留量大的問(wèn)題，對(duì)后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)尤其是測(cè)序反應(yīng)等造成嚴(yán)重干擾[1]。苯酚-氯仿法是提取基因組DNA最經(jīng)典方法，其主要原理是根據(jù)在水相與酚/氯仿有機(jī)相中DNA和雜質(zhì)的溶解度存在差異而進(jìn)行分配，通過(guò)離心分離出蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再利用乙醇沉淀洗滌DNA，最后獲得DNA。該方法成本低，所用試劑均為常用試劑，提純效率高，但不足之處是耗時(shí)費(fèi)力、核酸降解程度大，且所用試劑苯酚和氯仿等具有一定毒性[2]。此外還有鹽析法、樹(shù)脂法、Chelex100法、硅顆粒法、碘化鉀法等，每種方法均有優(yōu)勢(shì)和不足，有其適應(yīng)范圍?？铝竦萚3]利用樹(shù)脂法、酚-氯仿抽提法、鹽析法對(duì)禽類全血基因組DNA進(jìn)行提取，結(jié)果表明鹽析法適合雞全血DNA的提取，其特點(diǎn)是DNA的濃度和純度好，耗時(shí)短、成本低、操作簡(jiǎn)單。陳小麟等[4]利用蛋白酶K法、Chelex100法、硅顆粒法對(duì)鳥(niǎo)類陳舊標(biāo)本的羽毛、皮膚、骨骼組織中提取基因組DNA，結(jié)果表明Chelex100不適合鳥(niǎo)類標(biāo)本的DNA提取，蛋白酶K法DNA的提取量大于硅顆粒法。任春環(huán)等[5]在提取山羊全血基因組DNA時(shí)，通過(guò)比較酚-氯仿抽提法和碘化鉀法，發(fā)現(xiàn)改良的Miller鹽析法操作步驟復(fù)雜，耗時(shí)更長(zhǎng)，苯酚-氯仿法更簡(jiǎn)便。王洪梅等[6]在提取牛的凝血塊基因組DNA試驗(yàn)中，也是采用經(jīng)典苯酚-氯仿法，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)效果較好，但濃度有些偏低。曹果清等[7]利用組織DNA抽提液而非蛋白酶K對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，經(jīng)酚-氯仿抽提后用無(wú)水乙醇來(lái)沉淀提取DNA，經(jīng)檢測(cè)DNA的純度和濃度均較高。

目前，關(guān)于動(dòng)物血液DNA的提取方法較多，但對(duì)候鳥(niǎo)基因組DNA的提取鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)首先采用通用型柱式基因組提取試劑盒法和苯酚-氯仿法提取候鳥(niǎo)基因組DNA，比較兩種方法所分離基因組DNA的質(zhì)量，篩選適宜的候鳥(niǎo)基因組DNA提取方法，如果結(jié)果不理想，進(jìn)一步優(yōu)化苯酚-氯仿法以獲取最佳分離提取候鳥(niǎo)基因組DNA的方法，以期從分子生物學(xué)、遺傳多態(tài)性方面對(duì)候鳥(niǎo)生物特性研究提高參考，為保護(hù)瀕危候鳥(niǎo)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于鄱陽(yáng)湖國(guó)家自然保護(hù)區(qū)野生動(dòng)物保護(hù)站采集若干只候鳥(niǎo)個(gè)體的血液（包括白額雁、鴻雁、豆雁、野鴨等品種），采集的血液樣品放入-20 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)試劑

CW2298禽血DNA提取試劑盒，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；Bis-Tris、EDTA和SDS，購(gòu)自上海生工有限公司；Tris平衡酚，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自Invitrogen中國(guó)公司；三氯甲烷，購(gòu)自西隴化工股份有限公司；異戊醇和無(wú)水乙醇，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；蛋白酶K，購(gòu)自羅氏ROCHE中國(guó)公司；RNA酶，購(gòu)自北京合式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 DNA的提取方法

1.3.1 試劑盒法 采用康為CW2298試劑盒法提取基因組DNA，試驗(yàn)操作參照禽血DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 苯酚-氯仿提取法 苯酚-氯仿法提取基因組DNA試驗(yàn)步驟：取適量鳥(niǎo)類抗凝血樣品，加入1 倍體積的組織裂解液，加蛋白酶K，混勻后于55 ℃水浴10 h，離心，上清液置于新的EP管，加入等量的苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）（體積比）緩慢顛倒搖勻，離心，將上清液移至新EP管；加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）緩慢顛倒混勻，離心；將上清液移至新EP管，加入NaAc和無(wú)水乙醇；取白色沉淀，用70%乙醇洗滌3次，除去殘留乙醇，室溫晾干，加入TE緩沖液溶解基因組DNA，于-20 ℃保存。

