李嘉文， 繩秀珍， 唐小千， 邢 婧， 戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學水產(chǎn)學院免疫與病害學實驗室，山東 青島 266003)

運用抗原芯片原理與競爭免疫層析技術(shù)制備魚類病原性溶藻弧菌快速檢測試紙?

李嘉文， 繩秀珍??， 唐小千， 邢 婧， 戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學水產(chǎn)學院免疫與病害學實驗室，山東 青島 266003)

本文將抗原芯片法原理與競爭免疫層析技術(shù)相結(jié)合，利用兔抗溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)多克隆抗體標記20 nm膠體金顆粒后制得金標墊，將溶藻弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌破碎蛋白4種抗原組分以及羊抗兔IgG噴涂在硝酸纖維素膜上，分別作為4條檢測線和1條質(zhì)控線，制備溶藻弧菌膠體金免疫層析快速檢測試紙，并確定檢測結(jié)果的判定方法。使用該試紙同時對溶藻弧菌、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、鰻弧菌(V.anguillarum)和魚腸弧菌(V.ichthyoenteri)進行檢測，檢查結(jié)果顯示其能夠準確區(qū)分溶藻弧菌感染與其他弧菌的交叉反應(yīng)，排除了交叉反應(yīng)對結(jié)果判定的干擾。溶藻弧菌快速檢測試紙的最低檢測限為5×105cfu·mL-1，檢測時間為10～15 min。該試紙具有操作簡便、快速、準確、特異性強的優(yōu)點，適用于普通人員在養(yǎng)殖現(xiàn)場對魚類溶藻弧菌的快速檢測。

溶藻弧菌； 膠體金； 競爭免疫層析法； 特異性抗原； 免疫交叉反應(yīng)； 抗原芯片原理； 快速檢測試紙

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)屬革蘭氏陰性嗜鹽嗜溫菌，廣泛分布在世界各地的海水和河口處，其數(shù)量居海水類弧菌之首。溶藻弧菌是中國海洋中優(yōu)勢菌群之一[1]，存在于多種海洋動物體內(nèi)，是魚、貝、蝦蟹等海水養(yǎng)殖動物的條件致病菌，可通過其受損表皮、黏膜、口引發(fā)感染[2]，多在夏季發(fā)病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[3]。另外，溶藻弧菌也可導(dǎo)致人類患多種疾病，包括感染傷口潰瘍、中耳炎、外耳炎、敗血癥等[4]，近年來的研究證實該菌與副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)一樣，是沿海地區(qū)導(dǎo)致腹瀉病和食物中毒的常見病原菌[5]。有效快速的檢測診斷是預(yù)防和控制該病原菌引起的疾病以及食源性中毒的關(guān)鍵。

目前溶藻弧菌常用的檢測方法有免疫酶聯(lián)反應(yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、實時定量PCR等[6]，但這些技術(shù)在實用性上皆有一定的局限，耗時長，操作復(fù)雜，需要專業(yè)設(shè)備和技術(shù)人員，不適用于普通養(yǎng)殖人員對溶藻弧菌的現(xiàn)場檢測。膠體金免疫層析試紙具有易于攜帶、操作簡便快捷、結(jié)果肉眼可見、不需要專業(yè)人員和設(shè)備、經(jīng)濟實用等優(yōu)點，是一種十分有發(fā)展前景的即時、現(xiàn)場快速檢測技術(shù)，近年來在生物醫(yī)學領(lǐng)域特別是醫(yī)學檢驗中得到廣泛應(yīng)用[7]。但是，利用免疫學技術(shù)進行病原菌檢測時，病原菌之間存在的交叉免疫反應(yīng)往往會對檢測結(jié)果的準確判定造成干擾，因此，排除交叉反應(yīng)對結(jié)果判定的干擾是免疫學檢測技術(shù)需要解決的關(guān)鍵問題。

本文運用競爭免疫層析技術(shù)與抗原芯片法原理相結(jié)合[8]，利用溶藻弧菌制備兔多克隆抗體并標記膠體金，將提取的溶藻弧菌四種特異性抗原蛋白作為檢測線，研制出溶藻弧菌的膠體金快速檢測試紙，能夠準確區(qū)分溶藻弧菌感染與其他菌的交叉反應(yīng)，避免了交叉反應(yīng)對結(jié)果判定的干擾。

1 材料與方法

1.1 菌株與實驗動物

溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、魚腸弧菌(V.ichthyoenteri)和鰻弧菌(V.anguillarum)由本實驗室分離保存。

純種新西蘭大白兔，6周齡，雌性，購自青島市藥品檢驗所。

1.2 兔抗溶藻弧菌多克隆抗體的制備及效價測定

將溶藻弧菌擴大培養(yǎng)，福爾馬林滅活后，去除福爾馬林菌體調(diào)整濃度至1×108cfu·mL-1，分4次免疫純種新西蘭大白兔。第一次按1∶1比例將溶藻弧菌混入弗氏完全佐劑，背部6點皮下注射免疫，每點0.2 mL；間隔一周后加強免疫，將溶藻弧菌按1∶1比例與弗氏不完全佐劑混勻，背部皮下注射免疫，每點0.2 mL，間隔2周后重復(fù)一次；最后一次于耳緣靜脈注射0.2 mL，1周后取血，分離得到血清，辛酸-硫酸銨法純化得到兔抗溶藻弧菌多克隆抗體。

