王洪，羅惠波，2*，廖玉琴，鄧露，劉藺，羅廣

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000）

多糧生料釀酒工藝的研究

王洪1，羅惠波1，2*，廖玉琴1，鄧露1，劉藺1，羅廣1

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000）

以生料曲為糖化發(fā)酵劑，大米、玉米、高粱為原料混合發(fā)酵進(jìn)行生料酒的釀制。研究了發(fā)酵溫度、pH、水料比、加曲量對(duì)出酒率的影響。通過單因素和正交試驗(yàn)，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為大米∶玉米∶高粱=6∶1∶3，發(fā)酵溫度31℃，pH 5.5，水料比2.5∶1，加曲量1%，在此條件下，出酒率為75.0%（55°計(jì)）。

生料釀酒；多糧；工藝優(yōu)化；正交試驗(yàn)

生料釀酒技術(shù)的研究始于日本，由于種種原因發(fā)展緩慢，我國開始于20世紀(jì)70年代末，發(fā)展迅速，到80年代達(dá)到高潮。生料釀酒免去了傳統(tǒng)釀酒時(shí)對(duì)糧食和輔料的蒸煮、上甑、攤晾等繁瑣工序，并且因能節(jié)約能源、提高勞動(dòng)效率、提高出酒率、操作簡(jiǎn)單、可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)而受到國內(nèi)外釀酒企業(yè)的青睞。目前，生料釀酒工藝主要分為固態(tài)法和液態(tài)法，但液態(tài)法是主流形式[1]；用于生料釀酒的糧食來源廣泛，主要包括大米、玉米、高粱、小麥、紅薯等[2-5]，釀酒行業(yè)有“高粱釀酒香、玉米釀酒甜、小麥釀酒沖、大米釀酒凈、糯米釀酒濃”的說法；生料發(fā)酵技術(shù)不僅廣泛用于白酒、黃酒、清酒的生產(chǎn)[6]，而且也用于食醋、單細(xì)胞蛋白飼料、生料甜酒曲的制備[7-9]，蒸餾剩余酒糟因富含營養(yǎng)物質(zhì)也可回收利用作為飼料、釀醋等[10]；但由于生料酒香氣單一，口感單薄不協(xié)調(diào)，為大規(guī)模推廣帶來困難。目前大多數(shù)生料酒廠使用單一的糧食釀酒，由于其物質(zhì)營養(yǎng)成分單一，微生物代謝產(chǎn)物少，使得酒質(zhì)較差。本試驗(yàn)通過大米、玉米、高粱混合用于生料釀酒，以期提高酒香，使酒體口感醇和協(xié)調(diào)，并通過優(yōu)化其工藝，提高出酒率，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米、玉米、高粱：市售；生料曲：麗水力克生物科技有限公司；乙酸、乙酸鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

不同pH緩沖溶液的配制：參照國標(biāo)GB/T 603—2002《化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》配制，用pH計(jì)校正。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWYR-D2403型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；STARTER2100型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：奧豪斯儀器（上海）有限公司；800Y型多功能粉碎機(jī)：鉑歐五金廠；Alcomat Super酒精度測(cè)試儀：意大利蓋博分析儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糧食配比

大米粉碎過40目篩，玉米粉碎過60目篩，高粱粉碎過100目篩，將總糧為50 g的三種糧食的不同配比組合（大米∶玉米∶高粱，每種糧食至少要占一份，所占份額為整數(shù)，且三種糧食所占份額總和為10，如1∶1∶8，2∶1∶7等）加入三角瓶中，在水料比3∶1（mL∶g）、介質(zhì)pH4、加曲量0.7%、溫度30℃條件下?lián)u床發(fā)酵8 d，每天混勻（170 r/min，15 s）3次，測(cè)定最終出酒率，并篩選出酒率最高的一組糧食配比，用于后面的發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3.2 多糧生料釀酒的單因素試驗(yàn)

將50g總糧加入三角瓶中，控制發(fā)酵溫度30℃，加曲量0.7%，水料比3∶1，在pH值分別為3、4、5、6、7條件下?lián)u床發(fā)酵8 d，每天混勻（170 r/min、15 s）3次（下同），得到出酒率的變化情況；控制加曲量0.7%，pH4，水料比3∶1，在發(fā)酵溫度為28℃、30℃、32℃、34℃、36℃條件下發(fā)酵8 d，得到出酒率的變化情況；控制水料比3∶1，pH4，溫度30℃，在加曲量分別為0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%條件下發(fā)酵8 d，得到出酒率的變化情況；控制發(fā)酵溫度30℃，pH4，加曲量0.7%，在水料比為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1條件下發(fā)酵8 d，得到出酒率的變化情況。

1.3.3 多糧生料釀酒工藝的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得到發(fā)酵溫度、加曲量、pH、水料比與出酒率的關(guān)系，每天搖床混勻（170 r/min、15 s）3次，發(fā)酵8 d。采用4因素4水平的正交試驗(yàn)，以出酒率為指標(biāo)，以期得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)的因素和水平見表1。

