孫倩怡,李慧萍,張晶*,魯寶君,夏玉婷

(1.吉林農業(yè)大學 中藥材學院，長春 130118；2.杭州睦山農實業(yè)投資有限公司，杭州 311604)

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星點設計法優(yōu)化超聲酶法提取藍莓粉中花青素的工藝

孫倩怡1,李慧萍1,張晶1*,魯寶君2,夏玉婷2

(1.吉林農業(yè)大學 中藥材學院，長春 130118；2.杭州睦山農實業(yè)投資有限公司，杭州 311604)

通過單因素實驗和星點設計-效應面法優(yōu)化超聲酶法提取藍莓中花青素的工藝，以酶種類、酶用量、提取時間、提取溫度、料液比、醇濃度和pH值為因素，以花青素提取率為指標，進行提取工藝的單因素優(yōu)化；在單因素實驗基礎上，通過星點設計-效應面法，考察聯合提取時體系中醇濃度，提取時間，料液比對提取結果的影響，從而確定了酶-輔助超聲法提取藍莓中花青素的最佳工藝為：β-葡聚糖酶，提取時間為20 min，料液比為1∶20，往體系中補充無水乙醇，使得體系中的醇濃度為55%，再繼續(xù)超聲提取10 min?；ㄇ嗨靥崛÷士蛇_到19.156%，提取條件溫和，酶用量小，提取率高，可為藍莓中花青素的深度開發(fā)提供科學依據。

藍莓；花青素；酶法-超聲輔助提取；星點設計

藍莓為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(VacciniumSpp)植物的漿果，原產于北美洲[1]，其果皮中含有大量的花青素成分[2]，具有很強的抗氧化、保護視力、抗癌和增強心血管功能等生物活性[3]。在食品色素、化妝品、醫(yī)療等方面具有巨大的應用價值。近些年來，王靜等[4]研究發(fā)現藍莓花青素可明顯提高小鼠的痛閡值，抑制耳廓腫脹，從而起到消炎的效果；王關林等[5]研究發(fā)現，花青素可抑制小鼠肉瘤S180 的生長；康雪燕[6]通過豬體外試驗研究發(fā)現，花青素對豬傳染性胃腸炎病毒有一定的治療效用；不僅如此，研究發(fā)現花青素還可以增強雞的免疫力，同時促其生長[7]；由此可知花青素對動物疾病也有著良好的預防和治療作用，在獸藥方面有著較強的應用價值。但由于花青素的穩(wěn)定性差，對pH、光、溫度等極為敏感[8]，在提取過程中損失較大，使其應用受到了很大的限制，故提高藍莓中花青素的提取率成為藍莓擴大應用的瓶頸問題，優(yōu)化藍莓花青素提取工藝也成為藍莓生產行業(yè)中的研究熱點。本文以酶輔助超聲提取的方法提取藍莓凍干粉中的花青素，旨在為藍莓資源的廣泛應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 藍莓：由杭州睦山農實業(yè)投資有限公司提供，由本項目組鑒定為杜鵑花科越橘屬漿果類植物果實。藍莓鮮果避光勻漿后，凍干成粉狀，-20 ℃避光保存，待用。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(純度>98%，四川省維克奇生物科技有限公司，批號：150823)；β-葡聚糖酶(源葉生物，批號：G6831)；木瓜蛋白酶(Sigma，批號：P3250)；木聚糖酶(Sigma，批號：X3254)；其他試劑均為分析級。

1.2 主要儀器 HR2839勻漿機，珠海經濟特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；PL303電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Telstar LyoQuest冷凍干燥機、THermo Fisher ST 16R高速冷凍離心機，昊諾斯科技(北京)有限公司；KQ5200DB型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；PB-10酸度計，德國賽多利斯公司。

1.3 酶輔助超聲提取工藝單因素優(yōu)化實驗 精確稱取藍莓粉1.000 g于錐形瓶中，采用超聲法(200 W，40 KHz)，以酸水溶液為溶劑，分別考察加入酶的種類(木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶及3種酶按不同比例組合的復合酶)、提取溫度(10、20、30、40、50及60 ℃)、加酶量(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0及10.0 mg/g)、提取時間(10、15、20、25及30 min)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25及1∶30)、pH值(1、2、3、4、5及6)酶解一定時間，然后往體系中加入乙醇，使體系醇濃度為(30、40、55、70及80%)，繼續(xù)超聲10 min，藍莓中花青素提取率的變化，提取液離心，過濾后定容，測定其花青素含量(方法見1.5)。