運用間接免疫酶聯(lián)吸附實驗(ELISA)測定兔抗溶藻弧菌多克隆抗體效價[9]。用0.01 mol·mL-1磷酸鹽緩沖液(PBS)將溶藻弧菌濃度調(diào)整為5×107cfu·mL-1，在96孔酶標板(Costar，Corning，USA)中每孔加入100 μL溶藻弧菌菌液包被過夜，次日棄去板內(nèi)液體，用含0.05% Tween-20的0.01 mol·mL-1PBS(PBST，pH=7.4)洗滌酶標板，每孔加入200 μL的3% BSA，37 ℃封閉1 h；洗滌酶標板，依次加入100 μL梯度稀釋的兔抗溶藻弧菌抗體(見表1)，設(shè)置3個平行，陰性對照加100 μL 0.01 mol·mL-1PBS，37 ℃孵育1 h；用PBST洗滌酶標板，每孔加入100 μL AP標記羊抗兔IgG抗體37 ℃孵育1 h；洗滌酶標板，每孔加入200 μL底物顯色液(含1 mg·mL-1pNPP-Na，0.5 mol·mL-1氯化鎂以及體積比為10%的二乙醇胺)避光發(fā)色5 min，用酶標儀測定OD405值。

表1 兔抗溶藻弧菌抗體效價的測定

1.3 溶藻弧菌特異性抗原的制備

1.3.1 溶藻弧菌外膜蛋白的提取 參照熊焰等[10]的方法，將溶藻弧菌擴大培養(yǎng)，離心后PBS洗滌、重懸至原體積1/25，加入少量10%蔗糖，混勻后于-20 ℃下作用15 min。室溫下加入等體積0.4% Triton-X100，作用一段時間后離心取上清，加入2.5倍體積冰乙醇，-20 ℃過夜。離心取沉淀，洗滌重懸后，加入等體積碘化鉀溶液，37 ℃作用1 h。離心取上清，加入2.5倍體積冰乙醇-20 ℃過夜。離心取沉淀，重懸后透析、凍干，PBS調(diào)至合適濃度，于-80 ℃凍存。

1.3.2 溶藻弧菌鞭毛蛋白的提取 參照張曉佩等[11]的方法，將溶藻弧菌擴大培養(yǎng)，離心后用PBS洗滌，重懸至原體積1/20，用1.0 mol·mL-1HCl將所收集菌液的pH調(diào)整至2.0，室溫下不斷攪拌30 min。4 ℃條件下1 500×g離心30 min，取上清。然后，4 ℃下533 000g離心上清液1 h，取上清。上清液用1 mol·mL-1NaOH調(diào)整pH至7.2，并緩慢加入硫酸銨至終濃度為2.67 mol·mL-1，冰浴攪拌30 min，將混合液4 ℃放置過夜。次日，4 ℃下533 000g離心15 min，棄上清，取沉淀，并溶于一定量0.01 mol·mL-1PBS中，透析24 h。凍干后，溶于PBS中調(diào)至合適濃度，-80 ℃保存。

1.3.3 溶藻弧菌胞外產(chǎn)物的提取 參照Inamura等[12]的方法，將溶藻弧菌接種于營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h。取1 mL的液體培養(yǎng)物涂布在預(yù)先放置了一層玻璃紙的營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。用6 mL 0.01 mol·mL-1PBS洗下菌體，收集菌懸液，在4 ℃下7 000g離心30 min，上清經(jīng)0.22 pm微孔濾膜過濾后，加入終濃度為2.0 mol·mL-1硫酸銨，室溫下攪拌1 h，4 ℃沉降過夜。次日，4 ℃下10 000g離心1 h，取沉淀并將其溶于0.01 mol·mL-1PBS中，于超純水中透析24 h，然后用PBS調(diào)至合適濃度，于-80 ℃凍存。

1.3.4 溶藻弧菌全菌破碎蛋白的制備 將溶藻弧菌接種于營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基，37 ℃擴大培養(yǎng)24 h。將菌液調(diào)整至1×108cfu·mL-1，超聲波破碎機破碎(Sonics & Materials；振幅39%；pulse on，3；pulse off，3 s)至液體澄清，即為溶藻弧菌破碎蛋白，用0.01 mol·mL-1PBS調(diào)整至適合濃度，凍存于-80 ℃。

1.4 膠體金、金標抗體及金標墊的制備

1.4.1 膠體金的制備及電鏡觀察 取0.01%氯金酸溶液100 mL，高檔火沸騰2 min，迅速一次性加入少量1%檸檬酸三鈉溶液，放入微波爐中用中檔火繼續(xù)加熱3 min后，取出冷卻至室溫并補充損失水分，制得顆粒大小為20 nm左右的膠體金。用0.1 mol·mL-1碳酸鉀溶液和0.1 mol·mL-1鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.4后，密封保存于4 ℃。

