祝婷婷 王琛 楊婧 周珊珊

摘要：目的 觀察腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)5/6（A/I）腎切除慢性腎功能衰竭（CRF）大鼠殘腎組織病理形態(tài)及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法 制備5/6（A/I）腎切除CRF大鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、西藥組和中藥組，各給藥組給予相應(yīng)藥物。給藥60 d后，測(cè)定大鼠血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、血紅蛋白（Hb）、內(nèi)生肌酐清除率（Ccr），觀察殘腎組織病理形態(tài)，免疫組化檢測(cè)殘腎組織TNF-α的表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，各給藥組大鼠SCr和BUN水平顯著降低、Hb和Ccr顯著升高（P<0.05，P<0.01），各給藥組大鼠殘腎組織病理改變均有改善，各給藥組大鼠TNF-α水平顯著降低（P<0.01），且中藥組均優(yōu)于西藥組。結(jié)論 腎衰Ⅱ號(hào)方可改善CRF大鼠腎功能及腎組織病理改變，其抗腎間質(zhì)纖維化機(jī)制可能與其改善腎組織缺血缺氧、調(diào)節(jié)TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：腎衰Ⅱ號(hào)方；慢性腎衰竭；腫瘤壞死因子-α；腎間質(zhì)纖維化；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.013

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）07-0054-04

Abstract： Objective To observe the effects of Shenshuai Ⅱ Prescription on expressions of pathologic morphology and TNF-α in nephridial tissue of chronic renal failure （CRF） rats induced by 5/6th kidney （ablation/infarction， A/I）； To investigate its possible mechanism of action. Methods 5/6 （A/I） nephrectomized CRF rat models were prepared and randomly divided into sham-operation group， model group， Western medicine group and TCM group. Each medication group was given relevant medicine. The levels of serum creatinine （SCr）， blood urea nitrogen （BUN）， hemoglobin （Hb） and endogenous creatinine clearance （Ccr） were measured after 60 days of administration. The histopathology of residual kidney was observed， and the expression of TNF-α in residual renal tissue was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the model group， the levels of SCr and BUN significantly decreased， while Hb and Ccr significantly increased in each medication group （P<0.05， P<0.01）. The pathological changes of the residual renal tissue were improved in each medication group. The expression of TNF-α protein in the rats of medication group was significantly lower than that in the Western medicine group （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Shenshuai Ⅱ Prescription can improve renal function and alleviate changes of renal pathology in CRF rats. The mechanism of anti-renal interstitial fibrosis may be related to the improvement of renal ischemia and hypoxia and the regulation of the expression of TNF-α.

Key words： Shenshuai Ⅱ Prescription； chronic renal failure； TNF-α； renal interstitial fibrosis； rats

腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）進(jìn)展至終末期腎臟病的共同特征。有研究顯示，CKD存在腎小管間質(zhì)的缺血缺氧[1-2]。缺氧長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是CKD進(jìn)展的主要因素之一，通過(guò)直接調(diào)控和協(xié)同作用促纖維化因子、某些缺氧反應(yīng)基因，損傷細(xì)胞的能量代謝，影響炎性細(xì)胞的功能，促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生和發(fā)展[3]。課題組前期研究顯示，腎衰Ⅱ號(hào)方可改善慢性腎功能衰竭（CRF）大鼠腎功能、提高腎小球?yàn)V過(guò)率（GFR）、糾正貧血、增加腎血流量、降低殘余腎內(nèi)氧耗[4]。本研究進(jìn)一步觀察腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)5/6（ablation/infarction，A/I）腎切除大鼠殘余腎組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）蛋白表達(dá)的影響，探討腎衰Ⅱ號(hào)方改善腎間質(zhì)纖維化（RIF）的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康成年SD大鼠69只，雄性，8周齡，體質(zhì)量190～210 g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2008-0016。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（55±2）%，12 h光照，自由飲水?dāng)z食。