1.4 酶輔助超聲提取星點設計-效應面法優(yōu)化實驗 根據單因素實驗結果，通過星點設計-效應面法，以藍莓中花青素的提取率為優(yōu)化指標，采用β-葡聚糖酶，加酶量為6.0 mg/g，溫度40 ℃，考察聯合提取時體系中醇濃度，提取時間，料液比對提取結果的影響，從而確定最佳提取工藝。星點水平設計如表1。

1.5 花青素含量的測定

1.5.1 制備標準曲線 精密稱取失車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品1.0 mg，用甲醇定容至5 mL。從中分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于試管中，取2組，均用甲醇定容至1 mL，然后其中的一組以pH 1.0的緩沖液定容至5 mL；另外一組以pH 4.5的緩沖液定容至5 mL，將兩組梯度標品溶液分別于530和700 nm 測定其吸光度，按公式1計算A實際，以吸光度A實際為縱坐標，濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：y=4.7571x-0.00971，R2=0.9993，線性范圍0.02～0.12 mg/mL。

公式1：A實際=(A530-A700)pH1.0-(A530-A700)pH4.5

表1 星點設計因素與水平Tab 1 Factors and levels of central composite design

1.5.2 提取物中花青素含量的測定 取1.3項和1.4項的提取液1 mL，分別加入pH 1.0和pH 4.5的緩沖溶液，按1.5.1項測定吸光度值，按標準曲線計算總花青素濃度C，按公式2計算花青素含量：

花青素含量(mg)=C×V1×V2/V3(公式2)

C-花青素濃度(mg/mL)；V1-供試液體積(mL)；V2-提取液總體積(mL)；V3-待測液體積(mL)

花青素提取率(%)=m1/m2(公式3)

m1-花青素含量(mg)；m2-藍莓干粉含量(mg)

2 結果與分析

2.1 單因素實驗 以pH=3的酸性水溶液為溶劑、料液比為1∶20(g∶mL)、40 ℃條件下，按照總加酶量為6.0 mg·g-1，超聲提取30 min后，加入乙醇使?jié)舛冗_55%，繼續(xù)超聲提取10 min為基本工藝，進行單因素考察實驗。

2.1.1 酶種類對花青素提取率的影響 在提取體系中加入不同種類的酶，考察酶種類對藍莓中花青素提取率的影響。由圖1可知，加酶后，花青素的提取率顯著提高；3 種酶中，以β-葡聚糖酶對花青素的提取率影響最大，使提取率達17.58%，較空白組提高21.2%，然后依次是木聚糖酶、木瓜蛋白酶；3種酶的不同組合均未達到β-葡聚糖酶的提取效果。

2.1.2 不同溫度對花青素提取率的影響 在基本工藝基礎上，考察β-葡聚糖酶在不同提取溫度條件下對花青素提取率的影響，結果如圖2所示。隨溫度的提高，提取率呈現先升后降的趨勢，當溫度為30 ℃，提取率出現最大值。原因在于溫度太低酶的活性不能被激活，溫度太高不僅酶活性被抑制，且花青素容易降解。故提取溫度以30 ℃為宜。

2.1.3 酶用量對花青素提取率的影響 在基本工藝基礎上，考察β-葡聚糖酶不同用量對花青素提取率的影響，結果如圖3所示。隨著加酶量的增大，花色素的提取率呈現先升后降的趨勢，當β-葡聚糖酶用量達到5.0 mg·g-1時，花色素的提取率達最大值。原因是β-葡聚糖酶因為當酶與溶液充分作用后，繼續(xù)增加酶的用量并不能使花青素釋放，故呈現平緩趨勢，考慮到提取率和工業(yè)化生產，故選用酶量為5.0 mg·g-1。

2.1.4 提取時間對花青素提取率的影響 在基本工藝基礎上，考察加入β-葡聚糖酶后，提取時間對花青素提取率的影響，結果如圖4所示。隨提取時間的延長，花青素提取率呈先升后平緩的趨勢，20 min時出現最大值。因為酶解反應需要一定時間，但是當其充分反應后，花青素的提取率便不會再增加了，故提取時間20 min為宜。