將制得的膠體金滴在銅網(wǎng)上，空氣中自然干燥15 min，透射電鏡觀察膠體金的形態(tài)。

1.4.2 最適合標記pH與蛋白標記濃度的確定 為確定膠體金的最適合標記pH，用0.1 mol·mL-1碳酸鉀溶液和0.1 mol·mL-1鹽酸分別將制得的20 nm膠體金溶液調(diào)至不同pH梯度，然后各取1.5 mL膠體金，分別加入10 mg·mL-1兔抗溶藻弧菌多抗100 μL，迅速混勻，在室溫下靜置30 min后，加入10 μL 5% NaCl，混勻后室溫靜置2 h。分光光度計測每個pH梯度在520 nm處的OD值，并根據(jù)數(shù)值以O(shè)D值為縱軸、pH值為橫軸制作曲線圖，取曲線中OD值達到峰值后最大處對應(yīng)的pH即為最合適標記pH。

為了測定最適合的蛋白標記濃度，用0.1 mol·mL-1碳酸鉀溶液和0.1 mol·mL-1鹽酸將制得的20 nm膠體金調(diào)至最適合標記pH。然后將膠體金設(shè)置10個濃度梯度，每個濃度取出1 mL膠體金，分別加入10 μL不同濃度的兔抗溶藻弧菌多抗，迅速混勻，在室溫下靜置30 min后加入5% NaCl 10 μL，混勻后室溫靜置2 h。分光光度計測定每個濃度梯度在520 nm處的OD值，并以O(shè)D值為縱軸、蛋白濃度為橫軸制作曲線圖，取曲線中OD值最大處對應(yīng)的兔多抗用量為穩(wěn)定膠體金的最低蛋白量，在此基礎(chǔ)上加20%的蛋白標記量即是最適合的蛋白標記濃度。

1.4.3 金標抗體與金標墊的制備 將膠體金調(diào)至最合適標記的pH，按照最合適標記濃度加入兔抗溶藻弧菌多抗，連續(xù)攪拌20 min，室溫靜置10 min。加入BSA使終濃度為1%，連續(xù)攪拌15 min，室溫下靜置10 min，經(jīng)1 200g于4℃離心15 min，棄沉淀取上清液。上清經(jīng)13 500g4 ℃離心30 min，棄上清取沉淀，用金標多抗洗滌液(含1%BSA的0.01 mol/L PBS，pH=8.4)洗滌，離心，吸去上清液，將沉淀用金標多抗保存液(0.01 mol·L-1PBS中含3%蔗糖，1%BSA，0.2%Tween-20和0.02%NaN3，pH=8.4)重懸至原體積1/10，即為金標兔抗溶藻弧菌多抗。將金標溶藻弧菌多抗噴涂于玻璃纖維上成為金標墊，冷凍干燥，避光密封保存于4 ℃。

1.5 間接ELISA法確定溶藻弧菌4種抗原蛋白特異性與劃線濃度

將溶藻弧菌4種抗原蛋白包被96孔酶標板(100 μL/孔)，每個蛋白設(shè)3個平行，以無菌PBS作為陰性對照，4 ℃過夜。次日用PBST洗滌3次，每孔加入200 μL 3%的牛血清白蛋白(PBS配制)，37 ℃封閉1 h，PBST洗滌3次，再加入100 μL兔抗溶藻弧菌多抗(1∶2 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次。每孔加入100 μL堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG(1∶8 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次；加入200 μL底物顯色液，暗處反應(yīng)10～20 min，然后加入50 μL 2 mol·mL-1NaOH溶液終止顯色反應(yīng)，檢測405 nm處的OD值。

以包被PBS為陰性對照，測定波長為405 nm時各孔的光吸收值，計算各實驗孔與陰性對照光吸收值之比(P/N)，當P/N≥2.1時為陽性，計算4種抗原蛋白間的P/N的比。根據(jù)蛋白包被濃度和P/N比值確定劃線濃度。

1.6 溶藻弧菌膠體金快速檢測試紙的結(jié)構(gòu)設(shè)計與制備

將抗原芯片法原理和競爭免疫層析技術(shù)相結(jié)合進行溶藻弧菌膠體金免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)設(shè)計。利用抗原芯片法原理，將病原菌的多種抗原組分排列在一起同時與該病原菌的抗體進行反應(yīng)，則所有抗原皆與抗體發(fā)生反應(yīng)，而其他菌只有個別共同抗原與抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，由此，將溶藻弧菌的多種特異性抗原排列在一起成為多條檢測線，用金標溶藻弧菌抗體制備金標墊，利用競爭免疫層析技術(shù)進行檢測，則待檢樣品中的溶藻弧菌與檢測線上的抗原競爭結(jié)合金標溶藻弧菌抗體，使檢測線上的抗原無法與金標溶藻弧菌抗體反應(yīng)而全部不顯色，反之，待檢樣品中不含有溶藻弧菌時，金標溶藻弧菌抗體則與檢測線上的抗原結(jié)合，檢測線全部顯色；當待檢樣品中有其他病原菌時，只有其共同抗原與檢測線上的溶藻弧菌抗原競爭結(jié)合金標抗體，則部分檢測線不顯色。

根據(jù)上述設(shè)計原理，用0.01·mol·mL-1PBS將溶藻弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌破碎蛋白的濃度分別調(diào)至1.5中所確定的劃線濃度，用噴膜儀將四種蛋白噴涂于硝酸纖維素膜上分別作為檢測線T1、T2、T3和T4，4條檢測線之間各相距1.5 mm。用0.01 mol·mL-1PBS調(diào)整羊抗兔IgG濃度為0.5 mg·mL-1，將其噴涂于硝酸纖維膜上作為質(zhì)控線(C線)，質(zhì)控線與檢測線T4相距5 mm，質(zhì)控線靠近吸水墊，檢測線T1靠近樣品墊(見圖1)。

