李潤，孫曄，趙洪明，梁占軍，王榮申，蔣桃珍

(1.北京中海生物科技有限公司，北京 100081； 2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081； 3. 石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，石家莊 050000；4.無極縣畜牧獸醫(yī)站，石家莊052460)

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雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株+CA株+CF株)安全性及免疫效果評價(jià)

李潤1，孫曄2，趙洪明3，梁占軍4，王榮申3，蔣桃珍2

(1.北京中海生物科技有限公司，北京 100081； 2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081； 3. 石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，石家莊 050000；4.無極縣畜牧獸醫(yī)站，石家莊052460)

通過觀察疫苗免疫后雞群的生長情況和臨床癥狀，檢測免疫后不同時(shí)期雞群的ELISA抗體水平和攻毒保護(hù)率以及對雞新城疫(ND)疫苗免疫后不同時(shí)間雞群的HI抗體水平，評價(jià)和檢測了雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株+CA株+CF株)在石家莊地區(qū)臨床應(yīng)用的安全性、免疫效果、免疫持續(xù)期以及是否會(huì)產(chǎn)生免疫抑制。結(jié)果表明，試驗(yàn)疫苗接種蛋雞和肉雞后，均沒有觀察到因疫苗引起的不良反應(yīng)，對蛋雞和肉雞均安全。疫苗接種蛋雞后14 d、28 d、42 d、60 d和90 d，接種肉雞后14 d、21 d和36 d攻毒保護(hù)率均達(dá)80%以上；商品蛋雞接種疫苗后90 d其ELISA抗體水平仍高達(dá)6500以上。ND HI抗體檢測結(jié)果表明，試驗(yàn)疫苗接種后對ND疫苗的免疫應(yīng)答無顯著影響，不引起免疫抑制。試驗(yàn)疫苗安全、有效，質(zhì)量穩(wěn)定，適用于預(yù)防雞傳染性法氏囊病。

雞傳染性法氏囊病；疫苗；免疫效果

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV) 引起的一種危害雛雞的急性、高度接觸性傳染病[1]，OIE將本病列為B類傳染病,我國規(guī)定為二類傳染病。免疫接種是預(yù)防IBD的主要措施。但傳統(tǒng)的IBDV弱毒活疫苗不能突破母源抗體的干擾，對超強(qiáng)毒株和變異株的預(yù)防效果較差，常常發(fā)生免疫失敗，導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失。而中等毒力和中等偏強(qiáng)毒力的毒株雖能夠突破一定水平的母源抗體，卻引起中度到重度的法氏囊萎縮，導(dǎo)致相應(yīng)的免疫抑制[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)室利用IBDV血清1型中的三個(gè)亞型(按Jackwood and Saif 的分類)[3]進(jìn)行3毒株法氏囊病活疫苗的研制，并對疫苗在石家莊市應(yīng)用的安全性、有效性進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株+CA株+CF株)中試產(chǎn)品，吉林正業(yè)生物制品股份有限公司生產(chǎn)，經(jīng)檢驗(yàn)符合擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，批號分別為201001、201002和201003，規(guī)格500羽/瓶。

1.1.2 毒株 攻毒用雞傳染性法氏囊病病毒BC6-85株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 9日齡農(nóng)大三號蛋雞和8日齡羅斯(Ross)308肉雞。

1.1.4 試劑盒 雞傳染性法氏囊病ELISA抗體檢測試劑盒，購自IDEXX公司(美國愛德士生物科技公司)。

1.1.5 試驗(yàn)地點(diǎn) 河北省石家莊地區(qū)無極縣順發(fā)蛋雞養(yǎng)殖專業(yè)合作社和新樂市梧桐林養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 免疫接種

1.2.1.1 超劑量免疫 將3批中試產(chǎn)品分別稀釋至500羽/5 mL，經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼和滴口途徑共接種約1500只9日齡農(nóng)大三號蛋雞，0.1 mL/只；3批疫苗分別稀釋至10羽/10 mL，經(jīng)飲水途徑共接種約1500只8日齡羅斯(Ross)308肉雞，每只10羽份。

