甘膺元鄧偉黃天壬吳杭航黃月瑩張玉麗

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

廣西扶綏縣肝癌高危人群HBV S區(qū)基因突變與原發(fā)性肝癌的相關(guān)性研究

甘膺元1，2鄧偉1黃天壬2吳杭航1，2黃月瑩1，2張玉麗1，2

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

目的探討廣西扶綏縣肝癌高危人群乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）S區(qū)基因突變及其與原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）的關(guān)系。方法收集來(lái)自扶綏縣肝癌高危人群隊(duì)列30例原發(fā)性肝癌患者為病例組，同時(shí)在隊(duì)列中按條件收集30例未發(fā)生肝癌的持續(xù)HBsAg陽(yáng)性者為對(duì)照組，兩組1∶1匹配，收集血清標(biāo)本。采用巢式PCR方法擴(kuò)增出HBV S區(qū)基因片段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果病例組和對(duì)照組突變率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的突變點(diǎn)為T(mén)140A、T140C、T300C、G620A（P＜0.05）；條件logistic回歸分析顯示，T140C突變可能降低原發(fā)性肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR＝0.484，95%CI：0.239～0.994），T300C突變可能增加原發(fā)性肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR＝2.911，95%CI：1.110～7.629）。結(jié)論與原發(fā)性肝癌發(fā)生相關(guān)的HBVS區(qū)基因突變位點(diǎn)有T140A、T140C、T300C和G620A，其中T140C、T300C與原發(fā)性肝癌發(fā)生有獨(dú)立相關(guān)性。

肝腫瘤；乙型肝炎病毒；S基因；基因突變；病例對(duì)照研究

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，廣西是我國(guó)肝癌高發(fā)地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年廣西肝癌發(fā)病率高達(dá)41.66/10萬(wàn)，死亡率達(dá)34.66/10萬(wàn)［1］。扶綏縣是廣西肝癌發(fā)病率和死亡率較高的地區(qū)之一，而HBV感染是該地區(qū)肝癌高發(fā)的重要因素。HBV屬嗜肝DNA病毒科病毒，其DNA由負(fù)鏈和正鏈組成，負(fù)鏈含4個(gè)開(kāi)放讀碼框架，分別為前S/S基因區(qū)、前C/C基因區(qū)、P基因區(qū)和X基因區(qū)，其中HBV S區(qū)基因序列包括第155～833位核苷酸，編碼226個(gè)氨基酸。其中親水區(qū)（majorhydrophilic region，MHR）位于nt.100～169，為S區(qū)基因常出現(xiàn)突變的片段。研究發(fā)現(xiàn)該片段發(fā)生突變易造成免疫逃逸，導(dǎo)致病情加重、預(yù)后不良，而在MHR外的sW172突變者較未突變者肝癌發(fā)生率顯著增高［2］。但目前對(duì)廣西扶綏縣肝癌發(fā)生與S區(qū)基因突變的相關(guān)性研究較少，本研究探討HBV S區(qū)基因突變與PLC相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

所有研究對(duì)象均來(lái)自廣西扶綏縣肝癌高發(fā)區(qū)肝癌高危人群隨訪隊(duì)列，該隊(duì)列由早期全人群篩查后檢測(cè)為HBsAg陽(yáng)性但未發(fā)生肝癌者組成，其中病例組為隊(duì)列中連續(xù)5年（2011～2015年）隨訪檢測(cè)結(jié)果HBsAg均陽(yáng)性的（半年檢測(cè)1次）PLC新發(fā)病例30例，年齡30～65歲，診斷符合中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì)2015年修訂的《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南》；對(duì)照組選擇標(biāo)準(zhǔn)為該隊(duì)列中與病例組同村、同性別、年齡相差2歲以?xún)?nèi)但未發(fā)生癌變的持續(xù)5年檢測(cè)為HBsAg陽(yáng)性者，與病例組進(jìn)行1∶1匹配。病例組和對(duì)照組的HBV基因型均要求為C型，基因型根據(jù)S區(qū)核苷酸序列測(cè)序結(jié)果，采用NCBI在線病毒基因分型工具確定［3］。收集病例組和對(duì)照組血清標(biāo)本，置-80℃冰箱備用。

1.2 HBV DNA的提取

血清HBV DNA提取試劑盒購(gòu)于上海天根生化科技公司，提取過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 HBV S區(qū)基因的PCR擴(kuò)增