在PVC底板上依次粘貼上硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊和吸水墊，組裝成試紙條整板。其中硝酸纖維膜上端邊緣重疊于吸水墊邊緣之下，而硝酸纖維素膜下端邊緣則在金標墊上端邊緣之下，樣品墊的上端邊緣重疊在金標墊的下端邊緣之上(見圖1)。將組裝好的試紙條整版用切條機裁成3.75 mm寬的試紙條，裝入塑料卡盒中，密封保存于有干燥劑的鋁箔小袋中。

(1.樣品墊；2.金標墊；3.硝酸纖維素膜(NC膜)；4.吸水墊；5.PVC底板；6～9.檢測線T1～T4(T線)；10.質(zhì)控線(C線)。1. Sample pad；2. Glass fiber containing anti-V.alginolyticuspolyclonal antibody；3.Nitrocellulose membrane；4. Absorption pad；5. PVC board；6～9. Test Lines 1～4 (T lines)；10. Control Line (C line).)

圖1 溶藻弧菌快速檢測試紙結(jié)構(gòu)模式圖

Fig.1 Structure of colloidal gold strip for rapid detection ofV.alginolyticus

1.7 特異性檢測

使用制備的溶藻弧菌快速檢測試紙檢測濃度為1×107cfu·mL-1的純化鰻弧菌、魚腸弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌和溶藻弧菌，PBS作為陰性對照，以確定所制備試紙的檢測特異性。

1.8 檢測限測定

將純化的溶藻弧菌設(shè)置5×107、5×106、5×105、5×104cfu·mL-1共4個梯度，使用制備的檢測試紙進行檢測。當某個濃度時檢測試紙的檢測線T1-T4全部或部分顯色，則該濃度的高一級濃度確定為檢測試紙的最低檢測限。

1.9 牙鲆組織中溶藻弧菌的檢測

使用5×107cfu·mL-1的溶藻弧菌注射感染牙鲆，牙鲆逐漸表現(xiàn)出體色變黑、腹部腫脹、有腹水、體表潰瘍以及肝、脾、腎充血等癥狀。取牙鲆腹水及體表皮膚潰瘍組織，每1g加5 mL無菌PBS或生理鹽水(0.9% NaCl溶液)研磨3～5 min，3 000g離心獲得上清樣品液。平放試紙檢測卡，向樣品孔中滴加檢測樣品液100 μL，等待10～15 min，肉眼觀察檢測結(jié)果。使用健康牙鲆組織作為陰性對照。

以ELISA法作為對照檢測方法。將相同的樣品液和健康牙鲆組織液各100 μL添加至96孔酶標板4 ℃包被過夜，以1.5中所述ELISA操作步驟測定樣品液與PBS在405 nm處的OD值，P/N值≥2.1時為陽性。

2 結(jié)果

2.1 兔抗溶藻弧菌多抗的效價

雙抗夾心ELISA方法測得兔抗溶藻弧菌多抗的效價為1×105(見表1)。

2.2 膠體金的質(zhì)量鑒定

經(jīng)過煮沸、檸檬酸鈉還原制得的膠體金溶液呈現(xiàn)鮮艷的酒紅色，澄清、無沉淀。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，膠體金顆粒分散均勻，膠體金顆粒平均直徑大小為20 nm左右(見圖2)。

2.3 膠體金最適合標記條件

OD值曲線法測定膠體金標記兔多抗最佳pH的結(jié)果顯示，當pH< 8時，膠體金OD值呈上升趨勢，當pH>8時，膠體金OD值呈下降趨勢，即pH=8是曲線中OD值最高點，是膠體金標記兔多抗的最佳pH(見圖3)。

圖2 膠體金電子顯微鏡圖

圖3 OD值曲線法確定膠體金標記兔多抗的最佳pH

OD值法測定膠體金標記兔多抗的最佳蛋白量結(jié)果表明，當?shù)鞍诐舛?2 μg·mL-1時，膠體金OD值呈上升趨勢，當?shù)鞍诐舛?2 μg·mL-1時，膠體金OD值呈下降趨勢并漸趨于平緩，即穩(wěn)定膠體金的最低蛋白量為2 μg·mL-1，此為膠體金標記兔多抗的最低標記濃度，在此基礎(chǔ)上加20%即為最佳標記濃度，即2.4 μg·mL-1(見圖4)。

2.4 溶藻弧菌4種抗原蛋白的劃線濃度

計算溶藻弧菌4種蛋白的OD405值與PBS OD405值的比值得到P/N值，P/N≥2.1時為陽性，結(jié)果顯示，4種抗原蛋白皆與兔抗溶藻弧菌抗體特異性結(jié)合(見表2)。根據(jù)4種抗原蛋白的濃度與P/N值，確定檢測線T1、T2、T3和T4線上4種抗原蛋白的劃線濃度分別為外膜蛋白0.6mg·mL-1、鞭毛蛋白0.2 mg·mL-1、胞外產(chǎn)物1.5 mg·mL-1和全菌破碎蛋白0.3 mg·mL-1。