1.2.1.2 推薦劑量免疫 將3批中試產(chǎn)品稀釋至1羽/10 mL，經(jīng)飲水途徑接種15500只9日齡蛋雞和13000只8日齡肉雞，同時(shí)將201001批用生理鹽水稀釋至1羽/0.03 mL，經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼途徑接種1000只9日齡蛋雞。另外將201002批疫苗稀釋至0.5羽/10 mL，經(jīng)飲水途徑接種1500只8日齡肉雞，每只0.5羽份。

1.2.2 臨床觀察 免疫接種后14 d內(nèi)，每天觀察雞群的精神狀態(tài)、采食、飲水和糞便情況，以及有無全身和局部不良反應(yīng)。于免疫后14 d隨機(jī)取20只超劑量免疫組蛋雞和20只超劑量免疫組肉雞進(jìn)行剖檢，觀察雞法氏囊、肝臟、腎臟、脾臟、腺胃、肌胃、胸、腿和翼部肌肉有無肉眼可見病變，檢測免疫組雞法氏囊萎縮情況，測B/B(囊重/體重)比值。蛋雞免疫后90 d內(nèi)，肉雞免疫后至出欄，定期向養(yǎng)殖場場主了解雞群健康狀況。

1.2.3 免疫雞血清抗體效價(jià)監(jiān)測 免疫蛋雞后14 d、28 d、42 d、60 d和90 d，肉雞免疫后14 d、21 d、31 d、36 d，隨機(jī)抽取免疫雞若干只，采集血液、分離血清，參照試劑盒說明書，用IDEXX公司的雞傳染性法氏囊病ELISA抗體檢測試劑盒檢測抗體效價(jià)。

1.2.4 免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn) 免疫蛋雞后14 d、28 d、42 d、60 d和90 d，肉雞免疫后14 d、21 d、36 d，各免疫組隨機(jī)抽取10只免疫雞，連同10只對照組雞，用雞傳染性法氏囊病病毒BC6-85株進(jìn)行攻毒，0.1 mL/只(含100個(gè)BID)，攻毒后每日觀察試驗(yàn)雞發(fā)病情況，并于攻毒后72 h剖檢各組雞法氏囊，觀察和統(tǒng)計(jì)法氏囊病變情況。

1.2.5 疫苗接種后對ND疫苗免疫應(yīng)答的影響試驗(yàn) 兩個(gè)臨床試驗(yàn)雞場均按其原有的新城疫免疫程序進(jìn)行ND疫苗的免疫接種。蛋雞用IBD試驗(yàn)疫苗免疫后14 d、28 d和42 d(即分別在ND疫苗第1次免疫后16 d、30 d和44 d)，肉雞用IBD試驗(yàn)疫苗免疫后14 d、21 d和28 d(即分別在ND疫苗第1次免疫后16 d、29 d和36 d)，每組隨機(jī)取20只雞采血測定ND HI抗體滴度[5]，檢測試驗(yàn)疫苗接種后對ND疫苗免疫應(yīng)答的影響。

2 結(jié) 果

2.1 疫苗的安全性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超劑量安全性試驗(yàn)結(jié)果 9日齡蛋雞和8日齡肉雞10倍劑量接種后精神狀態(tài)良好，沒有出現(xiàn)因疫苗引起的呼吸道癥狀、腸炎等局部和全身不良反應(yīng)。免疫后14 d，隨機(jī)從各免疫組抽取20只肉雞和20只蛋雞，系統(tǒng)剖檢雞法氏囊、肝臟、腎臟、脾臟、腺胃、肌胃、胸、腿和翼部肌肉，除法氏囊有輕度萎縮外，各器官均無肉眼可見病變，蛋雞和肉雞免疫組雞法氏囊BB指數(shù)分別為0.75和0.69，無顯著差異。

2.1.2 推薦劑量接種的安全性試驗(yàn) 3批疫苗接種9日齡蛋雞和8日齡肉雞后，在14 d觀察期內(nèi)，所有免疫組雞均沒有出現(xiàn)異常臨床反應(yīng)，免疫雞精神狀態(tài)良好，采食和飲水正常，糞便正常，無全身和局部不良反應(yīng)。肉雞接種疫苗后至出欄前，所有免疫雞體重均勻，個(gè)體差異不顯著；疫苗免疫當(dāng)日、免疫后14 d、21 d和31 d，每批疫苗免疫組隨機(jī)取30只雞進(jìn)行稱重，結(jié)果表明，除免疫當(dāng)天外，疫苗免疫組與對照組雞體重?zé)o顯著差異，P>0.05，結(jié)果見表1。

