蒙慧玲朱小東李齡梁忠國潘信斌曾凡艷曲頌

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院；3區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室

基礎(chǔ)研究

TM T定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)表達(dá)蛋白

蒙慧玲1，2朱小東1，3李齡1梁忠國1潘信斌1曾凡艷1曲頌1，3

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院；3區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室

目的篩選鼻咽癌復(fù)發(fā)與正常復(fù)查隨訪患者血清差異表達(dá)蛋白，尋找鼻咽癌復(fù)發(fā)診斷的標(biāo)志物。方法采集復(fù)發(fā)20例和正常復(fù)查隨訪20例鼻咽癌患者血清，采用TMT聯(lián)合二維質(zhì)譜篩選差異蛋白。進(jìn)一步收集新標(biāo)本并采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）驗證差異蛋白，其中復(fù)發(fā)40例和正常復(fù)查隨訪41例。結(jié)果血清中共鑒定出635個蛋白，其中可定量蛋白為413個。兩次生物學(xué)重復(fù)實驗中，復(fù)發(fā)組均表現(xiàn)下調(diào)的蛋白有41個，均表現(xiàn)為上調(diào)的蛋白有18個。血清ELISA驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組A2M蛋白濃度較正常復(fù)查隨訪組低（Z=-3.177，P=0.001）。復(fù)發(fā)組40例患者中可測出A2M蛋白濃度23例，正常復(fù)查隨訪組41例患者中可測出A2M蛋白濃度30例，Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，可測復(fù)發(fā)組和可測正常復(fù)查隨訪組患者A2M蛋白濃度與腫瘤分期（r=-0.024，P=0.866）、年齡（r=-0.087，P=0.534）均無相關(guān)性，兩組患者年齡、性別及腫瘤分期等差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論A2M蛋白可能是鼻咽癌復(fù)發(fā)診斷的潛在標(biāo)志物。

鼻咽腫瘤；鼻咽癌復(fù)發(fā)；TMT；蛋白質(zhì)組學(xué)；A2M；生物標(biāo)志物

放療是鼻咽癌的主要治療手段。然而，原發(fā)性鼻咽癌即使經(jīng)過規(guī)范治療，部分患者仍難以避免地出現(xiàn)鼻咽局部和（或）頸淋巴結(jié)引流區(qū)域腫瘤復(fù)發(fā)，一旦出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其治療效果不理想［1］。目前臨床上仍缺乏有效監(jiān)測鼻咽癌復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物。TMT是定量蛋白質(zhì)組學(xué)中較為常用的方法［2-3］。本研究擬采用TMT法聯(lián)合質(zhì)譜尋找鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，為鼻咽癌復(fù)發(fā)診療提供新的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

采集2008年至2015年廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科診治患者的血清標(biāo)本，所有患者均在未予任何治療情況下采血，均為初診經(jīng)病理學(xué)診斷為未分化型非角化性鼻咽癌；接受處方劑量均≥70 Gy；復(fù)發(fā)患者均為治療6個月以后，經(jīng)病理學(xué)診斷為鼻咽癌復(fù)發(fā)。正常復(fù)查隨訪患者均為治療6個月后，復(fù)查未見明顯鼻咽癌復(fù)發(fā)征象。排除嚴(yán)重心肺功能損傷患者。

選取其中復(fù)發(fā)患者20例（復(fù)發(fā)組），正常復(fù)查隨訪患者20例（正常復(fù)查隨訪組），然后分別對兩組患者進(jìn)行編號，再由電腦系統(tǒng)隨機選取10例為復(fù)發(fā)1組，另外10例復(fù)發(fā)患者為復(fù)發(fā)2組；10例正常復(fù)查隨訪患者為正常復(fù)查隨訪1組，另外10例為正常復(fù)查隨訪2組。以復(fù)發(fā)1組對比正常復(fù)查隨訪1組，復(fù)發(fā)2組對比正常復(fù)查隨訪2組，進(jìn)行兩次生物學(xué)重復(fù)試驗，通過TMT聯(lián)合二維質(zhì)譜對比篩選差異蛋白。復(fù)發(fā)組與正常隨訪組患者平均年齡分別為47.15歲和41.50歲，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組性別、腫瘤分期差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