表1 多糧生料釀酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of liquor-making with uncooked multiple-grains

1.3.4 測(cè)定方法

醪液酒精度的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[11]的方法測(cè)定；發(fā)酵液pH的測(cè)定：pH計(jì)測(cè)定。原料出酒率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 糧食的最佳配比

糧食是微生物主要的碳源、氮源、營養(yǎng)源等物質(zhì)來源，提供微生物生長、繁殖、代謝所需。不同種類糧食的淀粉、微量元素等含量不同，最終導(dǎo)致出酒率也不一樣。不同糧食配比的出酒率如圖1所示。

由圖1可知，隨著混合糧食中大米比例的增加，出酒率也隨著增加，當(dāng)?shù)竭_(dá)最高點(diǎn)后又緩慢下降，當(dāng)配比為大米∶玉米∶高粱=6∶2∶2時(shí)出酒率最高為71.7%；在大米份額相同時(shí)隨著高粱份額的減少，出酒率有增大的趨勢(shì)，說明高粱在微環(huán)境中對(duì)微生物代謝有一定負(fù)影響，可能是高粱殼中色素和單寧對(duì)微生物有一定的抑制作用；但在配比為6∶2∶2時(shí)所得酒生玉米味過重，影響了整體感官，所以取出酒率次高的糧食組合，此時(shí)出酒率為71.6%，配比為6∶1∶3，此時(shí)糧香優(yōu)雅，口感舒適。因此以大米∶玉米∶高粱=6∶1∶3進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 糧食配比對(duì)出酒率的影響Fig.1 Effect of grains ratio on liquor yield

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 介質(zhì)pH對(duì)出酒率的影響

介質(zhì)pH影響糖化酶酶解效率和酵母菌的代謝，發(fā)酵體系中適合的pH環(huán)境能較好的平衡糖化、酒化、酯化等生化反應(yīng)，使得生料酒香氣濃郁，口感協(xié)調(diào)，出酒率高。介質(zhì)pH對(duì)出酒率的影響如圖2所示。

圖2 介質(zhì)pH對(duì)出酒率的影響Fig.2 Effect of pH on liquor yield

由圖2可知，出酒率在pH為3～5時(shí)，隨著pH值的增大而增加，且增加顯著（P＜0.05），在pH值為5時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)出酒率為71.2%；當(dāng)pH＞5時(shí)，出酒率隨著pH值的增加而緩慢降低，最低點(diǎn)出酒率為68.6%；因此選擇最佳pH值為5。不同于先前研究者[3]得到的最佳pH值為4，可能是由于本試驗(yàn)用的生料曲不同，該曲中的糖化酶能在pH=5時(shí)也能和其他酶系和酵母菌有較好的協(xié)同作用；并且發(fā)酵底物為混合糧食，不同于單一的糧食發(fā)酵，混糧可為酵母菌提供更為豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及前體物質(zhì)，有助于酵母的生長、代謝；若生料釀酒能在相對(duì)高的pH環(huán)境下進(jìn)行，將更容易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，因?yàn)檫@樣可以減少發(fā)酵罐的酸腐蝕損失，但為了防止發(fā)酵過程中雜菌污染可在發(fā)酵前期添加一定量的抑菌劑[12]。

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)出酒率的影響

發(fā)酵溫度對(duì)酵母的影響較大，適宜的發(fā)酵溫度能提高酵母的代謝能力，提高出酒率和增加酯類物質(zhì)的含量；發(fā)酵溫度對(duì)出酒率的影響如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)出酒率的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on liquor yield

由圖3可知，出酒率在發(fā)酵溫度為28～30℃時(shí)，隨著溫度的升高而顯著增加（P＜0.05），到達(dá)30℃時(shí)取得最大值，出酒率為71.4%，當(dāng)發(fā)酵溫度高于30℃時(shí)，出酒率隨著發(fā)酵溫度的增加而減少，且在32～34℃時(shí)差異不顯著，但當(dāng)溫度高于34℃時(shí)出酒率顯著下降（P＞0.05），說明此時(shí)已經(jīng)開始不適合酵母菌的代謝生長；因此選擇最佳發(fā)酵溫度為30℃。醪液的顏色也隨著發(fā)酵溫度的升高逐漸加深，可能是高粱殼中的色素和單寧大量的溶于發(fā)酵液中[13]，一定量的單寧和色素能抑制酵母的生長，這也是酵母菌不適合生長代謝的原因之一。

