陳道光，黃傳鐘，葉韻斌，楊 瑜，陳 剛，吳君心，吳 暉，何鴻鳴，王立峰，肖景榕，楊秀玉

(福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院、福建省腫瘤醫(yī)院，福建 福州 350014)

SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤血清分子標(biāo)志物的研究

陳道光，黃傳鐘，葉韻斌，楊 瑜，陳 剛，吳君心，吳 暉，何鴻鳴，王立峰，肖景榕，楊秀玉

(福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院、福建省腫瘤醫(yī)院，福建 福州 350014)

目的 本文將SELDI-TOF-MS技術(shù)應(yīng)用于鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者與健康人的血清蛋白質(zhì)圖譜的建立，尋找血清差異表達(dá)蛋白并建立診斷初步模型，分析可能的腫瘤診斷標(biāo)志物。方法 采用SELDI質(zhì)譜技術(shù)，將血清蛋白質(zhì)結(jié)合于弱陽離子芯片上，建立30例鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者以及58例健康對照人群的血清蛋白質(zhì)圖譜，應(yīng)用Biomarker Wizard和Biomarker Pattern軟件分析2組圖譜之間的差異，通過差異峰建立分類樹診斷模型，隨機(jī)選取21例NK/T細(xì)胞淋巴瘤和25例健康對照進(jìn)行盲篩。結(jié)果 在鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤和健康對照人群的血清蛋白質(zhì)峰中有41個峰表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)Biomarker Pattern軟件和分類回歸樹的統(tǒng)計(jì)原理篩選出最佳的組合模型，聯(lián)合其中的2個質(zhì)荷比為5 641、27 427的差異蛋白峰建立淋巴瘤診斷模型，此分類樹模型可正確劃分93.10%(27/29)的淋巴瘤患者和96.30%(52/54)的健康人。盲篩驗(yàn)證的敏感性為95.24%(20/21)，特異性為100.00%(25/25)。結(jié)論 SELDI-TOF-MS技術(shù)可用于鑒別鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤，其建立的分類樹模型有望成為診斷鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的輔助指標(biāo)。

鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤；腫瘤標(biāo)志物；蛋白質(zhì)組學(xué)；表面加強(qiáng)激光解析電離化飛行時間質(zhì)譜

鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤是NK/T細(xì)胞淋巴瘤的一種特殊亞型，發(fā)病地域性明顯，主要在亞洲及部分南美地區(qū)[1]，北美及歐洲國家少見，臨床上多表現(xiàn)為鼻腔、韋氏環(huán)受累，常伴發(fā)熱，發(fā)病與EB病毒具有明顯的相關(guān)性，雖然病例數(shù)少，但其侵襲性高，化療不敏感，即使早期病例，放療后將近50%的病例終將復(fù)發(fā)，晚期及復(fù)發(fā)病例預(yù)后差，生存期短，目前臨床上評價療效、判定疾病的復(fù)發(fā)仍然依賴影像學(xué)檢查。但是，影像學(xué)通常是滯后的且價格昂貴，尤其是評價淋巴瘤療效金標(biāo)準(zhǔn)的PET-CT。另一方面，鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤除了分期以外，其他的預(yù)后因素尚不明確，多項(xiàng)臨床研究顯示淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)(IPI)在該型中無預(yù)后意義[2-3]，因此，迫切需要能反映預(yù)后的新指標(biāo)、新技術(shù)。

表面加強(qiáng)激光解析電離化飛行時間質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一種全新的技術(shù)平臺,具有高通量、快速、敏感等特點(diǎn)，可以在少量的生物粗樣本中同時發(fā)現(xiàn)多個低豐度的生物標(biāo)志物[4]，將其用于腫瘤診斷,具有較高的敏感性和特異性，在腫瘤篩查、分級、早期診斷等方面具有良好的應(yīng)用前景。

目前國內(nèi)應(yīng)用SELDI-TOF-MS研究淋巴瘤主要集中在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤[5]，本研究針對鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤這一特殊類型，病理上以血管中心性病變、血管破壞和壞死為主，通過分析30例鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者與58例健康人的血清蛋白質(zhì)譜，篩選出相關(guān)的差異蛋白峰，為鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤提供早診和預(yù)后指標(biāo)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 入組2012年1月至2014年12月福建省腫瘤醫(yī)院收治的經(jīng)病理檢查確診的鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者30例，年齡25～66歲，中位年齡47歲；男21例，女9例。并采集所有患者治療前血清標(biāo)本。收集同期福建省腫瘤醫(yī)院體檢中心健康人58例作為對照，男36例，女24例，中位年齡44歲。并采集健康人血清標(biāo)本。所有患者與健康人均抽取清晨空腹時前臂靜脈全血5 mL于無添加劑采血管中，全血靜置后于4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min,取血清,分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑 芥子酸、弱陽離子交換芯片(CM10)、PBS緩沖液、質(zhì)譜儀均購自美國Ciphergen公司。乙酸鈉、乙腈、三氟乙酸、尿素和CHAPS緩沖液均購自美國Sigma公司。