為驗證差異蛋白在血清中的含量是否與上述質(zhì)譜結(jié)果一致，進(jìn)一步收集新標(biāo)本進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）驗證。再次由電腦隨機系統(tǒng)隨機產(chǎn)生編號，其中復(fù)發(fā)組40例，正常復(fù)查隨訪組41例。復(fù)發(fā)組與正常復(fù)查隨訪組患者年齡、性別、腫瘤分期差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究征得廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均知情并簽署知情同意書。

1.2 材料與設(shè)備

TMT試劑盒購自Thermo公司，胰酶購自Promega公司，三氟乙酸、乙腈、超純水購自Fisher Chemical公司，甲酸購自Fluka公司，碘代乙酰胺、二流蘇糖醇、尿素、四乙基溴化銨購自Sigma公司，蛋白酶抑制劑購自Calbiochem公司，BCA試劑盒購自碧云天公司，高豐度蛋白去除試劑盒購自Bio-Rad公司，ELISA試劑盒購自TSZ公司。

1.3 實驗步驟

1.3.1 TMT標(biāo)記及高效液相色譜法（High-performance liquid chromatography，HPLC）分級將復(fù)發(fā)組和正常復(fù)查隨訪組各10例血清等量混合，離心后取上清液，去除高豐度蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，洗脫液分別取20μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測高豐度蛋白去除情況。胰酶酶解肽段用Strata X C18（Phenomenex）除鹽后真空冷凍干燥。以0.5 M TEAB溶解肽段，根據(jù)TMT試劑盒操作說明標(biāo)記肽段［復(fù)發(fā)1組（Y1）：130；復(fù)發(fā)2組（Y2）：131；正常復(fù)查隨訪1組（N1）128；正常復(fù)查隨訪2組（N2）129）］。肽段采用高pH反向HPLC分級，色譜柱為Thermo Betasil C18 Column。

1.3.2 質(zhì)譜分析肽段采用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)分離，并同步使用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus進(jìn)行檢測和分析。肽段分離后進(jìn)行電離，然后進(jìn)入Q ExactiveTM Plus質(zhì)譜進(jìn)行分析。肽段母離子及其二級碎片均采用Orbitrap檢測和分析。二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Mascot search engine（v.2.3.0）檢索，同時進(jìn)行質(zhì)譜質(zhì)控。

1.3.3 ELISA驗證質(zhì)譜結(jié)果由于質(zhì)譜結(jié)果存在假陽性可能，需進(jìn)行后期驗證。鑒于A2MA蛋白差異倍數(shù)較大，且相關(guān)報道其在腫瘤致瘤性、抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等均有作用［4-6］，因此本研究選擇A2M蛋白進(jìn)行驗證。實驗嚴(yán)格按A2M蛋白的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。具體步驟：⑴加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，室溫孵育45 min；⑵棄上清液，加入洗滌液清洗4次；⑶加入生物素化抗體50μL，室溫下孵育30 min；⑷清洗，重復(fù)步驟⑵；⑸加入酶聯(lián)親和素50μL，室溫下孵育15 min；⑹清洗，重復(fù)步驟⑵；⑺加入色素原A和色素原B 50μL，室溫下孵育15 min；⑻加入停止反應(yīng)液50μL終止反應(yīng)；⑼酶標(biāo)儀測吸光度（ELISA可測范圍為0.5～90 ng/mL）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組蛋白的表達(dá)分布、蛋白表達(dá)和腫瘤分期的相關(guān)性檢測采用秩和檢驗；蛋白表達(dá)與年齡、腫瘤分期的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析法，基線特征比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜篩選差異蛋白的結(jié)果