1.2 藥物

腎衰Ⅱ號(hào)方（黨參15 g、丹參15 g、當(dāng)歸15 g、淫羊藿15 g、紫蘇葉15 g、川芎15 g、桃仁15 g等），上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑科制備，濃度7.58 g/mL；氯沙坦鉀片，杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)20120330，100 mg/片；福辛普利鈉片，中美上海施貴寶制藥有公司，批號(hào)201211，10 mg/片，蒸餾水制備混懸液，濃度6.42 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

兔抗大鼠多克隆抗體TNF-α（批號(hào)ab66579），美國(guó)Abcam公司；SABC三步法免疫組化試劑盒（批號(hào)SA1022）、DAB顯色液（批號(hào)AR1022），武漢博士德公司。倒置顯微鏡（型號(hào)LEICA DMIL）、圖像采集系統(tǒng)（型號(hào)LEICA DFC295），德國(guó)LEICA公司；圖像分析系統(tǒng)（型號(hào)Image-pro-plus5.1），上海求為生物科技有限公司。

1.4 造模、分組及給藥

隨機(jī)選取14只大鼠為假手術(shù)組，其余55只制備5/6（A/I）慢性腎衰模型[2]。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉，常規(guī)消毒、備皮，在左側(cè)肋弓下0.5 cm、脊柱向左旁開1 cm處切口（垂直于脊柱，長(zhǎng)約2.5 cm）。經(jīng)腹膜后取左腎，分離腎包膜后，將左腎動(dòng)脈的2/3分支結(jié)扎，縫合。1周后摘除右腎。4周后斷尾法采血，測(cè)定腎功能指標(biāo)，剔除造模失敗和死亡動(dòng)物共13只后，根據(jù)血肌酐（SCr）水平隨機(jī)分為模型組、西藥組、中藥組，每組14只。大鼠劑量按成人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量（60 kg）常規(guī)用量20倍給藥。中藥組予腎衰Ⅱ號(hào)方藥液灌胃，西藥組予氯沙坦鉀聯(lián)合福辛普利鈉藥液灌胃，假手術(shù)組和模型組予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。給藥體積均為2 mL，每日1次，連續(xù)60 d。

1.5 取材

大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心，收集血清。摘取殘腎組織于10%中性福爾馬林緩沖液中固定>24 h后脫水，石蠟包埋，制成3 μm切片。常規(guī)HE染色，觀察腎臟組織病理形態(tài)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 生化指標(biāo)檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)SCr、尿素氮（BUN）、血紅蛋白（Hb）。用內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）代替GFR。Ccr（mL/min）=尿肌酐×24 h尿量÷血清肌酐×1440[6]。

1.6.2 腎組織腫瘤壞死因子-α表達(dá)檢測(cè) 采用SABC免疫組化三步法。3 μm切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性消化酶，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 6.0）抗原修復(fù)，5%BSA封閉液封閉；適當(dāng)稀釋一抗，4 ℃過(guò)夜，生物素化二抗，37 ℃、30 min；滴加SABC復(fù)合物，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。每個(gè)樣本隨機(jī)選取高倍鏡下5個(gè)不同視野，分析每個(gè)視野棕黃色染色區(qū)域反應(yīng)面積作為陽(yáng)性面積占總視野面積的百分比，取其平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD、S-N-K法，組內(nèi)治療前后比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)模型大鼠給藥前后生化指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組比較，給藥前后模型組SCr、BUN水平明顯升高（P<0.01），Ccr、Hb水平明顯降低（P<0.01）；給藥后與模型組比較，西藥組、中藥組SCr和BUN水平明顯降低（P<0.05，P<0.01），Ccr和Hb水平明顯升高（P<0.01）；西藥組、中藥組給藥后較給藥前SCr和BUN水平明顯降低（P<0.05，P<0.01），Ccr和Hb水平明顯升高（P<0.01），且中藥組明顯優(yōu)于西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表1。