1.3 芯片及樣品處理 從-80 ℃冰箱中取出血清樣品，以4 ℃、10 000 r·min-1離心5 min，取10 μL血清，加20 μL U9處理液，充分混勻，冰浴振蕩30 min(400～ 600 r·min-1)，取出9 μL加360 μL CM 10緩沖液立即混勻，避免產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀。將已加樣處理的CM10芯片裝入生物孵育器中，每孔加入200 μL緩沖液，室溫振蕩洗滌2次，每次5 min，甩干。每孔分別加人100 μL樣品混合液，振蕩孵育1 h，用200 μL洗脫緩沖液室溫振蕩洗滌2次；拆開生物孵育器，取出芯片，晾干后，每點(diǎn)加2次1 μL SPA，晾干后上機(jī)檢測。

1.4 數(shù)據(jù)采集與分析 將芯片置入Protein Chip Biomarker System Ⅱ質(zhì)譜儀處理,檢測芯片時蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)設(shè)置如下：激光強(qiáng)度215,檢測敏感度10，優(yōu)化相對分子質(zhì)量范圍2 000～50 000。用Ciphergen ProteinChip軟件讀取蛋白質(zhì)芯片上的數(shù)據(jù)，形成血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖，其縱坐標(biāo)(峰值)為蛋白質(zhì)相對含量，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比。采用Biomarker Wizard和Biomarker Pattern軟件分析蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度與數(shù)量的差異性,控制篩選出的蛋白質(zhì)峰在10%以上的不同樣本中同時存在，且同一蛋白質(zhì)峰在不同樣本中的偏差<0.3%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對不同組中相同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，對治療前后質(zhì)譜變化分析采用自身配對t檢驗(yàn)，應(yīng)用Ciphergen ProteinChip軟件讀取蛋白質(zhì)芯片數(shù)據(jù)，應(yīng)用BioMarker Wizard軟件對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤組與健康人組血清蛋白質(zhì)差異表達(dá)模型的建立 將30例初治鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者與58例健康人血清用PBSⅡ質(zhì)譜儀(CM10芯片)進(jìn)行檢測。經(jīng)數(shù)據(jù)采集、Biomarker Wizard軟件比較分析后，共有41個血清蛋白質(zhì)峰在鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤和健康人中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，淋巴瘤患者血清中蛋白峰表達(dá)上調(diào)的有15個，下調(diào)的有26個。結(jié)合2組均數(shù)差距及標(biāo)準(zhǔn)差的大小，從中篩選出8個差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白峰，其中，淋巴瘤組升高的蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比)為2 727、5 641、6 644，降低的蛋白質(zhì)峰為2 753、3 412、4 098、8 725、8 792。應(yīng)用Biomarker Pattern軟件對SELDI-TOF-MS質(zhì)譜獲得的峰值數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用Gini決策分類樹分析法(敏感性0.05)，并選擇有顯著差異的蛋白質(zhì)峰建立分類樹模型。BPS法判別分析擇優(yōu)選出質(zhì)荷比為5 641、2 727的2個蛋白質(zhì)峰，建立鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤與健康人的差異蛋白峰分類樹模型。將81例血清蛋白質(zhì)圖譜分成2組，以5 641蛋白差異峰為節(jié)點(diǎn)1，其中峰值≤1.435的32例樣本劃分到節(jié)點(diǎn)2中，峰值>1.435的49例樣本劃分到終節(jié)點(diǎn)3中，診斷為健康人。將節(jié)點(diǎn)2中的32例樣本繼續(xù)以2 727蛋白差異峰為節(jié)點(diǎn)進(jìn)行劃分，其中峰值≤2.63的5例樣本劃入終節(jié)點(diǎn)1中，同樣診斷為健康人，峰值>2.63的27例樣本劃入終節(jié)點(diǎn)2中，診斷為鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤。從中我們可以看到，該分類樹模型將29例鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者中的27例劃分為患者，2例劃分錯誤，而健康人全部劃分正確，因此該模型可正確劃分93.10%(27/29)的鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者和96.30%(52/54)的健康人。