對質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩次生物學(xué)重復(fù)實驗結(jié)果一致性良好，見圖1。兩組患者血清中共鑒定出蛋白635個，其中可定量蛋白413個。設(shè)≥1.2倍，≤0.83倍為差異倍數(shù)，兩次生物學(xué)重復(fù)實驗中，復(fù)發(fā)組均表現(xiàn)下調(diào)的蛋白41個，均表現(xiàn)為上調(diào)的蛋白18個。見表1。

圖1 兩次生物學(xué)重復(fù)實驗的重復(fù)性分析熱力圖

表1 兩次生物學(xué)重復(fù)實驗的共同差異蛋白

2.2 ELISA驗證A2M蛋白在血清中的表達(dá)

A2M蛋白的二級質(zhì)譜圖如圖2所示。血清A2M濃度數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，方差不齊，經(jīng)兩獨立樣本秩和檢驗，選取中位數(shù)及四分位法對蛋白濃度進(jìn)行描述，復(fù)發(fā)組和正常復(fù)查隨訪組A2M蛋白濃度中位數(shù)分別為34.79 ng/mL和75.67 ng/mL，第25%位數(shù)的濃度分別為13.27 ng/mL和40.03 ng/mL；第75%位數(shù)的濃度分別為61.86 ng/mL和151.92 ng/mL，正常復(fù)查隨訪組表達(dá)量高于復(fù)發(fā)組，兩組A2M蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-3.177，P=0.001）。

進(jìn)一步構(gòu)建ROC曲線驗證A2M蛋白檢測鼻咽癌復(fù)發(fā)的效能，結(jié)果ROC曲線下面積為0.757，A2M最佳界值點為35.21 ng/mL，靈敏度為56.5%，特異度為86.7%。見圖3。

圖2 A2M蛋白的二級質(zhì)譜圖

圖3 A2M蛋白的ROC曲線

2.3 A2M蛋白濃度與患者腫瘤分期、年齡的相關(guān)性

ELISA驗證實驗中，復(fù)發(fā)組40例患者可測出A2M蛋白濃度23例（可測復(fù)發(fā)組），17例因A2M蛋白濃度過低不可測。正常復(fù)查隨訪組41例患者，可測出A2M蛋白濃度30例（可測正常復(fù)查隨訪組），不可測11例。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，可測復(fù)發(fā)組和可測正常復(fù)查隨訪組患者A2M蛋白濃度與腫瘤分期（r=-0.024，P=0.866）、年齡（r=-0.087，P=0.534）均無相關(guān)性。進(jìn)一步對比分析可測組組內(nèi)（復(fù)發(fā)組可測23例和正常復(fù)查隨訪組可測30例）、不可測組（復(fù)發(fā)組不可測17例及正常復(fù)查隨訪組不可測11例）組內(nèi)、復(fù)發(fā)組組內(nèi)（可測23例和不可測17例）和正常復(fù)查隨訪組內(nèi)（可測30例和不可測11例）患者的臨床資料，結(jié)果顯示各組年齡、性別及腫瘤分期差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

鼻咽癌即使經(jīng)過規(guī)范化治療，仍有約20%的患者復(fù)發(fā)［1］，而復(fù)發(fā)患者的預(yù)后往往較差。目前臨床上仍缺乏有效檢測鼻咽癌預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，檢測復(fù)發(fā)的主要手段為影像學(xué)檢查，然而發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)時，往往腫瘤已發(fā)展至較晚程度，再次治療難以達(dá)到理想的效果［7］。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤在發(fā)展階段會分泌一些因子，某些因子表達(dá)亦可能上調(diào)或下調(diào)，這成為尋找腫瘤標(biāo)志物的重要特征［8］。