圖4 OD值曲線法確定膠體金標記兔多抗的最佳標記濃度

2.5 試紙的特異性

分別以溶藻弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、鞭毛蛋白和全菌破碎蛋白作為4條檢測線制備溶藻弧菌快速檢測試紙。根據(jù)抗原芯片法和競爭免疫層析法原理，確定對試紙檢測結(jié)果的判定方法如下：在質(zhì)控線(C線)顯色前提下，檢測線T1、T2、T3、T4全部不顯色，表明感染了溶藻弧菌；檢測線T1、T2、T3、T4皆顯色，表明未感染溶藻弧菌；T4線顯現(xiàn)紅色，T1、T2、T3中個別條帶不顯色，表明未感染溶藻弧菌，但感染了與溶藻弧菌具有共同抗原的其他病原菌；檢測線T1、T2、T3、T4和質(zhì)控線都不顯色，表明該試紙失效或本次操作出現(xiàn)問題(見圖5A)。

表2 ELISA法確定溶藻弧菌4種抗原蛋白的劃線濃度

Note： ①Detection target；②Outer membrane protein；③Flagellum protein；④Extracellular products；⑤Whole-cell bacteria protein；⑥PBS；⑦Dispensed concentration

(A.Ⅰ:陽性結(jié)果；Ⅱ：陰性結(jié)果；Ⅲ：交叉反應(yīng)；Ⅳ：試紙失效。B.Ⅰ:鰻弧菌檢測結(jié)果；Ⅱ：魚腸弧菌檢測結(jié)果；Ⅲ：副溶血弧菌檢測結(jié)果；Ⅳ：哈維氏弧菌檢測結(jié)果；Ⅴ：PBS陰性對照；Ⅵ：溶藻弧菌檢測陽性結(jié)果。A.Ⅰ:Positive results；Ⅱ：negative results；Ⅲ：cross reaction；Ⅳ：invalid results. B.Ⅰ:V.anguillarum；Ⅱ：V.ichthyoenteri；Ⅲ：V.parahaemolyticus；Ⅳ：V.harveyi；Ⅴ：PBS；Ⅵ：V.alginolyticus.)

圖5 溶藻弧菌快速檢測試紙檢測結(jié)果示意圖(A)及特異性檢測(B)

Fig.5 Diagram and Specificity of colloidal gold test strip for rapid detection ofV.alginolyticus

使用制備的溶藻弧菌快速檢測試紙檢測鰻弧菌、魚腸弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌和溶藻弧菌，結(jié)果顯示，檢測鰻弧菌、魚腸弧菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌時，質(zhì)控線和T4檢測線顯色，鰻弧菌、魚腸弧菌的T3線顏色明顯變淺(見圖5B，Ⅰ、Ⅱ)，副溶血弧菌和哈維氏弧菌的T3線不顯色(見圖5B，Ⅲ、Ⅳ)，表明這些菌與溶藻弧菌位于T3線上的抗原成分存在交叉反應(yīng)；PBS組的C線和4條T線皆顯色(見圖5B，Ⅴ)，表明結(jié)果為陰性；溶藻弧菌組僅C線顯色，4條檢測線皆不顯色，即檢測結(jié)果為陽性(見圖5B，Ⅵ)。以上結(jié)果表明該試紙具有良好的特異性，且能夠準確區(qū)分溶藻弧菌感染與其他菌的交叉反應(yīng)。

2.6 試紙的檢測限

將溶藻弧菌設(shè)置5×107、5×106、5×105、5×104cfu·mL-14個梯度，使用制備的溶藻弧菌快速檢測試紙進行檢測，結(jié)果顯示在濃度為5×107、5×106、5×105cfu·mL-1時，只有質(zhì)控線顯色，T1-T4線皆不顯色，而濃度為5×104cfu·mL-1時，T1-T4線開始出現(xiàn)顯色，表明該試紙的檢測限為5×105cfu·mL-1(見圖6)，低于該濃度則無法檢測到細菌。

圖6 試紙的靈敏度

2.7 牙鲆中溶藻弧菌的檢測

對人工感染溶藻弧菌的牙鲆樣品進行檢測，結(jié)果顯示，C線顯現(xiàn)紅色，牙鲆腹水和皮膚潰瘍組織皆不使T1、T2、T3、T4線顯色，表明含有溶藻弧菌；健康牙鲆組織的檢測結(jié)果顯示，C線和T1、T2、T3、T4線皆顯色(見圖7)。

(Ⅰ：健康牙鲆組織樣品檢測結(jié)果；Ⅱ：患病牙鲆腹水檢測結(jié)果；Ⅲ：患病牙鲆潰瘍組織檢測結(jié)果。Ⅰ.Negativecontrol using the tissues of healthy flounder；Ⅱ. Positive results forV.alginolyticusinthe ascites of flounder；Ⅲ. Positive results forV.alginolyticusinskinwith ulcer of flounder.)