2.2 腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)模型大鼠殘余腎組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組腎小球結(jié)構(gòu)正常，Bowman囊腔結(jié)構(gòu)清晰，腎小球基底膜較薄、無(wú)增厚；小管基底膜薄，管腔無(wú)擴(kuò)張、無(wú)囊腫，管周無(wú)纖維化。腎間質(zhì)無(wú)水腫、無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、無(wú)纖維化；模型組腎小球結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，近全球性硬化，球周纖維化，毛細(xì)血管管腔閉塞、球囊粘連，腎小球基底膜彌漫增厚；腎小管擴(kuò)展并充滿蛋白管型；腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見纖維化。西藥組腎小球結(jié)構(gòu)較模型組完整，Bowman囊腔結(jié)構(gòu)較模型組清晰，無(wú)明顯球囊粘連，腎小球硬化程度明顯減輕；腎小管管腔無(wú)明顯擴(kuò)張，管腔內(nèi)見少量蛋白管型；間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減少。中藥組腎小球結(jié)構(gòu)較西藥組完整，纖維化程度減輕，Bowman囊存在，無(wú)球囊粘連，囊腔結(jié)構(gòu)較西藥組完整；管腔無(wú)明顯擴(kuò)張，未見明顯蛋白管型；間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較西藥組減輕。結(jié)果見圖1。

2.3 腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)模型大鼠殘余腎組織腫瘤壞死因子-α水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織TNF-α水平明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織TNF-α水平明顯降低（P<0.01），且中藥組明顯低于西藥組（P<0.01）。結(jié)果見表2、圖2。

3 討論

腎血流量占心輸出量的1/4，但僅有10%的氧被腎臟攝取，大多流向腎皮質(zhì)以保證腎小球?yàn)V過(guò)和溶質(zhì)的再吸收，腎髓質(zhì)血流量較低[5]。腎皮質(zhì)氧分壓約為50 mm Hg，髓質(zhì)氧分壓只有10～20 mm Hg[6]。腎小管大量氧的需求和局部較低的氧供，導(dǎo)致生理性皮質(zhì)和髓質(zhì)的低氧壓張力，腎組織內(nèi)環(huán)境處于低氧狀態(tài)。毛細(xì)血管對(duì)氧的通透性、氧耗、最初血流量等細(xì)小變化都能影響氧的供應(yīng)和需求的平衡，在疾病狀態(tài)下，平衡一旦被打破，即表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)缺血、缺氧。

長(zhǎng)期以來(lái)，慢性缺氧始終被認(rèn)為是導(dǎo)致各類原因引起CKD進(jìn)展的主要因素，缺氧影響細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞功能、紅細(xì)胞和血管生成、炎癥細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)[3]。TNF-α是一種強(qiáng)效的促炎癥細(xì)胞因子，是參與炎癥性組織損傷的重要介質(zhì)。TNF-α在腎小管間質(zhì)中表達(dá)，主要存在于近端腎小管上皮細(xì)胞，通過(guò)減少腎臟血流、腎小球?yàn)V過(guò)率，改變毛細(xì)血管壁的屏障功能，形成毛細(xì)血管血栓，影響血細(xì)胞結(jié)構(gòu)等途徑參與腎臟損傷。在腎組織炎癥反應(yīng)中，TNF-α趨化單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞向炎癥部位聚集，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性，調(diào)節(jié)其他炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6等釋放[7]。TNF-α誘導(dǎo)腎小管不同形式的炎癥基因的激活，促進(jìn)腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致小管間質(zhì)損害，最終引起腎功能不可逆性損傷的RIF[8]。研究顯示，TNF-α與腎功能之間存在顯著負(fù)相關(guān)[9]。抑制腎小管間質(zhì)的炎癥反應(yīng)，可以減少其結(jié)構(gòu)和功能的破壞[10]，延緩RIF進(jìn)展[11]。