2.1.5 料液比對花青素提取率的影響 在基本工藝基礎上，考察不同的料液比對花青素提取率的影響。結果如圖5所示，隨料液比的升高而增大，花青素提取率呈現先升后降的趨勢，當料液比為1∶20時提取率出現最大值。因為隨著溶劑量的增加，一是會降低酶的濃度，導致其作用效果不明顯；二是會加大其他雜質的提取量，導致花青素的提取量降低，故選擇料液比為1∶20。

2.1.6 醇濃度對花青素提取率的影響 在基本工藝基礎上，考察醇濃度對花青素提取率的影響。結果如圖6所示，隨體系中的醇濃度的增大，花青素的提取率呈現先升后降的趨勢，在醇濃度達55%時，花青素提取率最高。因為花青素屬于黃酮類化合物，可溶于水和乙醇等極性溶劑，當花青素的極性和溶劑的極性越接近時，其提取率就越好，但是隨著乙醇濃度的增大，溶劑的極性相對變小，與花青素的極性差距變大，導致其提取率降低，故選用55%的醇濃度最佳。

2.1.7 pH值對花青素提取率的影響 在基本工藝基礎上，考察醇濃度對花青素提取率的影響。結果如圖7所示，隨溶劑中pH值的增大，花青素的提取率呈現先上升后降的趨勢，在pH值為3的時候有最大值。因為當pH為3的時候達到峰值，故選用pH值為3最佳。

圖2 溫度對花青素提取率的影響Fig 2 Effect of temperature on anthocyanins extraction rate

圖3 酶用量對花青素提取率的影響Fig 3 Effect of enzyme addition on anthocyanins extraction rate

圖4 提取時間對花青素提取的影響Fig 4 Effect of extraction time on anthocyanins extraction rate

圖5 料液比對花青素提取的影響Fig 5 Effect of solid to liqiud ratio on anthocyanins extraction rate

圖6 乙醇濃度對花青素提取的影響Fig 6 Effect of ethanol concentration on anthocyanins extraction rate

圖7 pH值對花青素提取的影響Fig 7 Effect of pH on anthocyanins extraction rate

2.2 星點設計分析 以體系的醇濃度、超聲時間、料液比為自變量，以花青素提取率為評價指標，星點設計結果如表2。

2.2.1 模型擬合及方差分析 17個統(tǒng)計設計試驗

表2 星點試驗設計與結果Tab 2 Arrangement and results of central composite design

通過不同物理參數來優(yōu)化自變量(體系醇濃度，提取時間和料液比)對藍莓粉中花青素提取率的綜合影響?；ㄇ嗨靥崛÷试诓煌瑢嶒灄l件下的結果如表2所示，數據用Design Expert 8.0.6軟件分析，得到二項式方程如下：

Y=19.15+0.37X1+0.13X2+0.16X3+0.12X1X2+0.059X1X3-0.04X2X3-0.75X12-0.15X22-0.33X32

Y是花青素提取率，X1,X2,X3是體系醇濃度，提取時間，料液比。

為檢驗該模型的顯著性及準確性，進行了方差分析(ANOVA)，如表3所示。模型的F值為30.24意味著模型的顯著性。模型的F值只有0.01%與噪音等因素有關。在此實驗中，一次項A、C，二次項A2、C2在模型中有極顯著性，一次項B，二次項B2有顯著性。失擬項的F值為26.13，意味著相對于純粹的錯誤來說，失擬項顯著，具有一定的意義。Adj R2=0.9427與Pred R2=0.8073不相近，表明了實驗模型有較好的解釋性。通常是Adeq Precision大于4認為是具有可信度的，該比例是19.450，說明此模型對藍莓中花青素的提取是可行的。

表3 方差分析Tab 3 Analysis variance

注：**表示P<0.01，表示有極顯著差異；*表示P<0.05，表示有顯著差異。

2.2.2 工藝參數優(yōu)化和預測 通過二項式擬合模型，采用Design-Expert 8.0.6軟件做相應響應曲面圖，結果見圖8a、8b、8c，根據擬合的響應曲面形狀，研究體系醇濃度、提取時間和料液比對藍莓干粉中花青素提取率的影響，從圖中可以看出，最佳的提取工藝是醇濃度55%，提取時間20 min，料液比為1∶20。

a.醇濃度與提取時間; b.醇濃度與料液比; c.提取時間與料液比(A)Alcohol concentration and extraction time; (B)Alcohol concentration and liquid ratio; (C)Extraction time and liquid ratio圖8 醇濃度、提取時間和料液比相互擬合對花青素提取率影響的三維效應面圖Fig 8 Alcohol concentration, extraction time and liquid ratio to fit each other of the three-dimensional view of the effect of the anthocyanins extraction rate