引物合成和Taq酶購(gòu)自寶生物工程有限公司。HBV DNA基因擴(kuò)增采用巢式PCR方法，第一輪反應(yīng)引物序列：上游引物為5′-GGGTCACCATATTCTTGGG-3′，下游引物為5′-GACCCACAATTCTTTGACAT-3′；第二輪反應(yīng)引物序列：上游引物為5′-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3′，下游引物為5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，含DNA模板3μL，上下游引物各1μL，Premix Taq 25μL，加入ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件：第一輪：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃終末循環(huán)10 min；第二輪反應(yīng)退火溫度為58℃，其他反應(yīng)條件同第一輪PCR反應(yīng)條件。取產(chǎn)物7μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物目的基因長(zhǎng)度為586 bp。

1.4 HBV S區(qū)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及結(jié)果分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司測(cè)序，返回的結(jié)果采用Mutation Surveyor V4.0.5軟件與GenBank上的NC_003977.2進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組研究對(duì)象配對(duì)采用單因素配對(duì)χ2檢驗(yàn)或確切概率法，單因素分析結(jié)果有意義的突變點(diǎn)進(jìn)行多因素條件logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

病例組和對(duì)照組的性別、年齡、ALT、DNA拷貝數(shù)等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較［n（%）］

2.2 HBV S區(qū)基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，7份樣本PCR產(chǎn)物中，6份通過(guò)凝膠電泳在586 bp處出現(xiàn)亮條帶，與目的片段長(zhǎng)度相符，3號(hào)樣本因產(chǎn)物濃度過(guò)低未見(jiàn)相應(yīng)電泳條帶，見(jiàn)圖1。將S區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物與GenBank上的NC_003977.2進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示突變率較高的位點(diǎn)有33個(gè)，部分結(jié)果如圖2所示，該圖為對(duì)照組編號(hào)24的標(biāo)準(zhǔn)序列300號(hào)堿基T突變?yōu)镃，相鄰位點(diǎn)未出現(xiàn)突變。

2.3 HBV S區(qū)基因突變點(diǎn)

測(cè)序結(jié)果顯示，HBV S區(qū)共有33個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生突變，其中病例組和對(duì)照組突變頻率均較高（≥50%）的有A133G、T135A、A136C、T146C、C203T、A328C、T337A、C339A、C364A、G365A、T374C、A378C、A401C、C408T、C420A、C444T、C465T、G476C、A479G、C503T，兩組均較低（＜50%）的有T213C、C246A、A345T、C348A、C377T、A390C、T530C，兩組突變率相差較大（相差＞30%）的有G139A、T140A、T140C、C158T、T300C、G620A。

圖1 HBV S區(qū)基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 對(duì)照組編號(hào)24部分測(cè)序結(jié)果分析圖

2.4 HBV S區(qū)基因突變的單因素分析

在33個(gè)發(fā)生突變的基因位點(diǎn)中，病例組和對(duì)照組T140C、T140A、T300C、G620A突變點(diǎn)的突變率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中病例組T140A、T300C突變點(diǎn)的突變率高于對(duì)照組，T140C、G620A突變率低于對(duì)照組。見(jiàn)表2。

2.5 多因素條件logistic回歸分析結(jié)果

logistic回歸分析結(jié)果顯示，T140C突變可能降低PLC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR＝0.484，95%CI：0.239～0.994）；T300C突變可能增加PLC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR＝2.911，95%CI：1.110～7.629）。見(jiàn)表3。