根據(jù)CRF臨床表現(xiàn)，其屬中醫(yī)學(xué)“水腫”“關(guān)格”“虛勞”“癃閉”等范疇。其形成機(jī)制復(fù)雜，或因正虛，或因邪實(shí)，或因失治誤治，每呈虛實(shí)并見，辨證除本虛外，還應(yīng)注意邪實(shí)?？倢俦咎摌?biāo)實(shí)、正虛邪實(shí)。本虛主要是脾、腎兩虛，可因病情進(jìn)展影響到心、肺兩臟，及氣、血、精、陰、陽(yáng)的虧損。邪實(shí)主要為外邪、痰濕、濕熱、瘀血、熱毒等。其中，痰濕、濁毒、瘀血既是臟腑功能失調(diào)的病理產(chǎn)物，又進(jìn)一步加重臟腑虛損。腎衰Ⅱ號(hào)方中黨參健脾益氣養(yǎng)血，淫羊藿溫腎壯陽(yáng)，共為君藥，培本固源，補(bǔ)腎與健脾協(xié)同并進(jìn)，起到補(bǔ)火生土，健脾轉(zhuǎn)相滋腎的作用。臣以四味活血藥物：丹參活血養(yǎng)血，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，川芎行氣活血祛風(fēng)，桃仁活血祛瘀，補(bǔ)瀉兼施，使補(bǔ)而不留邪，瀉而不傷正，氣行則血行，氣血同調(diào)。大黃瀉下攻積、清熱解毒、活血祛瘀，紫蘇葉行氣寬中、理氣和營(yíng)、“散血脈之邪”（《本經(jīng)逢原》），共為佐藥，使體內(nèi)毒素從大便而解。全方共奏健脾補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)血、降濁化瘀之功。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腎衰Ⅱ號(hào)方可改善CRF大鼠腎功能，糾正貧血，減輕殘腎組織的病理改變，下調(diào)殘腎組織TNF-α的蛋白表達(dá)，其腎臟保護(hù)作用機(jī)制可能與改善腎臟血流量和缺氧環(huán)境，從而調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] MANOTHAM K， TANAKA T， MATSUMOTO M， et al. Evidence of tubular hypoxia in the early phase in the remnant kidney model[J]. J Am Soc Nephrol，2004，15（5）：1277-1288.

[2] ISEKI K， IKEMIYA Y， ISEKI C， et al. Haematocrit and the risk of developing end-stage renal disease[J]. Nephrol Dial Transplant， 2003，18：899-905.

[3] HAASE V H. Hypoxia-inducible factors in the kidney[J]. American Journal of Physiology-Renal Physiology，2006，291（2）：F271-F281.

[4] 楊婧，王琛，邵命海，等.腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)5/6腎切除大鼠腎血流量和腎內(nèi)氧耗影響及其作用機(jī)制[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2011，12（7）：578-581.

[5] EPSTEIN F H， BREZIS M， ROSEN S. Hypoxia of the renal medulla-its implications for disease[J]. The New England Journal of Medicine， 1995，332（10）：647-655.

[6] ZHANG W， EDWARDS A. Oxygen transport across vasa recta in the renal medulla[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2002，283：H1042-H1055.

[7] 吳金珠.TNF-α在慢性腎小球腎炎中的作用研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，12（4）：144-145.

[8] 杜義斌，吳曉，吳鋒，等.燈盞花膠囊對(duì)慢性腎功能衰竭大鼠腎組織炎癥因子的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（12）：63-65.

[9] PRUIJM M， PONTE B， VOLLENWEIDER P， et al. Not all inflammatory markers are linked to kidney function：results from a population- based study[J]. American Journal of Nephrology，2012，35（3）：288- 294.

[10] LAMEIRE N， KRUSE V， ROTTEY S. Nephrotoxicity of anticancer drugs-an underestimated problem？[J]. Acta Clinica Belgica，2011， 66（5）：337-345.

[11] THERRIEN F J， AGHARAZII M， LEBEL M， et al. Neutralization of tumor necrosis factor-alpha reduces renal fibrosis and hypertension in rats with renal failure[J]. American Journal of Nephrology，2012，36（2）：151-161.

（收稿日期：2016-07-11）

（修回日期：2016-07-31；編輯：華強(qiáng)）