圖7 牙鲆中溶藻弧菌的檢測結(jié)果

Fig.7 Detection results ofV.alginolyticusindiseased

flounderParalichthysolivaceus

ELISA檢測結(jié)果顯示，牙鲆腹水和潰瘍組織樣品的OD值與健康牙鲆組織陰性對照組OD值的比值即P/N值皆大于2.1，表明為溶藻弧菌陽性(見圖8)。

圖8 ELISA法檢測牙鲆樣品中溶藻弧菌

3 討論

近年來，由于水產(chǎn)養(yǎng)殖水域生態(tài)變化，弧菌已成為海水養(yǎng)殖動物的主要病原菌之一，已見報道的海水養(yǎng)殖動物病原弧菌有20多種，且常發(fā)生多種(血清型或亞種)弧菌的混合感染，其中溶藻弧菌與副溶血弧菌、哈維氏弧菌是海洋生物尤其是海水魚類弧菌病的主要致病菌[13]。細菌是多種抗原成分組成的復(fù)合體，其抗原包括菌體抗原、鞭毛抗原、莢膜抗原和菌毛抗原等，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體，因此，可利用抗原-抗體特異性反應(yīng)的原理以達到確診病原的目的。但是，由于分類地位相近，弧菌間具有的共同抗原性蛋白會導(dǎo)致不同弧菌之間存在交叉免疫反應(yīng)性[14-15]，從而對檢測結(jié)果的準確判定造成干擾。所以，準確判定某種病原菌感染還是其他菌的交叉反應(yīng)是免疫學技術(shù)檢測病原時需要解決的關(guān)鍵問題。

本文將抗原芯片法原理與競爭免疫層析技術(shù)相結(jié)合研制了溶藻弧菌快速檢測試紙。利用免疫芯片法原理，將病原菌的多種抗原組分排列在一起與待檢樣品同時進行反應(yīng)，則該菌的所有抗原成分皆與抗體發(fā)生反應(yīng)，而其他菌只有個別抗原成分與抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，所以當所有抗原成分全部為陽性反應(yīng)時即判定為檢測結(jié)果陽性，部分抗原為陽性反應(yīng)時則為交叉反應(yīng)。由此，將溶藻弧菌四種特異性抗原組分作為試紙的4條檢測線，羊抗兔IgG作為質(zhì)控線，利用競爭法免疫層析技術(shù)制備溶藻弧菌快速檢測試紙，在檢測水產(chǎn)動物待測樣品時，若待測樣品中含有溶藻弧菌，待測樣品液擴散至金標墊時，金標溶藻弧菌兔多抗與溶藻弧菌結(jié)合，形成金標多抗-菌復(fù)合物，并封閉金標多抗上與溶藻弧菌特異性抗原結(jié)合的位點，阻止金標多抗與硝酸纖維素膜上檢測線T1、T2、T3和T4線上的特異性抗原蛋白結(jié)合，則T1-T4線皆無紅色條帶出現(xiàn)，結(jié)果判別為陽性；當復(fù)合物擴散至質(zhì)控線(C線)處，被該處的羊抗兔IgG所俘獲，聚集而形成肉眼可見的條帶。相反，若待測樣品中不含有溶藻弧菌，待測樣品液擴散至金標墊時未形成金標多抗-菌復(fù)合物，金標多抗與T1、T2、T3和T4線上的4種抗原反應(yīng)而形成肉眼可見的條帶，結(jié)果為陰性；如果待測樣品中含有其他與溶藻弧菌具有相同抗原成分的病原菌，金標多抗與共同抗原結(jié)合形成少量的金標多抗-菌復(fù)合物，則含共同抗原的檢測線顏色會變淺或者不顯色，而T4線上的全菌蛋白因含有除共同抗原以外的其他抗原蛋白則一定出現(xiàn)紅色條帶。因此，只要出現(xiàn)T4線顯色、T1-T3線中1條或幾條線不顯色的情況則檢測結(jié)果為其他菌的交叉反應(yīng)，由此，建立了該試紙檢測結(jié)果的判定方法。本文利用制備的溶藻弧菌快速檢測試紙，對鰻弧菌、魚腸弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌和溶藻弧菌同時進行檢測，發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌使T1-T4線皆不顯色，其他4種弧菌皆使T4、T2、T1線顯色，而鰻弧菌和魚腸弧菌使T3線顏色明顯變淺，副溶血弧菌和哈維氏弧菌的T3線不顯色，表明這4種菌與溶藻弧菌的胞外產(chǎn)物中含有共同抗原成分，與溶藻弧菌試紙發(fā)生了交叉反應(yīng)，這些結(jié)果說明所制備的溶藻弧菌快速檢測試紙能夠準確檢測溶藻弧菌，且能夠排除其他弧菌的交叉反應(yīng)對結(jié)果判定的影響，具有很好的特異性。對人工感染溶藻弧菌的牙鲆樣品的檢測結(jié)果也證明該試紙可以實際應(yīng)用于魚類組織中溶藻弧菌的準確檢測。

目前膠體金免疫層析試紙的靈敏度在105～106cfu·mL-1之間[16-18]，本檢測試紙的靈敏度為5×105cfu·mL-1，達到同類檢測試紙的水平。但是，該試紙與實驗室常用的PCR技術(shù)相比靈敏度還存在差距，病原菌濃度小于檢測限5×105cfu·mL-1時，檢測結(jié)果顯示為陰性，使其應(yīng)用受到一定的限制，即病原菌感染量較低時不能及時檢測到病原的存在，不能用于感染早期的病原檢測。鑒于該試紙具有較好的準確性和特異性，而水產(chǎn)動物感染溶藻弧菌患病時，體內(nèi)病原菌的濃度一般高于5×105cfu·mL-1[19-20]，因此該試紙可用于患病水產(chǎn)動物中溶藻弧菌的快速診斷，但還有待于通過優(yōu)化抗體及其他實驗條件參數(shù)提高其靈敏度。