表2 HBV S區(qū)基因突變單因素分析

表3 HBV S區(qū)基因突變多因素條件logistic回歸分析

3 討論

肝癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多基因參與和調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，HBV慢性持續(xù)感染是PLC發(fā)生的重要因素。HBV是高度變異的DNA病毒，基因突變發(fā)生較頻繁，研究發(fā)現(xiàn)75.9%的HBV再活化患者中攜帶超過(guò)1種HBsAg突變體［4］，分析優(yōu)勢(shì)基因型中毒株的基因突變可能有助于尋找PLC發(fā)生的病因。國(guó)內(nèi)外研究中，與HBV S區(qū)相關(guān)的基因突變所引起的氨基酸改變主要發(fā)生于“a”抗原決定簇內(nèi)（第124～147AA寡片段）［5］，該區(qū)段內(nèi)突變可能改變膜蛋白構(gòu)象，影響抗原性而不能形成誘導(dǎo)性抗體，從而引起免疫逃避［6-7］，發(fā)生隱匿型HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）［8］，其中較常見(jiàn)的突變有126、145位氨基酸突變［9-11］。亦有研究指出G145R單一突變引起免疫逃避的風(fēng)險(xiǎn)不高，需其他氨基酸（如T116N、P120S/E、Q129H等）發(fā)生突變產(chǎn)生協(xié)同作用，才能增加風(fēng)險(xiǎn)［12］。此外，堿基突變可使終止密碼子提前出現(xiàn)和HBV S區(qū)部分片段缺失，影響HBsAg表達(dá)、合成和分泌，從而影響OBI發(fā)展［13-16］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)病例組和對(duì)照組中126位蘇氨酸的核苷酸位點(diǎn)C377T突變率相同，說(shuō)明扶綏縣肝癌高危人群中HBV 126位蘇氨酸突變與PLC的發(fā)生無(wú)相關(guān)性，這和其他地區(qū)的研究結(jié)果不一致。錢(qián)福初等［17］研究發(fā)現(xiàn)HBV S區(qū)基因突變尤其是MHR出現(xiàn)突變，可能增加嚴(yán)重肝臟疾病的發(fā)生率，其中與126位氨基酸突變的相關(guān)性最強(qiáng)。地區(qū)優(yōu)勢(shì)基因差異可能是造成與本研究結(jié)果不同的原因。

本研究結(jié)果還顯示，T140A、T140C、T300C和G620A突變與扶綏縣肝癌高危人群發(fā)病有相關(guān)性，其中T300C突變?cè)贛HR內(nèi)，該突變?cè)讵?dú)立風(fēng)險(xiǎn)分析中顯示與PLC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)（OR＝2.911），提示其可能增加HBsAg持續(xù)陽(yáng)性者發(fā)生PLC的風(fēng)險(xiǎn)，但該位點(diǎn)突變的發(fā)生在國(guó)內(nèi)尚未有報(bào)道，或許能為研究扶綏縣免疫逃避等因素對(duì)PLC發(fā)生發(fā)展的影響提供新的思路。另外，T140C突變導(dǎo)致47位纈氨酸突變?yōu)楸彼幔讵?dú)立風(fēng)險(xiǎn)分析中提示該突變可能降低扶綏縣肝癌高危人群的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但該位點(diǎn)突變的出現(xiàn)是否與隊(duì)列人群的藥物干預(yù)、臨床治療相關(guān)，尚需進(jìn)一步調(diào)查研究。

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［2017-02-21收稿］［2017-03-25修回］［編輯羅惠予］

A case-control study of association between hepatitis B virus S genemutation and primary liver cancer

Gan Yingyuan1，2，Deng Wei1，Huang Tianren2，Wu Hanghang1，2，Huang Yueying1，2，Zhang Yuli1，2（1Department of Research，Affiliated Tumor Hospital of GuangxiMedical University，2Graduate School of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Huang Tianren.E-mail：tianrenhuang@sina.com

Liver neoplasm；Hepatitis B virus；Sgene；Genemutation；Case-control study

R735.7

A

1674-5671（2017）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260319）；廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究資助項(xiàng)目（KY2015ZD025，ZD2014039，2013ZD016）

黃天壬。E-mail：tianrenhuang@sina.com

【Abstract】Objective To study potential associations between mutations in hepatitis B virus（HBV）S gene and risk of primary liver cancer（PLC）in FuSui county of the Guangxi Zhuang Autonomous Region.M ethods A total of 30 new cases of PLC from individuals at high PLC risk in FuSui（based on HBsAg positivity lasting from 2011 to 2015）werematched with 30 controlswithout cancer.The S genewas amplified from DNA in serum by nested PCR and sequenced directly.Results were analyzed by chi-squared test，F(xiàn)isher's exact test and conditional logistic regression.Results Frequencies of themutations T140A，T140C，T300C and G620A differed significantly between cases and controls（P<0.05）.Logistic regression linked T140C to significantly lower risk of PLC（OR 0.484，95%CI：0.239-0.994）and T300Cwith significantly higher risk of PLC（OR 2.911，95%CI：1.110-7.629）.Conclusion T140C and T300C are independent predictors of PLC，with T140C an apparent protective factor and T300C an apparent risk factor.