TMT［2-3，9］是一種基于肽段層面的體外標(biāo)記技術(shù)，其原理是標(biāo)志物特異性標(biāo)記多肽的氨基端，隨后進(jìn)行質(zhì)譜分析。TMT試劑由報告基團、平衡基團和反應(yīng)基團三部分組成。其中，反應(yīng)基團與氨基酸N端及側(cè)鏈的伯胺基團發(fā)生反應(yīng)，在一級質(zhì)譜中，不同來源的相同肽段被標(biāo)記后出現(xiàn)相同的質(zhì)荷比。在二級質(zhì)譜中，平衡基團斷離，被不同標(biāo)簽標(biāo)記的相同肽段出現(xiàn)不同的報告離子，根據(jù)不同報告離子的相對豐度可獲得樣本間相同肽段的相對定量信息，經(jīng)相應(yīng)軟件處理后，可明確蛋白質(zhì)的定量信息。本研究采用此方法篩選出鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)差異蛋白635個，同時進(jìn)行了兩次獨立的生物學(xué)重復(fù)實驗，兩次實驗共同的差異蛋白為59個，其中篩選差異顯著的A2M蛋白作為研究蛋白之一。TMT標(biāo)記法常見的干擾因素為干擾離子與母離子碎片混合干擾標(biāo)記，從而導(dǎo)致標(biāo)簽標(biāo)記的正確率降低［3］，因此有出現(xiàn)假陽性的可能，因此，針對質(zhì)譜的結(jié)果，本研究進(jìn)一步收集新標(biāo)本進(jìn)行后期驗證，經(jīng)ELISA驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異蛋白在血清中的含量與質(zhì)譜結(jié)果一致。

A2M是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，可減少自由基的產(chǎn)生，亦參與炎癥反應(yīng)過程［6，10-11］。有報道A2M與卵巢癌［12］、轉(zhuǎn)移性骨肉瘤［13］、肺癌［14］、星型細(xì)胞瘤［15］等發(fā)生發(fā)展相關(guān)。但尚未見A2M與鼻咽癌的相關(guān)報道。在星型膠質(zhì)瘤中，A2M與其受體LRP1相結(jié)合，可抑制其轉(zhuǎn)移、浸潤。相對非結(jié)合的A2M，A2M與LRP1形成的復(fù)合物更能激活蛋白酶抑制劑，可執(zhí)行更強大的腫瘤抑制功能，且該復(fù)合物可通過減弱Wnt/βcatenin信號通路調(diào)節(jié)腫瘤抑制功能［15］，A2M還可與Grp78、MMP-2、IGFBP-1和IGFBP-2等配體結(jié)合，產(chǎn)生不同功能［16-19］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A2M蛋白在復(fù)發(fā)組患者血清中表達(dá)下調(diào)，提示A2M可能在鼻咽癌致病過程中起抑制作用。進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，皇甫超濟等［6］對多位學(xué)者關(guān)于A2M對腫瘤的影響觀點進(jìn)行了匯總分析，其中有研究將相當(dāng)生理量的A2M放入白血病細(xì)胞培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂、增殖受抑制，且在體內(nèi)實驗也得到了同樣的結(jié)果，表明A2M有抑制腫瘤增殖作用，并認(rèn)為這一功能與其抗蛋白酶及抗自由基作用相關(guān)。腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移能力與細(xì)胞的蛋白水解酶活性相關(guān)，A2M蛋白水解酶活性高，可提高腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤能力。另一觀點為所有惡性腫瘤均有機會脫落進(jìn)入血液循環(huán)，穿透血管壁的能力主要取決于血管的通透性。而在正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面有一層A2M，A2M的數(shù)量是決定這一通透性的主要原因，因此，所有能消耗A2M的物質(zhì)均能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，相關(guān)實驗已證明A2M抗血清能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。結(jié)合上述觀點，推斷A2M在鼻咽癌復(fù)發(fā)的致病過程中可能起抑制腫瘤增殖、復(fù)發(fā)的作用，然而A2M是否結(jié)合其相應(yīng)配體產(chǎn)生抗腫瘤機制，還是獨立進(jìn)行蛋白酶抑制劑作用，目前尚不明確。此外，A2M與Wnt/ β-catenin［15］、PI3K/Akt［20］信號通路的相關(guān)性均有報道，A2M與這兩通路是否是鼻咽癌復(fù)發(fā)的相關(guān)因素，將是我們下一步研究的方向。