表1 羅斯(Ross)308肉雞推薦劑量接種后增重情況Tab 1 Dynamiting of Ross 308 broilers injected with recommended dose vaccine

試驗(yàn)地點(diǎn)：新樂市梧桐林養(yǎng)殖場

Location: Wu Tonglin Farm in Xinle country

2.2 疫苗的臨床免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 疫苗免疫后血清抗體效價(jià)測定結(jié)果

2.2.1.1 抗體陽性率 蛋雞免疫當(dāng)日，隨機(jī)取約460只雞采血，測母源抗體水平，其抗體陽性率為76%；免疫后14日，免疫組抗體陽性率為57%，空白對照組為30%；接種后28～90日免疫組雞群98%以上抗體陽性，對照組雞群100%抗體陰性；結(jié)果見表2。肉雞免疫當(dāng)日，隨機(jī)取219只雞采血，測母源抗體水平，其抗體陽性率為42%；免疫后14日，免疫組抗體陽性率為54%，空白對照組為10%；接種后21日～36日各免疫組雞的平均抗體陽性率為77%以上，對照組雞群100%抗體陰性；結(jié)果見表3。

2.2.1.2 ELISA抗體滴度 9日齡時(shí)，蛋雞平均母源抗體滴度為2516，部分雞的母源抗體滴度可高達(dá)6000～8000；蛋雞免疫后14 d，各免疫組平均抗體效價(jià)分別為734、770、706和603，對照組平均抗體滴度為陰性(小于396)；接種后28日，免疫組抗體效價(jià)均高于3000；詳細(xì)結(jié)果見圖1。8日齡時(shí)，肉雞的母源抗體平均滴度為509；免疫后14日，免疫組平均ELISA抗體滴度分別494、1557、776和409，對照組抗體均為陰性；接種后31日，免疫組抗體效價(jià)均高于2000；詳細(xì)結(jié)果見圖2。

表2 農(nóng)大三號蛋雞免疫后不同時(shí)間的抗體陽性率Tab 2 The antibody positive rate in different time of injected agriculture university No 3. layers

表3 羅斯(Ross)308肉雞免疫后不同時(shí)間的抗體陽性率Tab 3 The antibody positive rate in different time of injected Ross 308 broilers

“-”表示未進(jìn)行

"-'means the project was not carried out

1.抗體效價(jià)大于396判為陽性；2.試驗(yàn)地點(diǎn)：無極縣順發(fā)蛋雞養(yǎng)殖專業(yè)合作社1.Antibody titers greater than 396 were considered positive; 2. Location: Shun Fa hens farming cooperatives in Wuji country圖1 蛋雞免疫后不同時(shí)間ELISA抗體效價(jià)測定結(jié)果Fig 1 ELISA antibody level in different time of injected layers

1.抗體效價(jià)大于396判為陽性；2.試驗(yàn)地點(diǎn)：新樂市梧桐林養(yǎng)殖場1.Antibody titer greater than 396 was considered positive; 2. Test site: Wu Tonglin Farm in Xinle country圖2 羅斯(Ross)308肉雞免疫后不同時(shí)間ELISA抗體效價(jià)測定結(jié)果Fig 2 ELISA antibody level in different time of injected Ross 308 broilers

2.2.2 免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 9日齡蛋雞免疫試驗(yàn)疫苗后14 日攻毒保護(hù)率為82%，28 日的攻毒保護(hù)率為98%，至90 日時(shí)攻毒保護(hù)率均仍為100%，而對照組病變率均大于80%；8日齡羅斯(Ross)308肉雞免疫試驗(yàn)疫苗后14 d、21 d、36 d分別用BC6-85株(1000個(gè)BID)攻毒，保護(hù)率分別為76%、100%、100%，對照組病變率分別為90%、100%、100%。結(jié)果見表4、表5。

2.3 對ND疫苗免疫應(yīng)答影響的試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 蛋雞的試驗(yàn)結(jié)果 蛋雞免疫IBD疫苗后不同時(shí)間，各免疫組之間的ND HI抗體水平與不免疫IBD疫苗的對照組相似，表明試驗(yàn)疫苗免疫后對ND疫苗的免疫效果沒有影響，結(jié)果見表6。