本文制備的溶藻弧菌快速檢測試紙具有操作簡便、反應(yīng)速度快、特異性強、準確性高、無需專業(yè)人員和專用儀器、檢測樣品處理簡單等優(yōu)點，適用于普通人員在養(yǎng)殖現(xiàn)場對魚類溶藻弧菌的快速、準確檢測，具有較廣闊的應(yīng)用前景。

[1] 蔣學兵, 馬聰, 郭建巍, 等. 中國海域海洋細菌的分離與鑒定方法研究[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2009(7)： 898-900. JIANG Xue-bing, MA Cong, GUO Jian-wei, et al. Studies on the isolation and identification of marine bacteria in near sea territory of China [J]. Medical Journal of Chinese People’s Liberation Army, 2009(7)： 898-900.

[2] Jayaprakash N S, Pai S S, Philip R, et al. Isolation of a pathogenic strain ofVibrioalginolyticusfrom necrotic larvae ofMacrobrachiumrosenbergii(de Man)[J]. Journal of Fish Diseases, 2006, 29(3)： 187-191.

[3] 陳強, 鄢慶枇, 鄒文政, 等. 環(huán)境因子對溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)粘附大黃魚(Pseudosciaenacrocea)表皮粘液影響的研究[J]. 海洋與湖沼, 2007, 38(4): 361-366. CHEN Qiang,YAN Qing-pi, ZHOU Wen-zheng,et al., Influence of antagonistic bacteria on adhesion ofpathogenicVibrioalginolyticusto skin mucus ofPseudosciaenacrocea[J]. Oceanologia EtLimnologia Sinica, 2007, 38(4): 361-366.

[4] Schmidt U, Chmel H, Cobbs C.Vibrioalginolyticusinfections in humans [J]. Journal of Clinical Microbiology, 1979, 10(5): 666-668.

[5] 嚴紀文, 馬聰, 朱海明, 等. 2003-2005年廣東省水產(chǎn)品中副溶血弧菌的主動檢測及其基因指紋圖譜庫的建立[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2006, 16(4)： 387-391. YAN Ji-wen, MA Cong, ZHU Hai-ming, et al. Estabishment of fingerprinting database and surveillance on marine products forVibrioparahaemolyticusin Guangdong from 2003 to 2005 [J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2006, 16(4): 387-391.

[6] 劉驍, 楊勁, 張春輝. 水產(chǎn)品中溶藻弧菌檢測技術(shù)發(fā)展研究[J]. 生物技術(shù)世界, 2013(4)： 45-46. LIU Xiao, YANG Jing, ZHANG Chun-hui. Development of detection technology ofVibrioalginolyticusin aquatic products[J]. Biotech World, 2013(4): 45-46.

[7] 方瑩. 免疫膠體金技術(shù)及其在微生物檢測中的應(yīng)用[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2006, 16(11): 1399-1401. FANG Ying. Application of colloidal gold technology in microbiological tests[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2006, 16(11): 1399-1401.

[8] 李永芹.養(yǎng)殖魚類病原菌檢測芯片技術(shù)的建立[D]. 青島： 中國海洋大學, 2010. LI Yong-qin. Development of Microarray for Detection of Fish Pathogenic Bacteria[D]. Qingdao： Ocean University of China, 2010.

[9] 金伯泉. 細胞和分子免疫學實驗技術(shù)[M]. 西安： 第四軍醫(yī)大學出版社, 2002： 9-54. JIN Bo-quan. Cellular and Molecular Immunology Experiment Technology[M]. Xi’an: The Tourth Military MedicaLuniversity Press, 2002: 9-54.

[10] 熊焰, 孫霞, 荀琳.豬肺炎支原體MY-99株膜蛋白SDS-PAGE分析及免疫原性研究[J].畜牧獸醫(yī)學報, 2004, 35(1)： 74-78. XIONG Yan, SUN Xia, XUN Lin. Study on SDS-PAGE and immunogenicity ofMycoplasmahyopneumoniaestrain MY-99 membrane protein[J]. Acta Veterinariaet Zootechnica Sinica, 2004, 35(1): 74-78.

[11] 張曉佩, 龔暉, 陳如敬, 等. 遲鈍愛德華氏菌鞭毛蛋白的提取與分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學報, 2008, 23(1)： 35-38. ZHANG Xiao-Pei, GONG Hui, CHEN Ru-Jing, et al. Purification and analysis ofEdwardsiellatardaflagellin[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2008, 23(1): 35-38.

[12] Inamura H, Muroga K, Nakai T. Toxisity of extracellular products ofVibrioanguillarum[J]. Fish Pathol, 1984, 19(2)： 89-96.

[13] 陶詩, 何芳芳, 劉雪珠, 等.海水養(yǎng)殖魚類病原微生物研究進展[J]. 水產(chǎn)科學, 2013(3):175-182． TAO Shi, HE Fang-fang, LIU Xue-zhu, et al. Research progress of pathogenic microorganisms in fish in mariculture[J]. Fisheries Science, 2013(3): 175-182.