此外，本研究在篩選階段中因兩組患者年齡差異有統(tǒng)計學(xué)意義，因此在后期差異蛋白的驗證階段進(jìn)行了差異蛋白與年齡間的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示A2M差異蛋白濃度與年齡無相關(guān)性。同時發(fā)現(xiàn)不論是復(fù)發(fā)組還是正常復(fù)查隨訪組，均存在部分標(biāo)本A2M蛋白濃度過低，無法測出。因此，我們對可測組和不可測組患者進(jìn)行了常規(guī)的基線資料分析，發(fā)現(xiàn)兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明影響蛋白表達(dá)的因素不止年齡、性別及腫瘤分期等，患者飲食、生活習(xí)慣、環(huán)境等均有可能是影響蛋白表達(dá)的因素，需進(jìn)一步分析及驗證。

本研究采用TMT聯(lián)合二維質(zhì)譜篩選出鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)蛋白A2M，ELISA驗證結(jié)果與質(zhì)譜分析結(jié)果一致。同時構(gòu)建ROC曲線，發(fā)現(xiàn)A2M蛋白具有較高的靈敏度，提示其有望成為鼻咽癌復(fù)發(fā)診斷的潛在標(biāo)志物之一。但因本研究樣本量較小，此外，A2M蛋白濃度變異大，未進(jìn)行同一患者復(fù)發(fā)前后對比研究，且標(biāo)本收集和ELISA驗證階段的人員、環(huán)境、溫度等均有可能造成血清蛋白不同程度降解而影響實驗結(jié)果，因此有關(guān)結(jié)論需進(jìn)一步驗證。

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［2017-02-10收稿］［2017-03-25修回］［編輯羅惠予］

Identification of novel serum biomarkers for recurrent nasopharyngeal carcinoma using TMT-based quantitative proteom ic analysis

Meng Huiling1，2，Zhu Xiaodong1，3，Li Ling1，Liang Zhongguo1，Pan Xinbin1，Zeng Fanyan1，Qu Song1，（31Department of Radiation Oncology，Affiliated Tumor HospitalofGuangxiMedical University；2Graduate SchoolofGuangxiMedical University；3Key Laboratory of Education Ministry for Early Prevention and Treatment of Cancer in Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，P.R.China）

Qu Song.E-mail：daisyqs2002@163.com

Objective To identify proteins differentially expressed between recurrent nasopharyngeal carcinoma（NPC）and nonrecurrentNPC.M ethod Serumwascollected from 20 patientswith recurrentNPCand 20 patientswith non-recurrentNPC.Weused tandem mass tag labeling and high performance liquid chromatography fractionation，followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry to identify differentially expressed proteins.Candidateproteinswere confirmed by ELISA in a separate setofserum samples comprising 40 patientswith recurrentNPC and 41with non-recurrentNPC.Results A totalof635 protein groupswere identified in human serum，and expression levels of 413 proteinswere quantified.In two independent tests with different subgroups of patients，41 proteins were found to be down-regulated and 18 to be up-regulated in recurrent disease.ELISA confirmed that A2M was down-regulated in 23 patients with recurrent disease compared to 30 with non-recurrent disease.（Other patients had A2M levels below the detection threshold of the ELISA）.Spearman analysis showed that A2M concentration did not correlatewith clinical stage（r=-0.024，P=0.866）or age（r=-0.087，P=0.534）.Conclusion A2M expressionmay protect against risk of NPC recurrence and somay be a useful prognosticmarker.

Nasopharyngeal neoplasms；Recurrent nasopharyngeal carcinoma；TMT；Proteomics；A2M；Biomarker

R739.63

A

1674-5671（2017）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.01

廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點科研課題資助項目（重2012091）；區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室資助項目（GK2014-ZZ12，GK2015-ZZ05）

曲頌。E-mail:daisyqs2002@163.com