2.3.2 肉雞的試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)檢測，IBD疫苗免疫肉雞后不同時(shí)間，各免疫組之間的ND HI抗體水平與不免疫IBD疫苗的對照組相似，表明試驗(yàn)疫苗免疫后對ND疫苗的免疫效果沒有影響，結(jié)果見表7。

表4 農(nóng)大三號蛋雞免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of challenging agriculture university No 3. layers with BC6-85 strain

表5 羅斯(Ross)308肉雞免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of challenging Ross 308 broilers with BC6-85 strain

*每個(gè)試驗(yàn)組每次均從試驗(yàn)雞場取10只雞運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室攻毒，由于天氣炎熱，運(yùn)輸途中均有死亡，所以每次每組的實(shí)際攻毒雞數(shù)量少于10只

*10 chickens had been taken from the farm to the laboratory for the challenge test each time. Because of the hot weather, there were deaths during the transportation, so the number of actual challengeing chickens per group was less than 10

表6 蛋雞免疫后不同時(shí)間的ND HI抗體滴度*Tab 6 ND HI antibody titer of layers in different period after injected*

*蛋雞ND免疫程序：7日齡時(shí)免疫ND滅活疫苗和ND活疫苗，20日齡時(shí)ND活疫苗加強(qiáng)免疫一次，30日齡時(shí)ND滅活疫苗加強(qiáng)免疫一次

*ND immunization program for layers：immunization with ND inactivated vaccine at 7 days old； Booster immunization at 20 days old with ND vaccine，live；Booster immunization at 30 days old with inactivated ND vaccine

表7 肉雞免疫后不同時(shí)間的ND HI抗體滴度*Tab 7 ND HI antibody titer of broilers in different period after injected*

*肉雞ND免疫程序：6日齡時(shí)免疫ND滅活疫苗，同時(shí)免疫禽流感、新城疫重組二聯(lián)活疫苗，20日齡時(shí)用禽流感、新城疫重組二聯(lián)活疫苗加強(qiáng)免疫一次

*ND immunization program for broilers: immunization with ND inactivated vaccine at 6 days old, immunization with avian influenza and Newcastle disease recombinant vaccine, live; Booster immunization at 20 days old with avian influenza and Newcastle disease recombinant vaccine, live

3 討 論

3.1 安全性 新樂市梧桐林養(yǎng)殖場肉雞和無極縣順發(fā)蛋雞養(yǎng)殖專業(yè)合作社蛋雞采用推薦劑量和超劑量(10倍推薦劑量)接種后，均沒有觀察到任何因疫苗引起的不良反應(yīng)，所有雞接種后精神狀態(tài)、采食飲水等正常。超劑量接種組接種后14日剖檢法氏囊、肝臟、腎臟、脾臟、腺胃、肌胃、胸、腿和翼部肌肉，除法氏囊輕度萎縮外，其他器官均無肉眼可見病變。所有接種肉雞的增重與空白對照組無明顯差異，各免疫組之間的平均增重也無明顯差異。肉雞免疫后36 d(45 日齡上市)的總死淘率為2%，而試驗(yàn)雞場養(yǎng)殖的前一批肉雞的死淘率為2.5%，相比而言死淘率略有降低；蛋雞接種后90 d的總死淘率為0.3%，與該雞場上一批雞的死淘率相似。此試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)疫苗接種后對不同品種的雞是安全的。

3.2 免疫效果 帶有高水平母源抗體的蛋雞采用推薦劑量經(jīng)飲水或滴鼻點(diǎn)眼途徑一次接種后14 d，其平均攻毒保護(hù)率達(dá)82%，28 d的攻毒保護(hù)率為98%，免疫后90 d攻毒保護(hù)率仍達(dá)100%；除免疫后14 d的ELISA抗體水平較低外，28 d至90 d均維持較高水平，且無明顯下降趨勢，表明試驗(yàn)疫苗對蛋雞具有良好的免疫效果，且疫苗能突破較高母源抗體水平。帶有中等水平母源抗體的肉雞采用推薦劑量經(jīng)飲水途徑一次接種后14 d，其平均攻毒保護(hù)率為76%，21 d后的攻毒保護(hù)率為100%，免疫后36 d(上市前)也為100%；1/2推薦劑量經(jīng)飲水途徑一次接種后14 d和21 d，其攻毒保護(hù)率均為75%，免疫后36 d攻毒保護(hù)率也達(dá)100%。從攻毒保護(hù)率看，1/2推薦劑量免疫組略低于使用劑量組。免疫后14 d，201002和201003批疫苗的抗體水平顯著高于201001批及201002批1/2劑量免疫組，這可能與接種時(shí)的母源抗體水平不同相關(guān)。該試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)疫苗對肉雞具有良好的免疫效果。