2.2 NK/T細(xì)胞淋巴瘤血清差異蛋白分類樹模型的盲篩試驗(yàn)及診斷價值 為了進(jìn)一步驗(yàn)證所建立模型的正確性、可應(yīng)用性，另外隨機(jī)選取46份血清，其中經(jīng)病理確診為NK/T細(xì)胞淋巴瘤的標(biāo)本21例，正常健康人標(biāo)本25例。將血清通過CM10芯片富集、SELDI蛋白質(zhì)譜檢測后，得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)入該分類樹模型進(jìn)行盲篩，該模型最終判定46例血清標(biāo)本中有20例來源于NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者，26例為健康人，其中1例患者被誤判為健康人，而25例健康人全部判斷正確，沒有誤判為淋巴瘤患者。由此可見，該分類樹模型的盲篩驗(yàn)證的敏感性為95.24%(20/21)，特異性為 100.00%(25/25),陽性預(yù)測值為100.00%(20/20)，陰性預(yù)測值為96.15%(25/26)。見表1。

表1 NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者血清差異蛋白分類樹模型盲篩結(jié)果 n

3 討論

鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤是一種來源于NK/T細(xì)胞，以面部中線部位的組織破壞為特征，WHO在對淋巴組織腫瘤進(jìn)行分類時，將其劃為非霍奇金淋巴瘤的一個獨(dú)立病種[6]。由于鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病率低，發(fā)病人群少，相關(guān)研究不受重視且滯后，給該病的治療造成了影響，如何提高鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的診斷率是目前迫切需要解決的問題[7]。夏忠軍等[8]指出在入組的75例淋巴瘤首診患者血清中，β2微球蛋白的含量高于正常值的約占52%，而其中52例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者中，β2微球蛋白升高的占77%，乳酸脫氫酶升高的占25%，β2微球蛋白在其他腎臟疾病及血液病中同樣升高明顯，而乳酸脫氫酶受心臟疾病、肝臟功能等影響也較大，因此，將這2項(xiàng)指標(biāo)作為診斷指標(biāo)，其敏感性和特異性均不理想。

本研究將30例初治的鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者與58例健康人血清蛋白經(jīng)過SELDI質(zhì)譜檢測，建立血清蛋白圖譜，經(jīng)軟件比較分析后，共發(fā)現(xiàn)41個血清蛋白質(zhì)峰在NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者中的表達(dá)與健康人又差異，其中蛋白峰表達(dá)升高的有15個，下降的有26個。通過進(jìn)一步軟件篩選，發(fā)現(xiàn)在淋巴瘤患者血清中升高的蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比)2 727、5 641、6 644，降低的蛋白質(zhì)峰2 753、3 412、4 098、8 725、8 792，這8個蛋白峰與健康人比較有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時通過BPS軟件以2 727、5 641的2個蛋白峰為節(jié)點(diǎn)建立淋巴瘤與健康對照組差異蛋白峰分類樹模型，可正確劃分93.10%(27/29)的淋巴瘤患者和96.30%(52/54)的健康人，該分類樹模型的盲法驗(yàn)證的敏感性為95.24%(20/21)，特異性為100.00%(25/25),陽性預(yù)測值為100.00%(20/20)，陰性預(yù)測值為96.15%(25/26)。Zhang等[9]應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)共分析了132例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤和75例正常對照，獲得7個蛋白差異峰，其建立的分類樹模型用于鑒別彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤，敏感性和特異性均可以達(dá)到94%。通過比較發(fā)現(xiàn)，本研究所獲得淋巴瘤差異峰與Zhang等[9]不同，主要是由于本研究所使用的是弱陽離子交換芯片(CM10)，而Zhang等[9]使用的是WCX2芯片，不同芯片結(jié)合的血清蛋白也不同，這是造成不同論文得到的蛋白差異峰不盡相同的主要原因。其次，本研究針對較為罕見的鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤，與其他論文的研究對象不同，也是導(dǎo)致差異的原因所在。

綜上所述，SELDI-TOF-MS技術(shù)在鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的輔助診斷方面具有一定的參考價值。雖然目前臨床上有將部分血清標(biāo)志物應(yīng)用于淋巴瘤的輔助檢查，但是缺乏足夠的敏感性和特異性，臨床應(yīng)用價值很低，本研究提供的鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤模型為其輔助診斷提供了新的方向，值得進(jìn)一步研究。同時，我們也看到了SELDI-TOF-MS技術(shù)的局限性，無法準(zhǔn)確得知所獲取蛋白峰代表的具體蛋白質(zhì)名稱。因此，經(jīng)SELDI技術(shù)篩選出的異常蛋白峰，經(jīng)過進(jìn)一步以免疫印跡、免疫組化等方法進(jìn)行檢驗(yàn)鑒定，更進(jìn)一步通過分子生物學(xué)闡明其致病機(jī)制，必將能為臨床淋巴瘤的診治提供更多參考依據(jù)。

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福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新項(xiàng)目(編號：2012-CX-8)

陳道光(1970-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事惡性淋巴瘤研究。E-mail:cdg70@126.com

楊瑜(1962-)，男，主任醫(yī)師，主要從事惡性淋巴瘤診治研究。E-mail: yangyu901@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.03.024

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B

1673-5412(2017)03-0250-03

2016-06-03)