1.3.3 優(yōu)化的苯酚-氯仿提取法 苯酚-氯仿法提取部分候鳥(niǎo)基因組DNA，通過(guò)檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)其RNA、蛋白質(zhì)殘余量較高，有部分DNA降解，而試劑盒提取的DNA離子殘留量大，消化不徹底，有些條帶不清晰。因此，本試驗(yàn)基于苯酚-氯仿法的候鳥(niǎo)基因組DNA提取優(yōu)化試驗(yàn)，具體優(yōu)化參數(shù)如表1所示，依次進(jìn)行細(xì)胞裂解液、血液量、消化時(shí)間以及蛋白酶K 4個(gè)因素的優(yōu)化試驗(yàn)，且每次試驗(yàn)僅改變一個(gè)影響因素，以此不斷優(yōu)化候鳥(niǎo)血液DNA提取試驗(yàn)方案。

1.4 基因組DNA的檢測(cè)

1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳 將上述3種提取方法分離的基因組DNA采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。取 2 μL稀釋后的DNA與上樣緩沖液混勻后加入0.8%瓊脂糖凝膠樣品孔中，于120 V電泳20 min，電泳后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察DNA條帶，保存圖片[8]。

1.4.2 DNA濃度測(cè)定 取1 μL提取的基因組DNA，利用ND2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定基因組DNA 樣本的OD260 nm、OD280 nm吸光度，計(jì)算分析基因組DNA的純度和濃度[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳檢測(cè)結(jié)果

圖1為采用禽血試劑盒提取的候鳥(niǎo)基因組DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳結(jié)果，可以看出條帶亮度不一，有的甚至不清晰，且大部分條帶蛋白質(zhì)殘余嚴(yán)重，還存在拖帶現(xiàn)象。

圖2為采用苯酚-氯仿法提取的候鳥(niǎo)基因組DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳結(jié)果，可見(jiàn)帶型不整齊，大部分條帶不清晰，有些條帶蛋白質(zhì)殘留較多，還有拖帶現(xiàn)象嚴(yán)重，可能是基因組DNA出現(xiàn)降解、蛋白酶K用量不恰當(dāng)、組織裂解液用量大，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等導(dǎo)致的不良現(xiàn)象。

從上述試驗(yàn)結(jié)果可知，禽血DNA提取試劑盒法、苯酚-氯仿DNA提取法所分離到的樣本DNA均不理想，不合要求。為此本試驗(yàn)在苯酚-氯仿法基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，依次對(duì)細(xì)胞裂解液、血液量、消化時(shí)間以及蛋白酶K 4個(gè)主要因素的進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，且每次試驗(yàn)僅改變一個(gè)影響因素，優(yōu)化候鳥(niǎo)血液DNA提取試驗(yàn)方案，最終確定優(yōu)化后的苯酚-氯仿DNA提取方案為組織裂解液為500 μL、血液樣品為20 μL、蛋白酶K為10 μL和酶解時(shí)間為8 h。采用該優(yōu)化方案進(jìn)行候鳥(niǎo)血液DNA提取，其提取效果如圖3所示。從圖3可以看出，候鳥(niǎo)基因組DNA條帶總體清晰、明亮、無(wú)拖帶，且基因組DNA無(wú)降解，產(chǎn)量較高。

2.2 候鳥(niǎo)血液基因組DNA的濃度和純度

從表2可以看出，所提取的候鳥(niǎo)基因組DNA的濃度符合要求，均在20 ng/μL以上，純度A260 nm/A280 mm的比值大部分在1.80～1.90范圍內(nèi)，A260 nm/A230 nm的比值在2.00～2.50范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)表明該DNA雜質(zhì)含量少，純度較高，個(gè)別樣品A260 nm/A280 mm超過(guò)了2.00、A260 nm/A230 nm超過(guò)了2.50，但是從大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)分析，候鳥(niǎo)基因組DNA的濃度和純度之間不存在必然的聯(lián)系，濃度為20.8 ng/μL的樣品純度A260 nm/A280 mm為1.81，濃度低不一定是樣品不純?cè)斐傻?。因此，?yōu)化后的苯酚-氯仿提取法提取候鳥(niǎo)基因組DNA的效果較好。

3 小結(jié)與討論

為了提高候鳥(niǎo)血液基因組DNA的提取質(zhì)量，在苯酚-氯仿提取法基礎(chǔ)上對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，分析最優(yōu)的提取方案，細(xì)胞裂解液為500 μL、血液樣品為20 μL、蛋白酶K為10 μL和消化時(shí)間為8 h，獲得的候鳥(niǎo)基因組DNA濃度和質(zhì)量較高。本試驗(yàn)提取了約200只候鳥(niǎo)（主要包括白額雁、鴻雁、豆雁、野鴨等）DNA，并取部分DNA開(kāi)展了PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，獲得理想的擴(kuò)增效果，可用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)試驗(yàn)。