3.3 免疫抑制 從臨床試驗(yàn)雞ND HI抗體檢測結(jié)果看，試驗(yàn)疫苗無論采用超劑量或使用劑量免疫后，對ND疫苗的免疫應(yīng)答均沒有產(chǎn)生明顯影響，表明疫苗免疫商品蛋雞或肉雞后，不會(huì)引起免疫抑制，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)疫苗臨床應(yīng)用的安全性。

4 結(jié) 論

由北京中海生物科技有限公司、石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、吉林和元生物工程有限公司、浙江正力安拓生物科技有限公司和哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司聯(lián)合研制的雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株+CA株+CF株)在臨床試驗(yàn)過程中，共監(jiān)測61000羽份疫苗的使用情況，剖檢雞只35只，均未發(fā)現(xiàn)因疫苗引起的全身或局部不良反應(yīng)。疫苗免疫后共抽檢免疫蛋雞血清樣品640份、肉雞血清樣品361份，陽性率達(dá)85.4%，在母源抗體水平較高的情況下，疫苗免疫后21 d攻毒保護(hù)水平均能達(dá)到80%以上。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)疫苗安全、有效、質(zhì)量可控，可以作為商品活疫苗推廣使用。

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[2] Rautenschlein S, Kraemer Ch, Vanmarcke J,etal. Protective efficacy of intermediate plus infectious bursal disease virus (IBDV) against very virulent IBDV in comercial broilers[J]. Avian Diseases, 2005, 49: 231-237.

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[4] 蔣桃珍，董琳琳，陳光華，等. 三種雞傳染性法氏囊病活疫苗免疫效力的比較研究[J]. 中國獸藥雜志，2001，35(1)：6-8.

Jiang T Z, Dong L L, Chen G H,etal. Comparison studies on efficacy of three live infectious bursal disease vaccines in SPF chicken [J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2001, 35(1): 6-8.

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People's Republic of China Veterinary Pharmacopoeia[S]. Third Volume, 2010 Edition.

(編輯：李文平)

Safety and Immune Effect Evaluation of Infectious Bursal Diesease Live Vaccine (Strain B87+Strain CA+Strain CF)

LI Run1,SUN Ye2, ZHAO Hong-ming3，LIANG Zhan-jun4，WANG Rong-shen3，JIANG Tao-zhen2

(1.BeijingZhonghaiBiotechCo.,Ltd,Beijing100081,China; 2.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China; 3.ShijiazhuangCenterForDiseaseControlandPrevention,Shijiazhuang050000,China； 4.WujiCountyAnimalHusbandryandVeterinaryBureau,Shijiazhuang052460,China)

By observing the growth and clinical symptoms of chickens after vaccine immunization, the ELISA antibody level, immune protection rate, and the HI antibody level of chickens after injection of ND vaccine in different periods were detected to evaluate the safety, immune effect, immune duration, and immunosuppression of clinical application of the IBD live vaccine (Strain B87+Strain CA+Strain CF) in Shijiazhuang area. The results showed that the experimental vaccines were safe to layer and broiler chickens as no adverse reaction from the vaccine injection had been observed. The rate of challenging protection were all above 80% for laying hens on day 14, 28, 42, 60 and 90 after immunization and the broiler chickens on day 14, 21 and 36 after immunization as well. The ELISA antibody level was still more than 6500 on the 90 days after immunization of commercial laying hens. According to the detection results of ND HI antibody, injection of the experiment vaccines made no significant effect on the response of the immunity of ND vaccine and did not cause any immunosuppression. The experimental vaccines were adapt to prevention of IBD for their safety, efficiency and stable quality.

IBD；vaccine；effect of immunity

石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(131200562A) 作者簡介： 李 潤，獸醫(yī)師，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail: 30095662@qq.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.6.01

2016-12-10

A

1002-1280 (2017) 06-0001-08

S858.2