2.2.3 驗證試驗 根據最佳工藝條件進行3次驗證試驗，體系醇濃度55%，提取時間20 min，料液比1∶20。模型預計的響應值是19.156%，實際花青素平均提取率是19.018%。將預測值與實測值進行比較，計算偏差RSD值為 0.7 %，說明此數學模型可靠，具有良好的預測性。

3 討論與小結

藍莓花青素是一種水溶性色素，具有廣泛的生物活性及應用范圍，但其穩(wěn)定性差且提取率低[9]，故增大其提取率是現在藍莓應用市場的研究重點。針對于本實驗中選用的酶[10,17]而言，β-葡聚糖酶能水解植物細胞壁纖維素，使細胞內的物質更容易析出；木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，能水解植物中細胞中的蛋白質；木聚糖酶能水解植物細胞壁中的異質多糖，而促使細胞壁破裂；但是由于植物細胞壁主要由纖維素和果膠構成，故作用于細胞壁纖維素的β-葡聚糖酶提取效果更好。

對于提取方法而言，酶-輔助超聲提取技術與酶法[10-11]相比，能明顯縮短提取時間，酶法提取需要1～2 h，而酶-輔助超聲提取僅需要15～30 min；與超聲提取法[12-14]相比，能減少提取溶劑的使用量，超聲提取法需醇濃度為70～80%，酶-輔助超聲提取技術則需醇濃度為55%左右；對于內在因素提取率而言，不論是酶法或是超聲提取法，藍莓果提取率在4%～7%之間，換算成干粉其提取率在13%～14%左右，而酶-輔助超聲得到的花青素的提取率為19.156%，比常規(guī)的酶法或超聲法提高了約20%～30%。本文通過酶-輔助超聲提取技術[13-14]對體系醇濃度、提取時間、料液比3個重要因素進行了研究，以花青素的提取率為優(yōu)化指標，采用星點設計-效應面法進行工藝優(yōu)化[15-17]。建立酶-超聲輔助提取藍莓中花青素的最佳工藝為：添加β-葡聚糖酶，提取體系的醇濃度為55%，提取時間20 min，料液比1∶20 g·mL-1，提取率可達19.156%。酶-輔助超聲提取法提高了藍莓中花青素的提取率，且提取時間短，可操作性強，利于藍莓花青素在治療人和動物疾病等方面的開發(fā)利用。

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(編輯：陳希)

Study on the Extraction of Anthocyanins from Blueberry with Ultrasonic Enzymatic Optimized by Central Composite Design-response Surface Method

SUN Qian-yi1, LI Hui-ping1, ZHANG Jing1*, LU Bao-jun2,XIA Yu-ting2

(1.CollegeofChinesemedicine,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.HangzhouMoMountainIndustrialInvestment,Hangzhou311604,China)

ZHANGJing，E-mail:zhjing0701@163.com

In this experiment, to optimize ultrasonic extraction technology process conditions of anthocyanin from blueberry by the single factor experiment and the central composite design-response surface method. Use the enzymatic types, enzyme addition,extraction time, extraction temperature, ratio of material to liquid and ethanol concentration as the optimum factor. Use the anthocyanin extraction rate as the optimum index to optimize extraction process of single factor, on the basis of single factor experiment, by the means of the central composite design, investigate the alcohol concentration, extraction time, ratio of material to liquid, get the best extraction procedure thought enzymatic-ultras onic-assisted were as follows: β-glucanase, extraction time 20 min, solid to liquid ratio 1∶10. Afterwards, ethanol (final concentration 40%) was added to the mixture for ultrasonic-assisted extracting 10 min. The results show enzymatic-ultrasonic-assisted extraction rate can reach 19.156%, this method extraction condition mild , with less enzyme, provides a reasonable reference of the future for the development of anthocyanin from blueberry.

blueberry; anthocyanin; enzymatic-ultrasonic-assisted; central composite design

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20140204063YY)；杭州市錢江學者計劃(2015年) 作者簡介： 孫倩怡，碩士研究生，從事天然產物化學方面研究。

張晶。E-mail：zhjing0701@163.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.6.06

2016-12-05

A

1002-1280 (2017) 06-0041-08

S859.79