[14] van Gils Marit J, B Evelien, M Burger Judith A,et al.Rapid escape from preserved cross-reactive neutralizing humoral immunity without loss of viral fitness in HIV-1-infected progressors and long-term nonprogressors[J].Journal of Virology, 2010, 84(7): 3576-3585.

[15] Rashid T, Jayakumar K S,Binder A,et al.Rheumatoid arthritis patients have elevated antibodies to cross-reactive and non cross-reactive antigens from Proteus microbes [J]. Clinical and Experimental Rheumatology, 2007, 25(2): 259-267.

[16] Chunmei Song, Cheng Liu, Shunyan Wu, et al. Development of a lateral flow colloidal gold immunoassay strip for the simultaneous detection ofShigellaboydiiandEscherichiacoliO157:H7 in bread, milk and jelly samples[J].Food Control, 2016(59): 345-351.

[17] Shiqi Xia, Zhibiao Yu, Daofeng Liu, et al.Developing a novel immunochromatographic test strip with gold magnetic bifunctionalnanobeads (GMBN) for efficient detection ofSalmonellacholeraesuisin milk [J]. Food Control, 2016(59): 507-512.

[18] 侯灣灣. 鴨疫里默氏桿菌免疫膠體金試劑盒的研制[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學, 2014. HOU Wan-wan. Development of the Colloidal Gold Immunochromatographic Strip for the Detection ofRiemerellaanatipestiper[D]. Nanjing： Nanjing Agricultural University, 2014.

[19] 萬文菊. 劍尾魚HSP70家族兩成員的分子克隆及溶藻弧菌感染與免疫對其基因的誘導(dǎo)表達[D].泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學, 2006. WAN Wen-ju. Molecular Cloning of Two Members of HSP70 and Their Transcriptional Regulation Responding toVibrioalginolyticusInfection and Immunization inXiphophorushelleri[D]. Taian: Shandong Agricultural University, 2006.

[20] 胡雪峰, 石存斌, 潘厚軍, 等， 海水養(yǎng)殖斜帶石斑魚潰瘍病病原菌(溶藻弧菌)的初步研究[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2005, 35(2):232-236. HU Xue-feng, SHI Cun-bin, PAN Hou-jun, et al., Preliminary studies on the pathogen (Vibrioalginolyticus) of the ulceration disease of maricultured Estuary Cod,Epinepheluscoioides[J]. Periodical of Ocean University of China, 2005, 35(2): 232-236.

Abstract: Anti-Vibrioalginolyticuspolyclonal antibody was labeled with freshly prepared colloidal gold particles with a 20 nm diameter. Four specific antigens ofV.alginolyticus, including outer membrane protein, flagellum protein, extracellular products and whole-cell bacterial protein, and goat anti-rabbit IgG were dispensed on the nitrocellulose membrane as four test lines and the control line, respectively, and the colloidal gold test strip for rapiddetection ofV.alginolyticuswas developed through competitive immunochromatography combined with the antigen microarray principle. The developed colloidal gold test strip could distinguish the infection ofV.alginolyticusfromV.parahaemolyticus,V.harveyi,V.anguillarumandV.ichthyoenteri, and accurately tell the difference betweenV.alginolyticusinfection and cross-reactivity of other bacteria. The test strip gave a detection limit of 5×105cfu·mL-1ofV.alginolyticus, and the testing took 10～15 min and presented a visualizing result. This easy-to-use test strip allowed on-site rapid detection ofV.alginolyticuswithout the requirement of specialized equipment and professional personnel, providing a potential application prospect in fish aquaculture.

Key words:Vibrioalginolyticus; colloidal gold; competitive immunochromatography; specific antigen; cross-reactivity; antigen chip technology; rapid test strip

責任編輯 朱寶象

Development of a Competitive Gold Immunochromatography Test Strip for Rapid Detection ofVibrioalginolyticusin Fish

LI Jia-Wen, SHENG Xiu-Zhen,TANG Xiao-Qian,XING Jing, ZHAN Wen-Bin

(Laboratory of Pathology and Immunology of Aquatic Animal, College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

山東省科技發(fā)展計劃項目(2014GNC111015)；山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化項目(2014ZZCX06205)；國家自然科學基金項目(31472295；31672685)資助 Supported by Science and Technology Development Project of Shandong Province(2014GNC111015)； Independent Innovation and Achievement Transformation Project in Shandong Province (2014ZZCX06205)； National Natural Science Foun-dation of China (31472295；31672685)

2016-12-29；

2017-02-10

李嘉文(1991-)，男，碩士生，主要從事水產(chǎn)動物病害與免疫學研究。

?? 通訊作者：E-mail： xzsheng@ouc.edu.cn

S94

A

1672-5174(2017)09-046-09

10.16441/j.cnki.hdxb.20160432

李嘉文， 繩秀珍， 唐小千， 等.運用抗原芯片原理與競爭免疫層析技術(shù)制備魚類病原性溶藻弧菌快速檢測試紙[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2017, 47(9)： 46-54.

LI Jia-Wen, SHENG Xiu-Zhen, TANG Xiao-Qian,et al.Development of a competitive gold immunochromatography test strip for rapid detection ofVibrioalginolyticusin fish[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(9)： 46-54.