2.2.3 加曲量對(duì)出酒率的影響

加曲量的多少可以改變發(fā)酵速度和效率，在一定范圍內(nèi)，隨著曲量的增加發(fā)酵速度和出酒率也相應(yīng)提升；加曲量對(duì)出酒率的影響如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)加曲量為0.5%～0.9%時(shí)，出酒率隨著加曲量的增大而顯著增加（P＜0.05），這是因?yàn)楫?dāng)加曲量很少時(shí)，發(fā)酵體系中的酶系和酵母濃度小，不能充分糖化底物發(fā)酵產(chǎn)乙醇，致使出酒率低。當(dāng)加曲量為0.9%時(shí)達(dá)到最大值為71.3%，當(dāng)加曲量＞0.9%時(shí)，出酒率隨著加曲量的增大而顯著減小，這是因?yàn)榍考哟蠛?，高濃度的酶吸附在淀粉顆粒上會(huì)改變其分子結(jié)構(gòu)，使后續(xù)利用困難，最終導(dǎo)致出酒率下降。因此選擇最佳加曲量為0.9%。

圖4 加曲量對(duì)出酒率的影響Fig.4 Effect of starter addition on liquor yield

2.2.4 水料比對(duì)出酒率的影響

水料比決定著發(fā)酵液中淀粉的濃度，對(duì)出酒率也有一定的影響。水料比對(duì)出酒率的影響如圖5所示。

圖5 水料比對(duì)出酒率的影響Fig.5 Effect of water-material ratio on liquor yield

由圖5可知，當(dāng)水料比為2∶1～3∶1時(shí)，出酒率隨著水料比的增大而顯著增加（P＜0.05），當(dāng)水料比為時(shí)3∶1時(shí)達(dá)到最佳出酒率，為72.1%。但當(dāng)水料比＞3∶1時(shí)，出酒率隨著水料比的增大而急劇減少，當(dāng)水料比為6∶1時(shí)出酒率達(dá)到最低為65.5%。因此選擇最佳水料比為3∶1。在先前的一些研究中，生料釀酒水料比一般為3∶1，但根據(jù)糧食種類、糧食粒度、發(fā)酵工藝不同，會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的水料比的不同[14-16]。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以加曲量、pH、水料比、溫度為因素，以出酒率為考察指標(biāo)，進(jìn)行4因素4水平正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2可知，正交試驗(yàn)所得出酒率最高的最佳組合為A4B4C1D3E2，此時(shí)出酒率為74.1%，而從加曲量、pH、水料比、溫度這4個(gè)因素的平均出酒率可得優(yōu)化組合為A4B4C1D3E3，通過試驗(yàn)得到其出酒率為75.0%，即最優(yōu)組合為加曲量1%，pH5.5，水料比2.5∶1，溫度31℃；由各因素的極差可知，對(duì)出酒率的影響大小為水料比＞pH＞加曲量＞發(fā)酵溫度。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，水料比（2.5∶1～4∶1）對(duì)出酒率影響極顯著（P＜0.01），說明水料比比其他3個(gè)因素對(duì)出酒率影響更大，發(fā)酵溫度（29～32℃）對(duì)出酒率的影響不顯著（P＞0.05），加曲量和pH對(duì)出酒率影響顯著（0.01＜P＜0.05）。由此可知，在多糧生料釀酒中應(yīng)多關(guān)注水料比，但也不能忽略其他因素的影響，只有協(xié)調(diào)好4個(gè)因素才能得到好品質(zhì)的酒和較高的出酒率。

3 結(jié)論

生料釀酒具有廣闊的前景，其中多糧混合發(fā)酵為提高酒的風(fēng)味和出酒率提供了一條思路，通過正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度31℃，pH5.5，水料比2.5∶1，加曲量1%，在此條件下出酒率為75.0%。此優(yōu)化條件下更容易進(jìn)行高密度的工業(yè)化生產(chǎn)，提高出酒率，且能減少發(fā)酵罐的酸腐蝕損失，延長使用壽命，節(jié)約成本；若能像啤酒那樣進(jìn)行全機(jī)械化全控發(fā)酵，將會(huì)得到品質(zhì)更穩(wěn)定，成本更低的生料酒。但由于發(fā)酵環(huán)境pH較高，要嚴(yán)格控制雜菌的污染。

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Research on the liquor-making technology with uncooked multiple-grains

WANG Hong1,LUO Huibo1,2*,LIAO Yuqin1,DENG Lu1,LIU Lin1,LUO Guang1
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China; 2.Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Zigong 643000,China)

UsingQumade by uncooked materials as saccharification and fermentation starter,Baijiuwas produced with the uncooked materials of rice,corn and sorghum.The effects of fermentation temperature,pH,water-material ratio and starter addition on liquor yield were researched.By single factor and orthogonal tests the optimum technology parameters were obtained as followed:rice∶corn∶sorghum 6∶1∶3,fermentation temperature 31℃, pH 5.5,water-material ratio 2.5∶1,starter addition 1%.Under the conditions,liquor yield was 75.0%(55°).

liquor-making with uncooked materials;multiple-grains;technology optimization;orthogonal test

TS261.4

0254-5071（2017）06-0038-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.008

2017-02-16

四川理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（y2016003）

王洪（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)獒劸粕锛夹g(shù)及應(yīng)用。

*通訊作者：羅惠波（1969-），男，教授，碩士，研究方向?yàn)獒劸粕锛夹g(shù)及應(yīng)用。