候鳥(niǎo)是有遷徙行為、春秋兩季更換棲息地的鳥(niǎo)類。為了更好地從分子角度研究珍稀候鳥(niǎo)的遺傳、進(jìn)化以及對(duì)當(dāng)?shù)丶仪莸挠绊?，獲得質(zhì)量好、純度高的血液DNA是關(guān)鍵[10]。因此，有必要選擇一種快速、簡(jiǎn)便、高效的提取候鳥(niǎo)血液DNA的方法。本試驗(yàn)采用禽血試劑盒法和苯酚-氯仿抽提法分別提取基因組DNA，并且對(duì)這兩種方法進(jìn)行比較。試劑盒法雖然簡(jiǎn)便易操作，但得到的候鳥(niǎo)基因組DNA濃度和質(zhì)量較差，且離子殘留量大，影響后續(xù)候鳥(niǎo)分子生物學(xué)的研究[11]。苯酚-氯仿法提取的DNA電泳圖條帶模糊，雜蛋白質(zhì)殘留多，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，不適合下一步研究使用。因此，在苯酚-氯仿法基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化了試驗(yàn)條件。鳥(niǎo)類紅細(xì)胞大多是呈橢圓形，有細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，因此可以直接提取基因組DNA，但為了不影響所提取基因組DNA的質(zhì)量，血液樣品的量不宜過(guò)多[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)血樣樣品量為20 μL時(shí)，基因組DNA的條帶較好。組織裂解液會(huì)使血液樣品的黏度增大，影響蛋白酶K的催化活性，候鳥(niǎo)基因組DNA的獲取量與細(xì)胞被裂解的程度相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞裂解液為500 μL時(shí)，基因組DNA條帶整齊、集中、無(wú)拖尾現(xiàn)象。血液的消化時(shí)間是另一關(guān)鍵因素，將直接影響高質(zhì)量基因組DNA的提取，本試驗(yàn)分別采用消化時(shí)間為6、8、10 h，分別提取候鳥(niǎo)血液基因組DNA，比較其電泳結(jié)果可知，消化時(shí)間為8 h時(shí)條帶亮度和清晰度較高，也更整齊，說(shuō)明酶解8 h時(shí)的基因組DNA提取效果最好。蛋白酶K的作用是將纏繞在DNA上的蛋白質(zhì)降解為小分子的肽鏈或者氨基酸，使DNA完整分離[13]。結(jié)果表明，蛋白酶K為10 μL時(shí)，DNA條帶最好?？梢?jiàn)優(yōu)化后的苯酚-氯仿抽提法可以使基因組DNA充分釋放，有效地提高DNA的濃度和質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] 田秀華，劉 鑄，白素英.珍稀瀕危鳥(niǎo)類微量取樣及DNA提取的研究[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005，9（4）：215-218.

[2] 吳慧英，劉 鈾，賈汝敏，等.鵝血液基因組DNA的簡(jiǎn)單快速提取方法研究[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2010，35（4）：29-31.

[3] 柯柳玉，謝燕燕，肖天放，等.禽類全血DNA不同提取方法的比較[J].福建畜牧獸醫(yī)，2008，30（2）：4-6.

[4] 陳小麟，麻常昕，李 琪.鳥(niǎo)類陳舊標(biāo)本DNA提取方法的研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，47（2）：1-4.

[5] 任春環(huán)，張子軍，張孝榮，等.三種山羊全血基因組DNA提取方法的比較[J].中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)，2010，30（4）：22-24.

[6] 王洪梅，曹巖峰，李建斌，等.牛血凝塊基因組DNA提取方法的建立[J].中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)，2007，27（6）：39-40.

[7] 曹果清，莫清珊，陳鳳仙.酚/氯仿抽提法提取綿羊凝血塊中基因組DNA[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（34）：16771-16772.

[8] 霍金龍，羅古月，張 娟，等.從豬血中提取高質(zhì)量基因組DNA 的研究[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2004（3）：23-24.

[9] 李金璐，王 碩，于 婧，等.一種改良的植物DNA提取方法[J].植物學(xué)報(bào)，2013，48（1）：72-78.

[10] 戴 劍，洪德林，張大棟，等.一種快速高效的DNA提取方法研究[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2011，31（3）：437-442.

[11] CHAISOMCHIT S，WICHAJARN R，CHOWPREECHA S，et al.A simple method for rextraction and purification of genomic DNA from dried blood spotson filterpaper[J]. Southeast Asian J Trop Med PublicHealth，2003，34（3）：641-645.

[12] 張維銘.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2003.

[13] 吳清敏，劉巧紅，滕 云，等.外周血DNA提取方法的比較[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，27（7）：445-447.